Summary
В этой статье мы рассмотрим использование магнитного пинцета, чтобы изучить влияние силы на ферментативную протеолиза на одном уровне молекулы хорошо подходит для распараллеливания образом.
Abstract
Генерация и детектирование механических сил вездесущий аспект физиологии клетки, имеет непосредственное отношение к раку метастазов 1 атерогенеза 2 и заживление раны 3. В каждом из этих примеров, клеток и оказывают силы на свое окружение и одновременно ферментативно реконструируют внеклеточного матрикса (ECM). Влияние сил на ECM, таким образом, стать зоной значительный интерес в связи с его вероятной биологической и медицинской значение 4-7.
Одноместный методы молекулы, такие как оптического захвата 8, атомно-силовой микроскопии 9 и магнитного пинцета 10,11 позволяют исследователям исследовать функции ферментов на молекулярном уровне, оказывая сил на отдельные белки. Из этих методов магнитного пинцета (MT) отличаются низкой стоимостью и высокой пропускной способностью. МТ оказывают силы в диапазоне ~ 1-100 пН и может обеспечить миллисекунды временным разрешением,качества, которые хорошо подходят к изучению ферментов механизм на одной молекуле уровне 12. Здесь мы сообщаем хорошо подходит для распараллеливания MT анализ для изучения влияния силы на протеолиз отдельных молекул белка. Приведем конкретный пример протеолиза тримерной пептид коллагена матричной металлопротеиназы 1 (ММР-1), однако этот анализ может быть легко адаптирована для изучения других субстратов и протеаз.
Protocol
1. Подготовка Проточная ячейка
- Покровные (# 1.5, 22x22 мм и 22x40 мм, VWR) будут чистить с помощью ультразвука.
- Добавить покровные к небольшой стеклянной тары способна удерживать покровные и установки в sonicator (см. шаг 2).
- Наполните контейнер с изопропанола и разрушать ультразвуком в ванне sonicator в течение 20 минут.
- Откажитесь от изопропанола и промыть покровные обильным количеством дистиллированной воды, производимых Barnsted аппарат MilliQ или аналогичное устройство. Заполните емкость с водой и разрушать ультразвуком в течение 20 минут.
- После обработки ультразвуком, высушите покровные в поток фильтруется от пыли воздух. Используйте только покровные, которые появляются чистые (т.е. без пятен).
- Осторожно пламени покровные в течение нескольких секунд, чтобы очистить их от любых оставшихся от пыли и влаги: пройти через покровные газового пламени производится с горелкой Бунзена, заботясь, чтобы не деформировать покровное из-за избыточного тепла. Этот шаг удаляет остаточные поверхностизагрязняющих веществ.
- Использование двухсторонний скотч, приложите два покровных вместе. Отрежьте ленту ~ 3 см в длину и 0,3 см в ширину. Прикрепите ленту 22x40 мм покровным оставляя 1,6 см канал в середине. С помощью пипетки осторожно надавите на покровное для того, чтобы лента правильно соблюдать.
2. Магнитные установки пинцет и калибровка
- Магнитный пинцет были установки с использованием постоянных редкоземельных магнитов, как описано выше 10,12. Алюминиевый L-кронштейн был построен с 1 отверстие диаметром мм и установлен на вертикальной Z-переводчик (Thorlabs) для модуляции высоты пинцетом. Два постоянных редкоземельных магнитов были прикреплены к кронштейну на каждой стороне отверстие для создания магнитной ловушки (рис. 1).
- Препарата ДНК: ДНК фага лямбда надписью на 5 'и 3' концы с биотином и дигоксигенин (IDT ДНК, Сан-Диего, Калифорния) был использован для калибровки магнитногомагнитного пинцета.
- Смешать 50 мкл 4 нм λ-ДНК с 2 мкл 40 нМ биотин сопряженных олигонуклеотида и тепла при температуре 60 ° С в течение 10 минут. Затем медленно охлаждаться при комнатной температуре в течение 1 часа.
- Добавить ДНК-лигазы в соответствии со спецификацией производителя и перевязывать при комнатной температуре в течение 3 часов.
- Добавить 2 мкл 400 нМ дигоксигенин сопряженных олигонуклеотида и инкубируют при комнатной температуре в течение 45 минут.
- Добавить 1,5 мкл 10 мМ АТФ и продолжать перевязки дигоксигенин сопряженных олигонуклеотида в λ-ДНК в течение 3 часов.
