磁気ピンセットを用いた多重化単分子フォースタンパク質分解測定
Summary
この記事では、高度に並列化可能な方法で単一分子レベルでのタンパク質分解酵素に作用する力の影響を研究するために磁気ピンセットの使用方法について説明します。
Abstract
機械的な力の生成と検出は、癌転移1、アテローム2、治癒3を巻きに直接関連して、細胞生理学のユビキタスな側面です。これらの各例では、細胞はその周囲に力を発揮すると同時に、酵素的に細胞外マトリックス（ECM）を改造両方。 ECMでの力の影響は、このように4月7日 、その可能性が高い生物学的および医学的重要性のためにかなりの関心のある分野となっています。
このような光トラッピング8、原子間力顕微鏡9、磁気ピンセット10,11として単一分子技術は、研究者が個々のタンパク質に力を発揮することによって分子レベルでの酵素の機能を調べることができます。これらの技術のうち、磁気ピンセット（MT）は、低コスト、高スループットが特徴です。 MTは、1から100〜PNの範囲内で力を発揮し、ミリ秒の時間分解能を提供することができますよく単一分子レベル12で酵素機構の研究に一致している資質。ここでは、単一のタンパク質分子のタンパク質分解に力の影響を検討するための、高度な並列化MTアッセイを報告します。我々は、マトリックスメタロプロテアーゼ1（MMP-1）による三量体のコラーゲンペプチドのタンパク質分解の具体例を提示しますが、このアッセイは、簡単に他の基質とプロテアーゼを研究するために適応させることができます。
Protocol
1。フローセルの準備カバーガラス（＃1.5、22×22 mmと22×40ミリメートル、VWR）は超音波を使用して掃除されています。 カバースリップを保持する（ステップ2を参照）超音波に嵌合可能な小さなガラスの容器にカバースリップを追加します。 イソプロパノールで容器を満たし、20分間超音波浴で超音波洗浄します。 イソプロパノールを破棄してBarnstedミリQ装置または?…
Discussion
このプロトコルは、古典的な単一分子技術の新しい使用方法を説明します。磁気ピンセットは、コスト効率の高い方法で高スループットの単一分子アッセイの培地ができます。ただし、すべての実験手法と同様の課題や潜在的な落とし穴があります。
磁気ピンセットの制限事項
光学トラップに比べてMT装置の空間分解能と時間分解能が低い。また、こ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、科学的インタフェース（ARD）、NIHのディレクターの新イノベーター賞プログラムを通じて国立衛生研究所（NIH）1-DP2-OD007078（ARD）、ウィリアム·ボウズ·ジュニアスタンフォード大学フェローシップ（ASAでバローズウェルカムキャリア賞によってサポートされていました）と、スタンフォード大学心臓血管研究所ヤンガー博士号を取得する前のフェローシップ（JC）。著者らは、顕微鏡検査機器を貸し出し用にジェームズSpudichに感謝します。
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number |
| Micro Cover Glass #1.5 (22×22) | VWR | 48366-067 |
| Micro Cover Glass #1.5 (22×40) | VWR | 48393-048 |
| Lambda DNA | Invitrogen | 25250-010 |
| T4 DNA Ligase | Invitrogen | 15224-041 |
| Microcon Ultracel YM-100 | Millipore | 42413 |
| Anti-Digoxigenin | Roche Diagnostics | 11-333-089-001 |
| Tween 20 | Sigma | P9416-100ML |
| Anti-myc Antibody | Invitrogen | 46-0603 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | B4287-5G |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 658.01D |
| Dynabeads MyOne T1 Streptavidin | Invitrogen | 658.01D |
| p-Aminophenylmercuric Acetate | Calbiochem | 164610 |
| Biotin-Maleimide | Sigma Aldrich | B1267 |
| Biotin labeled oligo | IDT DNA | Custom synthesis |
| Digoxigenin labeled oligo | IDT DNA | Custom synthesis |
| Collagen peptide gene | DNA 2.0 | Custom synthesis |
| MMP-1 cDNA | Harvard Plasmid Database | |
| z-translator | Thorlabs | MTS50 |
| Servo controller for translator | Thorlabs | TDC001 |
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Cite This Article
Adhikari, A. S., Chai, J., Dunn, A. R. Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers. J. Vis. Exp. (65), e3520, doi:10.3791/3520 (2012).