Summary
この記事では、高度に並列化可能な方法で単一分子レベルでのタンパク質分解酵素に作用する力の影響を研究するために磁気ピンセットの使用方法について説明します。
Abstract
機械的な力の生成と検出は、癌転移1、アテローム2、治癒3を巻きに直接関連して、細胞生理学のユビキタスな側面です。これらの各例では、細胞はその周囲に力を発揮すると同時に、酵素的に細胞外マトリックス（ECM）を改造両方。 ECMでの力の影響は、このように4月7日 、その可能性が高い生物学的および医学的重要性のためにかなりの関心のある分野となっています。
このような光トラッピング8、原子間力顕微鏡9、磁気ピンセット10,11として単一分子技術は、研究者が個々のタンパク質に力を発揮することによって分子レベルでの酵素の機能を調べることができます。これらの技術のうち、磁気ピンセット（MT）は、低コスト、高スループットが特徴です。 MTは、1から100〜PNの範囲内で力を発揮し、ミリ秒の時間分解能を提供することができますよく単一分子レベル12で酵素機構の研究に一致している資質。ここでは、単一のタンパク質分子のタンパク質分解に力の影響を検討するための、高度な並列化MTアッセイを報告します。我々は、マトリックスメタロプロテアーゼ1（MMP-1）による三量体のコラーゲンペプチドのタンパク質分解の具体例を提示しますが、このアッセイは、簡単に他の基質とプロテアーゼを研究するために適応させることができます。
Protocol
1。フローセルの準備
- カバーガラス（＃1.5、22x22 mmと22x40ミリメートル、VWR）は超音波を使用して掃除されています。
- カバースリップを保持する（ステップ2を参照）超音波に嵌合可能な小さなガラスの容器にカバースリップを追加します。
- イソプロパノールで容器を満たし、20分間超音波浴で超音波洗浄します。
- イソプロパノールを破棄してBarnstedミリQ装置または類似のデバイスによって生成された脱イオン水のおびただしい量でカバースリップをすすいでください。水で容器を満たし、20分間超音波洗浄します。
- 超音波処理した後、濾過し、埃のない空気の流れにカバースリップを乾燥させます。 （すなわち、汚れ）きれいに見える唯一のカバースリップを使用しています。
- 静かに炎が数秒間カバースリップは、残っているほこりや湿気からそれらをきれいにする：過剰な熱のためにカバースリップをワープしないように注意しながら、ブンゼンバーナーで生成ガスの炎を介してカバースリップを渡します。このステップでは、残留表面を削除します汚染物質。
- 両面スコッチテープを使用して、2つのカバースリップを添付してください。テープカット〜長さ3センチ、幅0.3センチメートル。真ん中の1.6 cmのチャネルを残して22x40 mmのカバースリップ上のテープを取り付けます。穏やかにテープが正しく付いていることを確認するためにカバースリップを下に押すようにピペットチップを使用しています。
2。磁気ピンセットのセットアップとキャリブレーション
- 磁気ピンセットは、以前に10,12説明したように永久的な希土類磁石を使用してセットアップした。アルミL型ブラケットは1 mm径のピンホールを使って構築および垂直方向のz変換（Thorlabs）ピンセットの高さを調節するために装着した。 2つの永久希土類磁石は、磁気トラップ（ 図1）を作成するためのピンホールの両側にブラケットに取り付けた。
- DNAの調製：その5 'および3'末端標識したラムダファージからのDNAをビオチンとジゴキシゲニン（IDT DNA、サンディエゴ、CA）の端部が眼のキャリブレーションをするために使用されたneticピンセット。
- 60〜40 nMのビオチンコンジュゲートオリゴヌクレオチドと熱の2μL℃で10分間で4 nMでλ-DNA50μLを混合します。 1時間かけて室温でゆっくりとクール。
- 製造元の仕様に従って、DNAリガーゼを追加し、3時間室温でライゲーション。
- 45分間室温で400nmのジゴキシゲニン共役オリゴヌクレオチドとインキュベート2μLを追加します。
- 10mMのATPの1.5μLを追加し、3時間λ-DNAをジゴキシゲニン共役オリゴヌクレオチドのライゲーションを続行します。
- 100 kDaのスピンフィルタ（マイクロコンUltraCellはYM-100）を使用して、過剰なオリゴヌクレオチドおよびDNAリガーゼを削除します。 TEバッファーで1000倍のバッファー交換の合計は、過剰なオリゴヌクレオチドを除去するために十分である。注：DNAの剪断につながるので、スピン速度> 500xGを使用しないことが重要です。
- そのDNA I確保するために0.7％アガロースゲル上で電気泳動によるDNAのサンプルを調べるsは変性またはせん断はありません。
- DNAの濃度を測定します。使用可能なサンプル量が非常に小さい可能性があるため、光度計紫外 - 可視分光光度計（サーモフィッシャーサイエンティフィック）の使用が推奨されます。