- Удалите излишки олигонуклеотидов и ДНК-лигазы с использованием 100 кДа спина фильтры (микроконтроллер Ultracell YM-100). В общей сложности в 1000 раз буфера обмена в ТЕ буфере достаточно, чтобы удалить лишнюю олигонуклеотидов. Примечание: Важно не использовать спин скорости> 500xG, потому что это приведет к сдвига ДНК.
- Изучить образцы ДНК с помощью электрофореза на 0,7% агарозном геле для того, чтобы ДНК яНе денатурировали или стриженого.
- Измерение концентрации ДНК. Использование Nanodrop UV-VIS-спектрометра (Thermo Scientific) рекомендуется, так как имеющийся объем образца может быть очень мала.
- Подготовить поток клеток, как описано в разделе 1.
- Для крепления ДНК проточной ячейки, добавить анти-дигоксигенин антитела (IgG овец, 1 мкг мл -1; Roche Bioscience, Мангейм, Германия) и позволить ему присоединиться к стеклянной поверхности на 15 минут.
- Пассивации поверхности проточной ячейки для предотвращения неспецифического прилипания ДНК, добавив 2 мг мл -1 BSA, 0,1% Твин-20 в 1x PBS. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 45 минут.
- Повторите шаг 2.5.
- Добавить 50 рм fuctionalized λ-ДНК и позволяют прикрепить к покровным в течение 15 минут.
- Смыть избыток ДНК 1x PBS.
- Добавить покрытых стрептавидином суперпарамагнитных бисером (1 мкм = бисер 2 мкг мл -1; 2,8 мкм бисера = 20 мкг мл -1
- Смойте лишний бисер с 1x PBS.
- Магнитные калибровки пинцет
- Перемещение постоянных магнитов в положение, которое находится далеко от поверхности образца (> 15 мм).
- Положите подготовленную клетку потока в микроскоп.
- Перемещение постоянных магнитов в положении над проточной ячейки.
- Выберите фокальной плоскости λ-ДНК функциональными бисером, сосредоточив внимание на бусы от обоих стеклянных поверхностей. Правильный фокальной плоскости, в которой желаемое бисера ярких центра.
- Возьмите видео из бисера движения на 80 Гц или больше на 500 кадров.
- Перемещение магнита ближе к поверхности образца. Для расстояний более 5 мм, перемещение с шагом в 1 мм. Для расстояния между мм 1 и 5, двигаться в 0,5 мм шагом. Для расстояния менее 1 мм, перемещение с шагом 0,25 мм.
- Повторите шаги 2.11.5 и 2.11.6 при каждом новом положении магнита.
- Для каждого типа данныхустанавливать, отслеживать центре бусин с помощью 2D подходит Гаусса.
- Вычислить силу через броуновское колебаний с помощью:
где & B T Больцмана тепловой энергии, L-длина λ-ДНК, и <x 2> разница в тяжести положения.- Подтверждение правильности силы, проверяя силу расчет через силу, пригодную спектр Лоренца для того, чтобы найти Rolloff частоты. Прикладные силы, связанные с Rolloff частотой соотношением:
Там, где ƒ 0 Rolloff частоты, является шарик радиуса и μ является вязкость жидкости 12.
3. Коллаген пептид Приложение к Проточные ячейки
Для того чтобы обеспечить конкретный пример применения нашей методологии, мы описываем последние работы в нашей лаборатории, характеризующий протеолиза тримерной пептид модели коллаген. Мы ожидаем, что это общий подход может быть широко применен в других белков и полинуклеотидов.
- Пептид коллагена модель состоит из N-терминал 6x Его-теги для очистки, а затем 5 раз тус тег (ГПЗ) 10 для обеспечения формирования тройной спирали коллагена α1 остатки 772-786 (GPQGIAGQRGVVGL), которые образуют MMP- 1 сайт узнавания, последовательность foldon (GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL) и С-концевой KKCK чтобы облегчить маркировку с биотин-малеимид. Foldon происходит от Т4-фаг белка fibritin и стабилизирует тримеры коллагена модели, когда сливается либо в N - и С-конца 13,14.
- Пептид коллагена и MMP-1 белки были высказаны и очищенный, как описано выше 4,15. </ LI>
- Добавить анти-тус (15 мкг мл -1) в камеру поток и инкубировать при комнатной температуре в течение 20 минут, чтобы анти-тус приложить к поверхности проточной ячейки.
