Summary
在这篇文章中，我们描述了利用磁性镊子，在一个高度并行的方式在单分子水平研究的酶水解的影响力。
Abstract
机械力的生成和检测是一个无处不在的细胞生理学方面，直接关系到癌转移1，动脉粥样硬化和伤口愈合3。在这些例子中，每个细胞都在他们的周围施加力量，同时酶解改造外基质（ECM）。流脑的力量的作用也因此成为一个面积相当大的兴趣，由于其可能的生物学和医学的重要性4-7。
如光阱，原子力显微镜，磁镊子10,11单分子技术使研究人员能够探测功能的酶在分子水平上对个别蛋白质的力量发挥。这些技术，磁镊子（吨），其低成本和高吞吐量显着。吨在〜1-100 PN的范围施加的力量，可以提供毫秒级的时间分辨率，12在单分子水平研究酶机制很好地匹配的素质。在这里，我们报告一个高度并行吨的实验研究单个蛋白质分子的蛋白质的影响力。我们提出具体的例子，由基质金属蛋白酶1（MMP-1）的三聚体胶原蛋白肽的蛋白质，但是，此法可以很容易地适应学习其他基板和蛋白酶。
Protocol
1。流动电池的制备
- 盖玻片（＃1.5，22x22毫米和22x40毫米，厂商VWR）使用超声波清洗。
- 添加盖玻片盖玻片和装修在sonicator（见步骤2）的一个小玻璃容器。
- 填补与异丙醇的容器和超声在20分钟的沐浴sonicator。
- 丢弃异丙醇和MilliQ Barnsted设备或类似设备由去离子水冲洗量，冲洗盖玻片。装满水的容器中，超声20分钟。
- 超声波处理后，干燥过滤，无粉尘的空气流中的盖玻片。使用只出现干净（即无污迹）的盖玻片。
- 轻轻火焰几秒钟的盖玻片清除任何剩余的灰尘和湿气：通过用本生灯产生的气体火焰盖玻片，照顾，不变形的盖玻片，由于多余的热量。这一步消除表面残留污染物。
- 使用双面胶带，连接在一起的两个盖玻片。切〜3厘米长，0.3厘米宽的磁带。留在中间1.6厘米的通道上22x40毫米盖玻片附加的磁带。用枪头轻轻按下盖玻片上，以确保磁带已坚持正确的。
2。磁性镊子安装和校准
- 磁性镊子安装使用永久稀土永磁材料，描述以前10,12。构建了一个直径1毫米的针孔和一个铝制的L型支架安装在垂直的Z-翻译（Thorlabs）调节高度镊子。两个常任理事国的稀土永磁材料被装针孔创建磁阱（ 图1）两侧的支架。
- 标记λ噬菌体DNA的制备：在其5'和3'的DNA与生物素和地高辛（内幕交易审裁处的DNA，圣迭戈，CA）的两端，用于校准磁遗传镊子。
- 混合4纳米的λ-DNA 50μL，2μL40生物素标记的寡核苷酸和热量在60°C 10分钟纳米。室温超过1小时，然后慢慢冷静。
- 根据制造商的规格，并加入DNA连接酶在室温下结扎3小时。
- 加入2μL400牛米的地高辛标记的寡核苷酸在室温45分钟孵育。
- 加入1.5μL10 mM的ATP的结扎地高辛标记的寡核苷酸的λ-DNA，并持续3个小时。
- 删除多余的核苷酸和DNA连接酶使用100 kDa的自旋过滤器（单片机Ultracell YM-100）。共有1000倍TE缓冲缓冲区交换是足够的，去除多余的寡核苷酸。注：重要的是不使用自旋速度> 500xG，因为它会导致DNA的剪切。
- 审查通过0.7％琼脂糖凝胶电泳对DNA样品，以确保我的DNA不是变性或剪切。
- 测量DNA的浓度。使用一个的NanoDrop紫外 - 可见光谱仪（Thermo Scientific的）建议，因为现有的样本量可能是非常小的。
- 第1条所述的准备流细胞。
- 附件流细胞的DNA，加入抗地高辛抗体（羊IgG的1微克毫升-1;罗氏生物科学，曼海姆，德国），并允许它坚持了15分钟的玻璃表面。
- 流细胞表面钝化，以防止非特异性的DNA症结1X PBS中添加2毫克毫升-1牛血清白蛋白，0.1％Tween-20的。在室温下孵育45分钟。
- 重复步骤2.5。
- 新增50时的fuctionalized的λ-DNA，并允许附加15分钟的盖玻片。
- 1X PBS洗去多余的DNA。
- 加入链霉亲和涂层的超顺磁性珠（1微米微珠= 2微克毫升-1; 2.8微米微珠= 20微克毫升-1
- 1X PBS洗去多余的珠子。
- 磁镊子校准
- 移动永久磁铁的位置是远离样品表面（> 15毫米）。
- 在显微镜下将准备流细胞。
- 以上的流动池的位置移动到永久磁铁。
- 远离两个玻璃表面上珠为重点，选择焦平面的λ-DNA官能珠。正确的焦平面是在其中所需的珠子有一个光明的中心。
- 采取珠议案的80 Hz或500帧的视频。