- セクション1で説明したようにフローセルを準備します。
- フローセルへのDNAの結合のための、抗ジゴキシゲニン抗体（ヒツジIgG、1μgの添加-1;バイオロシュ、マンハイム、ドイツ）を追加し、それが15分間ガラス表面に付着することができます。
- 1X PBSで2ミリグラムmL -1の BSA、0.1％Tween-20を追加することにより、DNAの非特異的付着を防止するために、フローセルの表面を不動態化。 45分間室温でインキュベートします。
- 手順2.5を繰り返します。
- fuctionalizedλ-DNAの50 pmを追加し、15分間カバースリップにアタッチすることができます。
- 1X PBSで過剰なDNAを洗い流す。
- = 20μgのmL -1のは 2.8μmのビーズを、ストレプトアビジン被覆常磁性ビーズ（1μmのビーズ=2μgのmL -1の追加
- 1X PBSで過剰なビーズを洗い流す。
- 磁気ピンセットのキャリブレーション
- 遠く離れて試料表面から（> 15 mm）である位置に永久磁石を移動します。
- 顕微鏡で準備されたフローセルを配置します。
- フローセル上の位置に永久磁石を移動します。
- 離れてガラス面の両方からビーズに焦点を当ててλ-DNAの官能ビーズの焦点面を選択します。正しい焦点面は、所望のビーズが明るい中心を持っているものである。
- 500フレームの場合、80 Hz以上ではビーズの動きのビデオを取る。
- 近い試料表面に磁石を移動します。 5ミリメートルを超えた距離については、1ミリメートル単位で移動します。 1〜5ミリメートルの間の距離については、0.5ミリメートル単位で移動します。 1ミリメートル未満の距離で、0.25ミリメートル単位で移動します。
- それぞれの新しい磁石の位置にステップ2.11.5と2.11.6を繰り返します。
- 各データの2Dガウスフィットを用いてビーズの中心を追跡し、設定します。
- を使用してブラウンの変動を介して力を計算します。
K B Tはボルツマンの熱エネルギーである、Lは λ-DNAの長さであり、<x 2>重心位置の分散である。- ロールオフ周波数を見つけるために、パワースペクトルローレンツフィットを介して力の計算をチェックすることによって、力の精度を確認してください。応用力の関係でロールオフ周波数に関連しています。
ƒ0がロールオフ周波数である、ビーズの半径であり、μは流体の粘度は12です。
3。フローセルにコラーゲンペプチドアタッチメント
私たちの方法論を適用するための具体的な例を提供するために、我々は三量体コラーゲンモデルペプチドのタンパク質分解の特徴を我々の研究室における最近の研究について説明します。我々は、この一般的なアプローチが広く、他のタンパク質およびポリヌクレオチドに適用することができることを期待しています。
- コラーゲンモデルペプチド三重らせん形成を強制するために5倍のmycタグ、（GPP）10、続いて精製するためのN末端6X Hisタグ、フォームコラーゲンα1残基772から786（GPQGIAGQRGVVGL）、MMPを構成されてい1認識部位、foldonシーケンス（GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL）、およびビオチン-マレイミドでラベルを容易にするために、C末端KKCK。 Foldonは、T4ファージのタンパク質fibritinから派生し、Nのいずれかで融合させたときにコラーゲンモデルトリマーを安定化させる-またはC末端13,14。
- 以前は4,15説明したようにコラーゲンペプチドおよびMMP-1蛋白質を発現させ、精製した。</ LI>
- 抗-mycフローセルの表面にアタッチできるように室温で20分間フローセルとインキュベートする（15μgのmL -1）を抗-mycを追加します。
- ステップ2.5で説明したのと同じ方法で、5 mgのmL -1の BSAを用いたタンパク質の非特異的付着を防ぐために、フローセルを不動態化する。
- 150 PMのコラーゲンペプチドを追加し、45分間mycタグを介して抗体に添付することができます。
- PBS緩衝液を用いて過剰なコラーゲンを洗い流す。
- ストレプトアビジン被覆常磁性ビーズ（1μmのビーズ=2μgのmL -1の 2.8μmのビーズ= 20μgのmL -1）を追加し、それらを45分間コラーゲン分子にアタッチすることができます。 1μmのビーズをPBSで所望の濃度に希釈する必要があります。 3μmのビーズをPBSでresolubilized強力な磁石を使用して、溶液から分離する必要があります。このプロセスを3回繰り返す必要があります。我々は、このステップは、GEにとって不可欠であることに気づいたT 3μmのビーズは、表面固定化コラーゲンペプチドに結合する。
4。力のタンパク質分解アッセイ
- 一度フローセルは、低〜1 pNの力の下で磁気トラップ内のイメージフローセルは、コラーゲンペプチド、磁気ビーズで組み立てられています。我々の経験では、ビーズの集団は、しばしば弱く、非特定の方法で表面に付着されています。ささやかな力のアプリケーションは、これらのビーズは解放であることを保証します。
