מרובב יחיד מולקולה proteolysis חיל מדידות באמצעות מלקטת מגנטיים
Summary
במאמר זה נתאר את השימוש פינצטה מגנטיים ללמוד את ההשפעה של כוח על proteolysis האנזימטית ברמה של מולקולה בודדת באופן parallelizable ביותר.
Abstract
הדור וזיהוי של כוחות מכניים הוא היבט של פיזיולוגיה התא נמצא בכל מקום, עם שייכות ישירה סרטן גרורות 1, 2 ו atherogenesis ריפוי פצעים 3. בכל הדוגמאות הללו, התאים להפעיל כוח הן על סביבתם ובמקביל enzymatically לשפץ תאי מטריקס (ECM). השפעת כוחות על ECM הפך בכך על שטח של עניין רב בשל החשיבות שלה סביר ביולוגי ורפואי 4-7.
טכניקות מולקולה בודדת, כגון השמנה אופטי 8, מיקרוסקופ כוח אטומי 9, פינצטה מגנטיים 10,11 לאפשר לחוקרים לבחון את תפקוד האנזימים ברמה המולקולרית על ידי הפעלת כוחות על חלבונים בודדים. של שיטות אלו, פינצטה מגנטי (MT) ידועות ובעלות נמוכה שלהם, קצב העברת נתונים גבוה. MT מפעילים כוחות בטווח של 1-100 ~ PN והוא יכול לספק פתרון זמני אלפית השנייה,תכונות כי הם מתאימים גם ללימוד מנגנון האנזים ברמת מולקולה בודדת 12. כאן אנו מדווחים assay MT parallelizable מאוד ללמוד את ההשפעה של כוח על proteolysis של מולקולות חלבון בודדות. אנו מציגים דוגמה ספציפית של proteolysis של פפטיד קולגן trimeric ידי מטריקס metalloproteinase 1 (MMP-1), אך זה assay ניתן להתאים בקלות ללמוד מצעים אחרים פרוטאזות.
Protocol
Discussion
פרוטוקול זה מתאר שימוש חדש במולקולה טכניקה קלאסית אחת. פינצטה מגנטיים מאפשרים בינונית עד גבוהה התפוקה מבחני מולקולה בודדת בצורה יעילה וחסכונית. עם זאת, כמו כל ניסיוני בטכניקות ישנם אתגרים ואת החסרונות פוטנציאליים.
מגבלות פינצטה מ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי פרס בורוז קריירה Wellcome בממשק המדעי (ARD), המכון הלאומי לבריאות בארה"ב באמצעות תוכנית חדשה של מנהל NIH פרס ממציא 1-DP2-OD007078 (ARD), המלכה האם ויליאם ג'וניור בוגר סטנפורד אחוות (ASA ), ואת לב וכלי דם במכון סטנפורד אחוות הצעיר Predoctoral (JC). המחברים מודים ג'יימס Spudich עבור הלואה ציוד במיקרוסקופ.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number |
| Micro Cover Glass #1.5 (22×22) | VWR | 48366-067 |
| Micro Cover Glass #1.5 (22×40) | VWR | 48393-048 |
| Lambda DNA | Invitrogen | 25250-010 |
| T4 DNA Ligase | Invitrogen | 15224-041 |
| Microcon Ultracel YM-100 | Millipore | 42413 |
| Anti-Digoxigenin | Roche Diagnostics | 11-333-089-001 |
| Tween 20 | Sigma | P9416-100ML |
| Anti-myc Antibody | Invitrogen | 46-0603 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | B4287-5G |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 658.01D |
| Dynabeads MyOne T1 Streptavidin | Invitrogen | 658.01D |
| p-Aminophenylmercuric Acetate | Calbiochem | 164610 |
| Biotin-Maleimide | Sigma Aldrich | B1267 |
| Biotin labeled oligo | IDT DNA | Custom synthesis |
| Digoxigenin labeled oligo | IDT DNA | Custom synthesis |
| Collagen peptide gene | DNA 2.0 | Custom synthesis |
| MMP-1 cDNA | Harvard Plasmid Database | |
| z-translator | Thorlabs | MTS50 |
| Servo controller for translator | Thorlabs | TDC001 |
References
- Ingber, D. E. Can cancer be reversed by engineering the tumor microenvironment. Semin. Cancer Biol. 18, 356-364 (2008).
- Hahn, C., Schwartz, M. A. Mechanotransduction in vascular physiology and atherogenesis. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 53-62 (2009).
- Laurens, N., Koolwijk, P., de Maat, M. P. Fibrin structure and wound healing. J. Thromb. Haemost. 4, 932-939 (2006).
- Adhikari, A. S., Chai, J., Dunn, A. R. Mechanical Load Induces a 100-Fold Increase in the Rate of Collagen Proteolysis by MMP-1. J. Am. Chem. Soc. 133, (2011).
- Zareian, R. Probing collagen/enzyme mechanochemistry in native tissue with dynamic, enzyme-induced creep. Langmuir. 26, (2010).
- Ellsmere, J. C., Khanna, R. A., Lee, J. M. Mechanical loading of bovine pericardium accelerates enzymatic degradation. Biomaterials. 20, 1143-1150 (1999).
- Jesudason, R. Mechanical forces regulate elastase activity and binding site availability in lung elastin. Biophys. J. 99, 3076-3083 (2010).
- Neuman, K. C., Block, S. M. Optical trapping. Rev. Sci. Instrum. 75, 2787-2809 (2004).
- Lee, C. K., Wang, Y. M., Huang, L. S., Lin, S. Atomic force microscopy: determination of unbinding force, off rate and energy barrier for protein-ligand interaction. Micron. 38, 446-461 (2007).
- Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads. Science. 258, 1122-1126 (1992).
- Tanase, M., Biais, N., Sheetz, M. Magnetic tweezers in cell biology. Methods Cell Biol. 83, 473-493 (2007).
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat. Methods. 5, 491-505 (2008).
- Frank, S. Stabilization of short collagen-like triple helices by protein engineering. J. Mol. Biol. 308, 1081-1089 (2001).
- Stetefeld, J. Collagen stabilization at atomic level: crystal structure of designed (GlyProPro)10foldon. Structure. 11, 339-346 (2003).
- Chung, L. Collagenase unwinds triple-helical collagen prior to peptide bond hydrolysis. EMBO J. 23, 3020-3030 (2004).
- Bell, G. I. Models for the specific adhesion of cells to cells. Science. 200, 618-627 (1978).
- Selvin, P. R., Ha, T. . Single-molecule techniques: a laboratory manual. , (2008).
- Graneli, A., Yeykal, C. C., Prasad, T. K., Greene, E. C. Organized arrays of individual DNA molecules tethered to supported lipid bilayers. Langmuir. 22, 292-299 (2006).
- Danilowicz, C., Greenfield, D., Prentiss, M. Dissociation of ligand-receptor complexes using magnetic tweezers. Anal. Chem. 77, 3023-3028 (2005).
- Zhang, X., Halvorsen, K., Zhang, C. Z., Wong, W. P., Springer, T. A. Mechanoenzymatic cleavage of the ultralarge vascular protein von Willebrand factor. Science. 324, 1330-1334 (2009).
- Woodside, M. T. Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 6190-6195 (2006).
- del Rio, A. Stretching single talin rod molecules activates vinculin binding. Science. 323, 638-641 (2009).
- Gosse, C., Croquette, V. Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level. Biophys. J. 82, 3314-3329 (2002).
