Summary
In dit artikel beschrijven we het gebruik van magnetische pincet om het effect van geweld op enzymatische proteolyse studeren aan de enkel molecuul niveau in een zeer parallelizable manier.
Abstract
Het genereren en detectie van mechanische krachten is een alomtegenwoordig aspect van de cel fysiologie, met directe relevantie voor kanker metastase 1, 2 en atherogenese wondgenezing 3. In elk van deze voorbeelden cellen zowel uitoefenen van kracht op de omgeving en tegelijkertijd enzymatisch vorm van de extracellulaire matrix (ECM). Het effect van krachten op ECM is zo uitgegroeid tot een gebied van groot belang vanwege de mogelijke biologische en medische belang 4-7.
Enkel molecuul technieken zoals optische trapping 8, atomic force microscopie 9, en magnetische pincet 10,11 kunnen de onderzoekers om de functie van enzymen op moleculair niveau door het uitoefenen van krachten op afzonderlijke eiwitten te onderzoeken. Van deze technieken, magnetische pincet (MT) zijn opmerkelijk vanwege hun lage kosten en hoge doorvoer. MT oefenen krachten in het bereik van 1-100 ~ pN en kunnen milliseconde temporele resolutiekwaliteiten die goed zijn voor de studie van enzym-mechanisme afgestemd op de single-molecule level 12. Hier rapporteren een zeer parallelizable MT assay het effect van kracht op de Proteolyse van een eiwitmoleculen bestuderen. Wij geven het specifieke voorbeeld van de Proteolyse van een trimere collageen peptide matrix metalloproteinase 1 (MMP-1), maar deze assay kan gemakkelijk worden aangepast aan andere substraten en proteasen bestuderen.
Protocol
1. Flow Cell Bereiding
- Dekglaasjes (# 1.5, 22x22 mm en 22x40 mm, VWR) worden gereinigd met ultrasoonapparaat.
- Voeg de dekglaasjes tot een klein glazen fles kunnen houden dekglaasjes en passend in de ultrasoonapparaat (zie stap 2).
- Vul de container met isopropanol en ultrasone trillingen in een bad ultrasoonapparaat gedurende 20 minuten.
- Gooi de isopropanol en spoel de dekglaasjes met een ruime hoeveelheid gedemineraliseerd water geproduceerd door een Barnsted MilliQ apparaat of soortgelijk apparaat. Vul de bak met water en ultrasone trillingen gedurende 20 minuten.
- Na sonicatie, drogen de dekglaasjes in een stroom van gefilterde, stofvrije lucht. Gebruik alleen dekglaasjes die verschijnen schoon (dwz geen vlekken).
- Voorzichtig vlam de dekglaasjes voor een paar seconden om ze schoon te maken van de overige stof en vocht: langs de dekglaasjes door middel van een gasvlam geproduceerd met een bunsenbrander, zorg ervoor dat u het dekglaasje als gevolg van overtollige warmte kromtrekken. Deze stap verwijdert op het oppervlakverontreinigingen.
- Met behulp van dubbelzijdig plakband, samen bevestig de twee dekglaasjes. Snijd de tape ~ 3 cm lengte en 0,3 cm in de breedte. Bevestig de tape op 22x40 mm dekglaasje aan het verlaten van een 1,6 cm-kanaal in het midden. Gebruik een pipet tip om zachtjes in te drukken op het dekglaasje om ervoor te zorgen dat de tape goed heeft gehandeld.
2. Magnetisch pincet Setup en kalibratie
- Magnetisch pincet waren setup met permanente zeldzame aardmetalen magneten zoals eerder beschreven 10,12. Een aluminium L-vormige beugel is uitgevoerd met een 1 mm diameter pinhole en gemonteerd op een verticaal z-translator (Thorlabs) het moduleren van de hoogte van de pincet. Twee vaste zeldzame aardmetalen magneten zijn bevestigd aan de beugel aan weerszijden van het gaatje de magnetische trap (figuur 1) te maken.
- DNA preparaat: DNA van faag lambda gelabeld aan de 5 'en 3' uiteinden met biotine en digoxigenine (IDT DNA, San Diego, CA) werd gebruikt om de mag kalibrerenmagnetische pincet.