- Пассивации проточной ячейки для предотвращения неспецифического вложений белков с использованием 5 мг мл -1 BSA таким же образом, как описано в пункте 2.5.
- Добавить 150 пМ коллагеновых пептидов и позволяют прикрепить к антител через тус теги течение 45 минут.
- Смыть избыточного коллагена использованием PBS буфера.
- Добавить стрептавидин покрытых бисером суперпарамагнитных (1 мкм = бисер 2 мкг мл -1 и 2,8 мкм бисера = 20 мкг мл -1) и позволяет им придают молекулы коллагена в течение 45 минут. 1 мкм бисер должен быть разведен в нужной концентрации в PBS. 3 бисер мкм должна быть отделена от решения с помощью сильных магнитов, то resolubilized в PBS. Этот процесс следует повторить 3 раза. Мы заметили, что этот шаг имеет важное значение для GEт 3 мкм бисером связываться с поверхностно-иммобилизованных коллагеновых пептидов.
4. Анализ группы Протеолиз
- Как только поток ячейка в сборе с пептид коллагена и магнитных бус, изображение потока ячейки в магнитной ловушке при низких, ~ 1 сила пН. По нашему опыту, субпопуляции бусы иногда слабо соблюдаются на поверхность в неспецифических моды. Применение скромных сил гарантирует, что эти шарики не будут освобождены.
- Добавить активировать фермент поток клетки. В этом случае MMP-1 был предварительно активировать, добавив 3,5 мм APMA (4-aminophenylmercuric ацетат) и инкубировали при 37 ° C в течение 3 часов. Активация была проверена с помощью SDS-PAGE.
- Как только поток клетки вновь внесен в магнитное устройство пинцет, записать в видео охватывающие несколько полей зрения, как правило, приносит несколько сотен прилагается бисера. Это будет т = 0.
- Повторите тот же процесс записи нескольких полей зрения (при возвращении тО том же поле зрения) в регулярных точках времени, пока все бусины отделить или не далее протеолиза является заметной.
- Кинетический анализ данных
- Посчитайте бусины в различных полей зрения в различные моменты времени и среднем их. Нормализация количества бисера, разделив среднее количество бусин в каждый момент времени на количество бусин в т = 0. Это гарантирует, что мы можем сравнить скорость протеолиза из различных экспериментов, так как абсолютное число бусин будет отличаться от эксперимента к эксперименту.
- Построить отношения в зависимости от времени. В этом случае, мы установили его экспоненциальный спад плюс константа.
где f (T) представляет собой отношение бисером прилагается (или молекулы коллагена unproteolyzed), т есть время, есть доля из бисера прикреплены к коллагена троса, б является распад константа скорости, и весть доля из бисера, которые прикреплены неспецифически.- Тот же опыт повторяется на различных сил и MMP-1 концентраций выяснения влияния силу коллагена протеолиза ММП-1.
5. Представитель Результаты
Выше протокол описывает роман использование магнитного пинцета (рис. 1) для изучения влияния силу ферментативного протеолиза. Мы калиброванный пинцет для 1 мкм и 3 мкм бисера с использованием как величина наблюдаемого броуновского колебаниям и расчет спад частоты при изменении магнит позиции (рис. 2). В экспериментах сила протеолиза, установка аналогичного исключением того, что ДНК заменяется на коллаген (рис. 3, 4). Нормированного числа оставшихся шариков могут быть построены как функции времени, чтобы найти протеолиза ставки (рис. 5), и этот процесс может бытьповторяются для различных ферментов концентрации и сил.
Рисунок 1. Схема магнитной ловушке процесс калибровки (не в масштабе). Два постоянных редкоземельных магнитов создают магнитное поле, которое тянет на суперпарамагнитных шарик. Перевод магнит вверх и вниз регулирует применять силу. Шарики загружаются с помощью обычного светлого поля микроскопа свет, проходящий через отверстие между двумя магнитами вставке. Снимок сделан с целью 40x воздуха. Резкое, круглые пятна соответствуют бисера прикреплены к поверхности покровного. Вне фокуса объектов отдельные бусины.