- 将磁铁靠近样品表面。对于超过5毫米的距离，移动1毫米递增。 1和5毫米之间的距离，将在0.5毫米递增。对于距离小于1毫米，0.25毫米的增量移动。
- 在每一个新的磁铁的位置，重复步骤2.11.5和2.11.6。
- 对于每个数据设置，使用二维高斯拟合珠跟踪中心。
- 计算通过使用布朗波动的力量：
其中K B T是玻尔兹曼热能，L是λ-DNA的长度，<x 2>质心位置的变化。- 确认通过洛伦兹拟合功率谱检查，以便找到滚降频率的内力计算精度的力量。作用力与滚降频率的关系：
式中ƒ0是滚降频率， 一个是珠半径，μ为流体粘度12。
3。胶原蛋白肽扣押流动细胞
为了提供一个具体的例子，我们的方法的应用，我们描述了最近在我们的实验室工作，水解胶原蛋白三聚体模型肽的特点。我们预计，这一般方法可广泛应用于其他蛋白质和核苷酸。
- 胶原蛋白的模型肽由一个 N-端为净化myc基因标记的5倍，（GPP）的10强制三螺旋形成，胶原，6X His-tag的α1残基772-786（GPQGIAGQRGVVGL），从而形成了MMP- 1识别位点中，foldon序列（GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL），和一个 C-末端KKCK方便与马来酰亚胺生物素标记。 foldon源于在T4噬菌体蛋白fibritin的，和稳定胶原蛋白模型的三聚体融合的 N -或C-末端13,14。
- 胶原蛋白肽和MMP-1蛋白表达和纯化所述先前4,15。</ LI>
- 加入抗-myc基因（毫升15微克-1），室温孵育20分钟的流动细胞和允许-myc基因反流细胞表面的重视。
- 钝化流动池，以防止非特异性蛋白质在以同样的方式使用5毫克mL -1的 BSA在步骤2.5中所述的附件。
- 新增150分胶原蛋白肽，并允许它连接通过45分钟的myc基因标记的抗体。
- 洗去多余的胶原蛋白，用PBS缓冲液。
- 加入链霉亲和涂层的超顺磁性珠（珠1微米= 2微克mL -1和2.8微米微珠=毫升20微克-1），并允许它们附加到45分钟的胶原蛋白分子。 1微米的珠应在PBS稀释至所需浓度。 3微米微珠应分开使用强大的磁铁，然后在PBS resolubilized的解决方案。这个过程应重复3次。我们注意到，这一步是必不可少的GE牛逼的3微米微珠表面固定的胶原蛋白肽结合。
4。部队蛋白水解实验
- 一旦流动细胞组装与胶原蛋白肽和磁珠，在磁阱下低，〜1 PN力流细胞的图像。在我们的经验，亚珠有时弱坚持在一个非特定的方式表面。应用的微薄之力，确保这些珠子是解放。
- 添加酶的激活流动池。在这种情况下MMP-1的预先激活，通过增加3.5毫米APMA（4-aminophenylmercuric的醋酸），并在37°C孵育3小时。使用SDS-PAGE电泳，激活验证。
- 只要流动细胞的磁性镊子设备重新推出，记录视频跨越几个领域的观点，通常会产生数百附加珠。这将是T = 0。
- 重复同一过程的记录来看几个领域（返回ţ○同一领域的观点在固定的时间点），直到所有的磁珠分离或没有进一步的蛋白质，是有迹可寻的。
- 动力学数据分析
- 珠计算在各个领域的角度来看，在不同的时间点和平均。正常化珠数珠珠在t = 0的平均数除以各时间点。这将确保我们可以比较来自不同实验的蛋白质率，因为珠的绝对数量将有所不同，从实验到实验。
- 作为时间的函数绘制的比例。在这种情况下，我们安装了指数衰减，加上一个常数。
ƒ（T）是附加（或胶原分子unproteolyzed），珠率，t是时间，是由胶原蛋白系绳连接珠子的分数，B衰变速率常数， 和 c是珠是连接非特异性的一小部分。- 重复同样的实验在不同的力量和阐明MMP-1 MMP-1浓度的胶原蛋白水解的影响力。
5。代表结果
上述协议描述了一个用于研究的酶水解的影响力的新型磁性镊子（ 图1）使用。我们校准镊子为1微米，3微米微珠使用所观察到的布朗波动的幅度和滚降频率的计算，在不同的磁铁位置（ 图2）。力水解实验中，设置类似的是，除了DNA的胶原蛋白（ 图3，4）取代。规格化数剩余珠可以绘制时间找到水解率（ 图5）的功能，而这个过程可以重复不同的酶的浓度和力量。
图1。磁阱校准过程示意图（未按比例）。两个常任理事国的稀土磁铁产生的磁场对超顺磁性珠拉。翻译磁铁向上和向下调整的作用力。珠通过两个磁铁之间的针孔的光线通过使用传统的亮场显微镜成像插图 ：图片采取与一个40X空中目标。尖锐，圆点对应连接到盖玻片表面的珠子。出的重点对象是独立的珠子。