- フローセルに活性化酵素を追加します。このケースではMMP-1は3.5 mMのAPMA（4 - aminophenylmercuricアセテート）を追加することによって、事前に活性化され、3時間37℃でインキュベートした。活性化は、SDS-PAGEを用いて検証した。
- フローセルは、磁気ピンセット装置に再導入されているとすぐに、通常は数百添付のビーズをもたらして、ビューのいくつかのフィールドにまたがるビデオを記録します。これは 、t = 0になります。
- tを返すときにビュー（のいくつかのフィールドを記録するのと同じプロセスを繰り返します。、定期的な時点で）ビューの同じフィールドをoすべてのビーズは切り離すまでまたはそれ以上のタンパク質分解は、識別可能ではありません。
- キネティック·データ解析
- 異なる時点でのビューの様々な分野でビーズをカウントし、それらを平均。 t = 0でのビーズの数によって各時点でビーズの平均数を割ることによってビーズの数を正規化します。ビーズの絶対数は、実験に実験とは異なりますので、これは、我々は別の実験からタンパク質分解の速度を比較することができるようになります。
- 時間の関数としての比をプロットします。このケースでは、指数関数的減衰に加えて定数にそれを装着。
f（t）は （またはコラーゲン分子がunproteolyzed）を添付したビーズの比であるここで、tは時間であり、コラーゲンのテザーによって結合ビーズの割合で、bは減衰率は一定であり、c非特異的に接続されているビーズの割合です。- 同じ実験はMMP-1によるコラーゲンのタンパク質分解に力の効果を明らかにする力とMMP-1濃度を変化させることで繰り返されます。
5。代表的な結果
上記のプロトコルは、酵素のタンパク質分解に力の効果を研究するための磁気ピンセット（ 図1）の新たな使用方法について説明します。我々は、観測されたブラウン運動の変動の大きさと様々な磁石の位置（ 図2）でロールオフ周波数の計算の両方を使用して、1μmと3μmのビーズ用ピンセットを校正されています。力のタンパク質分解実験では、セットアップでは、DNAはコラーゲン（ 図3、図4）に置き換えられていることを除いて似ています。残りのビーズの正規化数は、タンパク質分解率（ 図5）を見つけるために時間の関数としてプロットすることができ、このプロセスはすることができます酵素濃度と力を変化させるために繰り返されます。
図1磁気トラップのキャリブレーションプロセスの模式図（スケールしないように）。 2つの永久希土類磁石は、超常磁性ビーズを引っ張る磁場を作成します。上下に磁石を翻訳することに加わる力を調整します。ビーズは、二つの磁石の間にピンホールを通過した光で、従来の明視野顕微鏡を用いて画像化されている挿入図 ：40倍空気の目的で撮影した画像。シャープ、丸いスポットはカバースリップの表面に付着したビーズに対応しています。アウト·オブ·フォーカスオブジェクトがデタッチされたビーズです。
図2は1μm（ 左 ）および2.8ミクロン（ 右 ）ビーズのために試料表面から磁石の距離の関数としてのキャリブレーション力のプロットだ。データは、経験的関数に適合させた
ここで、x は、磁石からの距離です。= 31.8、B = 5.61、cは1μmのビーズとのために= 4.39 = 140、B 3μmのビーズ= 3.10とc = 1.86。これらの値は、私たちの特定の測定器と実験的幾何学に固有であり、各楽器を個別に校正する必要があります。各ポイントでのエラーバーは、ビーズの大きさのばらつきに起因するビーズ基礎にビーズ上に印加される力の約10％の変動を表しています。加えられた力は、ビーズの体積に比例し、ビーズ量は（メーカーの仕様に応じて）平均以上〜9％に変化します。
図3。フォースタンパク質分解アッセイのセットアップ（実寸ではありません ）。コラーゲンモデル三量体は 、mを介してカバースリップの表面に取り付けられているYC /抗-myc共役。ストレプトアビジン被覆常磁性ビーズは、ビオチン - ストレプトアビジン結合を介してコラーゲントリマーに取り付けられている。活性化MMP-1カット時間の経過とともにコラーゲン、ビーズ表面からデタッチし、焦点面から離れて移動させる。
図4：時間の関数としてのタンパク質分解の模式図漫画。タンパク質分解が発生すると漫画は、時間の経過ビューのサンプルフィールドを示しています。時間が経つにつれて、MMP-1カットコラーゲンとビーズがデタッチと磁場の影響下で焦点面から離れて移動します。