Рисунок 2. Земельные калиброванного силу в зависимости от магнит расстояние от поверхности образца на 1 мкм (слева) и 2,8 мкм (справа) шарикс. Данные подходят для эмпирической функции 
, Где х-расстояние от магнита. = 31.8, б = 5,61 и с = 4,39 на 1 мкм бисером и = 140, В = 3,10 и с = 1,86 для 3 бисер мкм. Эти значения являются специфическими для нашего конкретного инструмента и геометрии эксперимента, и каждый прибор должен быть откалиброван в отдельности. Погрешности в каждой точке представляет собой около 10% изменчивости в приложенной силы на борта к борту основе, в связи с изменчивостью размер гранул. Силы, приложенной пропорционально объему бисер, бусины и объем варьируется ~ 9% больше, чем средняя (в зависимости от производителя спецификации).
Рисунок 3. Группы протеолиза анализа установки (не в масштабе). Тример коллагена модель крепится к поверхности покровного стекла через мУс / анти-тус сопряжения. Стрептавидин покрытых бисером суперпарамагнитных крепятся к коллагена тримеров с помощью биотин-стрептавидин связи. Активированный MMP-1 сокращения коллагена в течение долгого времени, в результате чего бисер оторваться от поверхности и отойти от фокальной плоскости.
Рисунок 4. Схема мультфильма протеолиза в зависимости от времени. Мультфильм показывает пример поле зрения в течение долгого времени, как протеолиз происходит. Со временем, MMP-1 сокращения коллагена и бисером отключения и отойти от фокальной плоскости под воздействием магнитного поля.
Ставки на рисунке 5. Протеолиза в зависимости от приложенной силе 16. Показаны данные, собранные на уровне 1,0 PN (3 мкМ MMP-1, черный), 6,2 PN (3 мкМ MMP-1, красный) и 13 рп (0,2 мкМ MMP-1, магНТА). Ставки протеолиза (подходит параметров): 0,22 ± 0,02 мин -1 (1 пН), 0,46 ± 0,09 мин -1 (6,2 PN), и 2,08 ± 0,18 мин -1 (13 PN). Часть из бисера unproteolyzed на большие моменты времени (> 15 минут) остается примерно постоянным на ~ 0.25 в различных экспериментах. Планки погрешностей соответствуют Пуассона статистика, отражающая число наблюдений в каждый момент времени. Ошибка в каждый момент времени для бисера п п ^ 1/2. Ошибка в часть из бисера прикреплены была рассчитана по ошибке propagation.1 бисером мкм были использованы для 1.0 и 6.2 рк рк экспериментов и 2,8 мкм бисером были использованы в течение 13 экспериментов пН.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол описывает новое применение классических единой методике молекулы. Магнитный пинцет позволяет средней и высокой пропускной одной молекулы анализов в экономически эффективным способом. Однако, как и все экспериментальные методы существуют проблемы и потенциальные подводные камни.
Ограничения магнитного пинцета
По сравнению с оптической ловушке пространственным и временным разрешением в аппарат MT низка. Кроме того, сил, возникающих при простом MT описаны здесь в 30 пН или меньше, значительно меньше, чем силы регулярно обращались в эксперименте AFM. Это ограничение может быть добродетелью: MT хорошо подходят для применения под-ры сил.
В отличие от оптической ловушки или АСМ, обычные МТ, такие, как аппарат здесь, не позволяют манипулировать отдельными частицами. Оптические ловушки обычно используются, чтобы применить силу параллельно покровным, в то время как MT лучше всего подходит для вертикального вытягивания экспериментов. Электромагнетизмомтик MT преодолеть эти ограничения, хотя и за счет повышенной сложности.
Пинцет калибровки
Как броуновское колебаний и анализа спектра мощности для калибровки силы имеют свои ограничения. Мы обнаружили, что броуновское метод колебания особенно чувствительны к камере размытия. Поскольку частота кадров увеличилась (время экспозиции сократилось) рассчитывается сила уменьшилась. На практике, мы увеличили частоту кадров до силы рассчитывается броуновского колебаний согласился с теми силами, рассчитывается по спектру мощности в пределах 10%. С другой стороны, анализ спектра мощности является более устойчивым к камере размытия, но чуть более сложно реализовать. Мы рекомендуем выполнять и расчеты, чтобы проверить надежность результатов.