从样品表面的功能作为一个磁铁的距离为1微米（ 左 ）和2.8微米（ 右 ）珠校准力图图2。第数据拟合经验功能
， 其中 x是从磁铁的距离。= 31.8，B = 5.61，C = 1微米微珠和4.39 = 140，B = 3.10和c = 1.86为3微米微珠。这些价值观是具体到特定的仪器和实验几何，每台仪器应单独校准。在每一个点的误差棒代表上珠，以珠为基础的作用力〜10％的变异，由于粒径的变化。施加的力是珠量成正比，珠体积变化超过平均〜9％（根据制造商的规格）。
图3。部队蛋白质检测设置（ 不按比例 ）。 通过 M盖玻片表面的胶原蛋白模型的三聚体YC /抗-myc基因的共轭。链霉亲和涂层的超顺磁性珠连接到胶原蛋白的三聚体通过生物素 - 亲和联动。活化中MMP-1的削减胶原蛋白随着时间的推移，造成珠脱离表面和移动焦平面。
图4。示意图卡通蛋白质作为时间的函数。卡通显示发生的观点随着时间的推移蛋白质样品领域。随着时间的推移，MMP-1切胶原蛋白和磁珠分离和磁场的影响下，从焦平面移动。
图5。蛋白水解率取决于作用力16。所示的1.0 PN（3μM的MMP-1的， 黑色 ）收集的数据，PN PN 6.2（3μM的MMP-1的， 红色 ）和13（0.2微米MMP-1的; 法师NTA）。蛋白质的利率（拟合参数）：0.22±0.02分钟-1（1 PN），0.46±0.09分钟-1（6.2 PN），2.08±0.18分钟-1（13 PN）。在很长的时间点（15分钟）unproteolyzed珠的分数仍约在0.25〜在不同的实验常数。错误酒吧对应的泊松统计反映在每个时间点的若干意见。在每个时间点n 的珠子错误是 n 1/2。附加珠分数的错误，计算错误propagation.1微米微珠用于PN 1.0和6.2 PN 13 PN实验实验和2.8微米微珠使用。
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Discussion
本协议描述了一个经典的单分子技术的新用途。磁性镊子允许介质在成本效益的方式，以高通量单分子检测。然而，像所有的实验技术，也有挑战和潜在的隐患。
磁性镊子的限制
磁光阱相比，一吨设备的空间和时间分辨率低。此外，这里描述的简单吨，产生的力是30 PN或以下，明显比AFM实验中经常访问的力量。这种限制可以是一种美德：吨是适合申请子-PN的力量。
磁光阱，原子力显微镜，常规吨，如这里的仪器不同，不允许操纵单个粒子。通常使用光学陷阱申请盖玻片平行的力量，而吨垂直拉力试验最适合的。 electromagne抽动吨，解决这些限制，虽然成本增加了复杂性。
镊子校准
布朗波动力校准和功率谱分析也有其局限性。我们发现，布朗的波动方法是特别敏感的相机模糊。由于帧速率增加（减少曝光时间）计算力下降。在实践中，我们增加了帧速率，直到布朗波动计算的力量在10％以内计算功率谱的力量达成一致意见。反之，功率谱分析是更强大的对相机模糊，但稍微更难以实施。我们建议，同时执行计算，检查结果的鲁棒性。
我们注意到，在珠大小和磁粉应用〜10％的力量变化的内容结果变化。这种效果是不是在我们最近的实验中的重要因为我们在每一次测量平均超过数百珠。然而，实验，提取每个拴珠独特的信息可能需要一个更精确的校准方法。
控制，以确保单点附件
实现具体的，面向，单点的附件往往是在单分子研究中的实际挑战。以下控件证实胶原蛋白抗体的具体附件，胶原珠：
- 只加珠流量细胞与牛血清白蛋白钝化。
- 加入抗-myc基因，珠钝化与BSA，然后加入。
- 添加抗-myc基因，与BSA钝化，非生物素胶原蛋白，然后加入珠。
- 钝化与BSA，加入生物素化的非胶原蛋白，然后添加珠。
- 钝化与BSA，然后加入生物素化的胶原蛋白和珠。
- 添加抗-myc基因，与BSA钝化，补充生物素ylated胶原蛋白，然后加入珠。
1-5的情况下，故意省略一些附件系列的组成部分，从0到4珠被视为附加视图（80,000微米2）每场流细胞。仅在6情况下，所有的附着基是目前，我们看到了〜30-60 2.8微米微珠和80-200 1微米微珠表面附着。水解动力学观察有足够的适合由一个单一的指数加上一个常数项，这有力地表明，有只有一个限速步骤，因此只有一个系绳。常数项很可能反映了非特异性连接到盖玻片的珠子。