図5。タンパク質分解率が適用された力16に依存しています。 6.2 PN（3μMのMMP-1、 赤 ）および13 PN（0.2μMのMMP-1、 メイジ 、1.0 PN（ ブラック 3μMのMMP-1）で収集したデータも示されNTA）。タンパク質分解の速度（フィットパラメータ）は次のとおりです。0.22±0.02分-1（1 PN）、0.46±0.09分-1（6.2 PN）、および2.08±0.18分-1（13 PN）。長い時間のポイント（> 15分）unproteolyzedビーズの割合は、異なる実験間で〜0.25でほぼ一定のままです。エラーバーは、各時点で観測値の数を反映したポアソン統計に対応しています。 n個のビーズの各時点でのエラーは 、n 1/2である。接続されているビーズの割合で発生したエラーは、エラーpropagation.1μmのビーズが1.0 pNで、6.2 pNの実験に使用した、2.8μmのビーズが13 pNの実験に用いたことにより算出した。
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Discussion
このプロトコルは、古典的な単一分子技術の新しい使用方法を説明します。磁気ピンセットは、コスト効率の高い方法で高スループットの単一分子アッセイの培地ができます。ただし、すべての実験手法と同様の課題や潜在的な落とし穴があります。
磁気ピンセットの制限事項
光学トラップに比べてMT装置の空間分解能と時間分解能が低い。また、ここで説明したシンプルなMTによって生成された力は、日常的にAFM実験でアクセスの力を大幅に下回る30 PNまたは以下である。この制限は、美徳であることができます：MTはよく、サブpNの力を適用するために適しています。
そのようなここ装置などの光学トラップやAFM、従来のMTとは異なり、個々の粒子の操作を許可されていません。光トラップは通常、MTは垂直引っ張り実験のために最高に適している一方で、カバースリップに平行に力を適用するために使用されています。 ElectromagneチックMTが増加し複雑さのコストであるが、これらの制限に対処します。
ピンセットキャリブレーション
力校正のためのブラウンの変動とパワースペクトル解析の両方がそれらの制限があります。私たちは、ブラウン変動法はカメラブラーに特に敏感であることがわかった。フレームレートが増加するにつれて（露光時間は減少）を計算力が減少した。ブラウンの変動から計算力が10％以内にパワースペクトルを用いて算出勢力と合意するまで、実際には、我々は、フレームレートを増加させた。逆に、パワースペクトル解析は、カメラのブレに対してより堅牢ですが、実装することが少し難しくなります。我々は、結果の頑健性を確認するために、両方の計算を実行することをお勧めします。
我々は、ビーズのサイズと約10％の適用力の変化で磁性粒子含有量の結果でその変化を注意してください。この効果は、我々の最近の実験である重要ではありませんでした各測定のビーズの数百以上我々は平均的な原因となります。ただし、各係留ビーズからユニークな情報を抽出する実験では、潜在的に、より正確なキャリブレーションの方法が必要となります。
一点の添付ファイルを確保するためのコントロール
特定の、指向、シングルポイントの添付ファイルを達成することはしばしば単一分子の研究で実用的な課題となっています。以下のコントロールは、抗体へのコラーゲンの特定の添付ファイルを確認し、コラーゲンのビーズ：
- BSAで不動態化フローセルにのみビーズを追加しました。
- 抗-myc、BSAで不動態化して、追加されたビーズを追加しました。
- BSAで不動態化、 抗 myc追加された、非ビオチン化コラーゲン、その後追加されたビーズを追加しました。
- BSAで不動態化、非ビオチン化コラーゲン、その後追加されたビーズを追加しました。
- BSAで不動態化、ビオチン化したコラーゲンとを添加し、ビーズを追加しました。
- BSAで不動態化、 抗 myc追加された、ビオチンが追加されましたylatedコラーゲン、その後追加されたビーズ。
のケースでは0から4ビーズのどこからでも添付ファイルシリーズの一部のコンポーネントが故意に省略された1-5、ビューのフィールドごとにフローセル（80,000μmの2）に接続されている見られた。のみすべての添付ファイル部分が存在する場合は6に、我々は30から60〜2.8μmのビーズと表面に付着した80から2001μmのビーズを見た。タンパク質分解の速度は十分に単一の指数関数に加えて強くステップを制限する唯一の速度、したがって、単一のテザーがあることを示唆している定数項によって、適している観察した。定数項は、おそらく非特異的にカバースリップに接続されているビーズを反映しています。
我々は実験のために働いた抗体やタンパク質の濃度を報告します。新しいアッセイを開発する際に、各成分の濃度の広い範囲を検討する必要があります。 BSAは、我々の実験では表面パッシベーション剤としてうまくいった。しかし、これが満たされHODは、すべての状況では動作しない場合があります。表面パッシベーションのための他のプロトコルも成功を収めて使用されている。例としては、ポリエチレングリコール官能スライドガラス17、ブロッキング剤などのサポートされている脂質二重膜18、またはカゼインが含まれています。
データ分析上の注意