Отметим, что изменения в размер гранул и магнитных результате содержание частиц в вариациях в приложенной силы ~ 10%. Этот эффект был не важным в нашем недавнем эксперименте бытьПотому что мы среднем более сотни бусин в каждом измерении. Тем не менее, эксперименты, которые позволяют извлекать уникальную информацию от каждого привязал шарик потенциально может потребоваться более точный метод калибровки.
Управления для обеспечения одной точки вложения
Достижение конкретных, ориентированных одной точке вложения часто практические проблемы в отдельных исследований молекулы. Следующие элементы управления подтверждается конкретными крепления коллаген антител, и бусины с коллагеном:
- Добавлен только бисером проточной ячейки пассивируется с BSA.
- Добавлена анти-тус, пассивируется с BSA, а затем добавил бисера.
- Добавлена анти-тус, пассивируется с BSA, добавил без биотинилированного коллагена, а затем добавил бисера.
- Пассивированные с BSA, добавил без биотинилированного коллагена, а затем добавил бисера.
- Пассивированные с BSA, добавил биотинилированного коллагена, а затем добавил бисера.
- Добавлена анти-тус, пассивируется с BSA, добавил биотинylated коллагена, а затем добавил бисера.
В тех случаях, 1-5, где некоторые компоненты вложения серия была сознательно исключена, колеблется от 0 до 4 бусины были замечены прикреплены к проточной ячейки в поле зрения (80000 мкм 2). Только в случае 6, где все фрагменты вложений присутствуют, мы видели ~ 2,8 мкм 30-60 шариков и 80-200 1 мкм бисера прикреплены к поверхности. Протеолиза кинетики наблюдается адекватно соответствовать одной экспонентой плюс постоянный член, который наводит на мысль, что есть только одна ограничение скорости шага, и, следовательно, только один трос. Постоянный член, вероятно, отражает бусин, которые не являются специально прикреплен к покровным.
Мы сообщаем о концентрации антител и белка, который работал в нашем эксперименте. Широком диапазоне концентраций для каждого компонента должны быть рассмотрены при разработке нового метода. BSA хорошо работал в качестве агента пассивации поверхности в нашем эксперименте. Однако это встретилоХод не может работать в любых обстоятельствах. Другие протоколы для пассивации поверхности также с успехом использоваться. Примеры включают в себя полиэтиленгликоль функциональными стеклах 17, поддерживает липидного бислоя 18 или казеин, как блокирующий агент.
Указания по анализу данных
В экспериментах сила протеолиз, всегда есть неспецифический отряда (особенно на высших сил 19) за счет диссоциации нековалентных (например, биотин - стрептавидин) взаимодействий. Мы учитываем это явление путем измерения протеолиза при различных MMP-1 концентраций, в том числе не MMP-1, как описано в Адхикари и др.. др.. измерения протеолиза при различных MMP-1 концентрация всех сил позволяет генерировать Михаэлиса-Ментен кривых, где используется для расчета эффективности каталитического к кот / K М фермента. Кроме того, если различные концентрации фермента, которые не используются, то мы рекомендуемконтрольное измерение быть сделано без каких-либо ферментов в данном сил вычесть от скорости неспецифического отряда.
Потенциальные области применения
Магнитного пинцета охватывают широкий спектр сил. Сил, которые могут быть приложены зависит от размера бисера. 1 мкм и 2,8 мкм бисером перекрываться в доступных сил, и по нашему опыту, используя один из бисера на промежуточных сил работает хорошо.