我们报告的抗体和蛋白的浓度，为我们的实验工作。广泛的浓度为每个组件开发一种新的检测时，应当审查。牛血清白蛋白以及表面钝化剂，在我们的实验工作。然而，这个会晤HOD在任何情况下都可能无法正常工作。表面钝化的其他协议也已成功。例子包括聚乙二醇功能玻璃幻灯片17，支持的脂质双层18日 ，或作为阻断剂酪蛋白。
数据分析的注意事项
生效蛋白质实验中，总是有一些非特定支队（尤其是在更高的力量19）由于非共价键（如生物素-链霉亲和）解离的相互作用。我们占到这一现象在不同的MMP-1的浓度，包括没有MMP-1 阿迪卡里等 ，通过测量蛋白质。测量蛋白质在各种MMP-1的浓度一切力量，使我们产生米氏曲线，是用来计算的催化效率ķ 猫 / K的酶的M。另外，如果不使用不同浓度的酶，我们建议酶没有在给定的力量，减去非特异性支队率进行控制测量。
潜在的应用
磁性镊子力范围涵盖广泛。可以发挥的力量取决于大小的珠子。 1微米和2.8微米微珠重叠访问的力量，在我们的经验，在中间势力的珠子使用效果很好。
我们预计，类似的实验方法可能广泛适用于学习力依赖蛋白质4,20，展开21和22结合的相互作用。我们和其他23注意到，衍射环半径出重点珠提供了一个跟踪盖玻片23珠相对位置的敏感手段。虽然一般不采用这种方式，我们相信吨化验有能力提供纳米精度测量蛋白质结构动力学urements。这些额外的信息可能是特别有价值的，在力依赖的蛋白质或有约束力的测量范围内。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是支持的巴勒斯惠康在科学界面（ARD），国立卫生研究院通过国立卫生研究院主任的新的创新奖励计划1-DP2-OD007078（ARD）的威廉·鲍斯小斯坦福大学研究生奖学金（ASA的事业奖），斯坦福大学心血管病研究所年轻的博士前奖学金（JC），。作者感谢出借显微镜设备詹姆斯Spudich。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro Cover Glass #1.5 (22x22) | VWR | 48366-067 | |
| Micro Cover Glass #1.5 (22x40) | VWR | 48393-048 | |
| Lambda DNA | Invitrogen | 25250-010 | |
| T4 DNA Ligase | Invitrogen | 15224-041 | |
| Microcon Ultracel YM-100 | Millipore | 42413 | |
| Anti-Digoxigenin | Roche Diagnostics | 11-333-089-001 | |
| Tween 20 | Sigma | P9416-100ML | |
| Anti-myc Antibody | Invitrogen | 46-0603 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | B4287-5G | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 658.01D | |
| Dynabeads MyOne T1 Streptavidin | Invitrogen | 658.01D | |
| p-Aminophenylmercuric Acetate | Calbiochem | 164610 | |
| Biotin-Maleimide | Sigma Aldrich | B1267 | |
| Biotin labeled oligo | IDT DNA | Custom synthesis | |
| Digoxigenin labeled oligo | IDT DNA | Custom synthesis | |
| Collagen peptide gene | DNA 2.0 | Custom synthesis | |
| MMP-1 cDNA | Harvard Plasmid Database | ||
| z-translator | Thorlabs | MTS50 | |
| Servo controller for translator | Thorlabs | TDC001 |
References
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