相互作用-力タンパク質分解実験では、非共有結合（ストレプトアビジンなどのビオチン）の解離に起因するいくつかの非特異的な剥離（特により高い力19で）常にある。我々はAdhikariらに記載されませんMMP-1、含まない様々なMMP-1濃度でタンパク質分解を測定することにより、この現象を占めています。らすべての力のための様々なMMP-1濃度でタンパク質分解を測定する私たちは、酵素の猫 / K M K触媒効率を計算するために使用されるミカエリス-メンテンの曲線を生成することができます。酵素の種々の濃度が使用されていない場合、代わりにことをお勧めしコントロールの測定は、非特定の剥離率をオフに減算する与えられた力で、酵素なしで行われる。
潜在的なアプリケーション
磁気ピンセットは、広い荷重範囲をカバーしています。発揮することができる力は、ビーズの大きさに依存します。 1μmと2.8μmのビーズは、中間の力でビーズのいずれかを使用して、アクセス可能な力で、我々の経験に重なってうまく動作します。
我々は、同様の実験的アプローチが21との結合相互作用22を展開、力依存性タンパク質分解4,20を研究する上で広範囲に適用できる可能性があることを期待しています。我々や他の23は、フォーカスのビーズのうちの回折リングの半径はカバースリップ23にビーズの相対的な位置を追跡するための敏感な手段を提供することを指摘している。一般的にこのような方法で使用されていないが、我々はMTアッセイは、ナノメートル精度の測定を提供する能力を持っていると信じているタンパク質構造力学のurements。この追加情報は力依存性蛋白質分解または結合の測定値のコンテキストで特に有用かもしれません。
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Disclosures
利害の衝突が宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、科学的インタフェース（ARD）、NIHのディレクターの新イノベーター賞プログラムを通じて国立衛生研究所（NIH）1-DP2-OD007078（ARD）、ウィリアム·ボウズ·ジュニアスタンフォード大学フェローシップ（ASAでバローズウェルカムキャリア賞によってサポートされていました）と、スタンフォード大学心臓血管研究所ヤンガー博士号を取得する前のフェローシップ（JC）。著者らは、顕微鏡検査機器を貸し出し用にジェームズSpudichに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro Cover Glass #1.5 (22x22) | VWR | 48366-067 | |
| Micro Cover Glass #1.5 (22x40) | VWR | 48393-048 | |
| Lambda DNA | Invitrogen | 25250-010 | |
| T4 DNA Ligase | Invitrogen | 15224-041 | |
| Microcon Ultracel YM-100 | Millipore | 42413 | |
| Anti-Digoxigenin | Roche Diagnostics | 11-333-089-001 | |
| Tween 20 | Sigma | P9416-100ML | |
| Anti-myc Antibody | Invitrogen | 46-0603 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | B4287-5G | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 658.01D | |
| Dynabeads MyOne T1 Streptavidin | Invitrogen | 658.01D | |
| p-Aminophenylmercuric Acetate | Calbiochem | 164610 | |
| Biotin-Maleimide | Sigma Aldrich | B1267 | |
| Biotin labeled oligo | IDT DNA | Custom synthesis | |
| Digoxigenin labeled oligo | IDT DNA | Custom synthesis | |
| Collagen peptide gene | DNA 2.0 | Custom synthesis | |
| MMP-1 cDNA | Harvard Plasmid Database | ||
| z-translator | Thorlabs | MTS50 | |
| Servo controller for translator | Thorlabs | TDC001 |
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