Мы ожидаем, что подобные экспериментальные подходы могут быть широко применимы в изучении силу зависимого протеолиза 4,20, разворачивающихся 21 и обязательных взаимодействий 22. Мы и другие 23 отметили, что радиус дифракционного кольца из бисера внимания является чувствительным средством для отслеживания положения шарика по отношению к покровным 23. Несмотря на то, как правило, не используется таким образом, мы считаем, что MT методы имеют возможности обеспечить нанометровой точностью измеренийИзмерения белка структурной динамики. Эта дополнительная информация может быть особенно ценной в условиях форс-зависимый протеолиз или обязательного измерения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Карьера Burroughs Wellcome премии в Научно-интерфейс (ARD), Национального института здравоохранения через Новая программа Новатор премии NIH директора 1-DP2-OD007078 (ARD), Уильям Bowes младший Стэнфордского стипендий (ASA ) и Стэнфордского института сердечно-сосудистой Младший Predoctoral стипендий (x). Авторы выражают благодарность Джеймсу Spudich для кредитования микроскопии оборудования.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro Cover Glass #1.5 (22x22) | VWR | 48366-067 | |
| Micro Cover Glass #1.5 (22x40) | VWR | 48393-048 | |
| Lambda DNA | Invitrogen | 25250-010 | |
| T4 DNA Ligase | Invitrogen | 15224-041 | |
| Microcon Ultracel YM-100 | Millipore | 42413 | |
| Anti-Digoxigenin | Roche Diagnostics | 11-333-089-001 | |
| Tween 20 | Sigma | P9416-100ML | |
| Anti-myc Antibody | Invitrogen | 46-0603 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | B4287-5G | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 658.01D | |
| Dynabeads MyOne T1 Streptavidin | Invitrogen | 658.01D | |
| p-Aminophenylmercuric Acetate | Calbiochem | 164610 | |
| Biotin-Maleimide | Sigma Aldrich | B1267 | |
| Biotin labeled oligo | IDT DNA | Custom synthesis | |
| Digoxigenin labeled oligo | IDT DNA | Custom synthesis | |
| Collagen peptide gene | DNA 2.0 | Custom synthesis | |
| MMP-1 cDNA | Harvard Plasmid Database | ||
| z-translator | Thorlabs | MTS50 | |
| Servo controller for translator | Thorlabs | TDC001 |
References
- Ingber, D. E. Can cancer be reversed by engineering the tumor microenvironment. Semin. Cancer Biol. 18, 356-364 (2008).
- Hahn, C., Schwartz, M. A. Mechanotransduction in vascular physiology and atherogenesis. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 53-62 (2009).
- Laurens, N., Koolwijk, P., de Maat, M. P.
- Adhikari, A. S., Chai, J., Dunn, A. R. Mechanical Load Induces a 100-Fold Increase in the Rate of Collagen Proteolysis by MMP-1. J. Am. Chem. Soc. 133, (2011).
- Zareian, R. Probing collagen/enzyme mechanochemistry in native tissue with dynamic, enzyme-induced creep. Langmuir. 26, (2010).
- Ellsmere, J. C., Khanna, R. A., Lee, J. M. Mechanical loading of bovine pericardium accelerates enzymatic degradation. Biomaterials. 20, 1143-1150 (1999).
- Jesudason, R. Mechanical forces regulate elastase activity and binding site availability in lung elastin. Biophys. J. 99, 3076-3083 (2010).
- Neuman, K. C., Block, S. M.
- Lee, C. K., Wang, Y. M., Huang, L. S., Lin, S. Atomic force microscopy: determination of unbinding force, off rate and energy barrier for protein-ligand interaction. Micron. 38, 446-461 (2007).
- Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads. Science. 258, 1122-1126 (1992).
- Tanase, M., Biais, N., Sheetz, M.
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat. Methods. 5, 491-505 (2008).
- Frank, S. Stabilization of short collagen-like triple helices by protein engineering. J. Mol. Biol. 308, 1081-1089 (2001).
- Stetefeld, J. Collagen stabilization at atomic level: crystal structure of designed (GlyProPro)10foldon. Structure. 11, 339-346 (2003).
- Chung, L. Collagenase unwinds triple-helical collagen prior to peptide bond hydrolysis. EMBO J. 23, 3020-3030 (2004).
- Bell, G. I. Models for the specific adhesion of cells to cells. Science. 200, 618-627 (1978).
- Selvin, P. R., Ha, T. Single-molecule techniques: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).
- Graneli, A., Yeykal, C. C., Prasad, T. K., Greene, E. C. Organized arrays of individual DNA molecules tethered to supported lipid bilayers. Langmuir. 22, 292-299 (2006).
- Danilowicz, C., Greenfield, D., Prentiss, M. Dissociation of ligand-receptor complexes using magnetic tweezers. Anal. Chem. 77, 3023-3028 (2005).
- Zhang, X., Halvorsen, K., Zhang, C. Z., Wong, W. P., Springer, T. A. Mechanoenzymatic cleavage of the ultralarge vascular protein von Willebrand factor. Science. 324, 1330-1334 (2009).
- Woodside, M. T. Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 6190-6195 (2006).
- del Rio, A. Stretching single talin rod molecules activates vinculin binding. Science. 323, 638-641 (2009).
- Gosse, C., Croquette, V. Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level. Biophys. J. 82, 3314-3329 (2002).