- Meng 50 pi 4 λ nM-DNA met 2 pi van 40 nM biotine geconjugeerd oligonucleotide en warmte bij 60 ° C gedurende 10 minuten. Dan langzaam afkoelen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Voeg DNA ligase volgens fabrikant en ligeren bij kamertemperatuur gedurende 3 uur.
- Voeg 2 pi van 400 nM digoxigenine geconjugeerd oligonucleotide en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 45 minuten.
- Voeg 1,5 ul 10 mM ATP en verder ligatie van de digoxigenine geconjugeerde oligonucleotide de λ-DNA gedurende 3 uur.
- Het overtollige oligonucleotiden en DNA ligase met 100 kDa rotatie filters (Microcon Ultracell YM-100). Een totaal van 1000-voudige buffer-uitwisseling in TE-buffer is voldoende om het overtollige oligo's. Let op: Het is belangrijk niet te gebruiken centrifugetoerental> 500xG, omdat dit zal leiden tot het scheren van het DNA.
- Een steekproef van de DNA via elektroforese op een 0,7% agarosegel dat de DNA iis niet gedenatureerd of geschoren.
- Meet concentratie van DNA. Het gebruik van een NanoDrop UV-Vis spectrometer (Thermo Scientific) wordt aanbevolen omdat de beschikbare monstervolume kan zeer klein.
- Bereid stroom cellen zoals beschreven in paragraaf 1.
- Voor de bevestiging van de DNA van de doorstroomcel toevoegen anti-digoxigenine antilichaam (schapen IgG, 1 pg ml'1, Roche Bioscience, Manheim, Duitsland) en laat het op het glasoppervlak hechten gedurende 15 minuten.
- Passiveren het oppervlak van de doorstroomcel niet-specifieke kleven van DNA voorkomen door toevoeging van 2 mg ml -1 BSA, 0,1% Tween-20 in PBS 1x. Incuberen bij kamertemperatuur gedurende 45 minuten.
- Herhaal stap 2.5.
- Voeg 50 pM van fuctionalized λ-DNA en laat het dekglaasje hechten gedurende 15 minuten.
- Verwijder de overmaat DNA met 1x PBS.
- Voeg streptavidine gecoate parels superparamagnetische (1 pm korrels = 2 ug ml'1; 2,8 pm kralen = 20 pg ml'1
- Verwijder de overmaat kralen met 1x PBS.
- Magnetisch pincet Kalibratie
- Beweeg de permanente magneten in een positie die ver van het monster oppervlak (> 15 mm).
- Plaats bereide doorstroomcel in de microscoop.
- Zet de permanente magneten in positie boven de doorstroomcel.
- Kies het brandvlak van λ-DNA-gefunctionaliseerde kralen door te focussen op de kralen uit de buurt van beide glazen oppervlakken. De juiste focal plane is er een waarin de gewenste kralen hebben een helder centrum.
- Neem een video van kraal beweging bij 80 Hz of meer voor de 500 frames.
- Plaats de magneet dichter bij het monster oppervlak. Voor afstanden boven de 5 mm, bewegen in stappen van 1 mm. Voor afstanden tussen de 1 en 5 mm, bewegen in stappen van 0,5 mm. Voor afstanden minder dan 1 mm, bewegen in stappen van 0,25 mm.
- Herhaal stap 2.11.5 en 2.11.6 bij elke nieuwe positie van de magneet.
- Voor elke dataingesteld volgen het midden van de korrels met een 2D Gaussiaanse benadering.
- Bereken de kracht via de Brownse fluctuaties met behulp van:
waarbij k B T de Boltzmann thermische energie, L de lengte van λ-DNA en <X 2> de variatie in zwaartepunt positie.- De juistheid van de krachten door het controleren van de berekening van krachten via een vermogensspectrum Lorentz geschikt om de rolloff frequentie te vinden. Uitgeoefende kracht is gerelateerd aan de frequentie rolloff door de relatie:
Wanneer ƒ 0 het rolloff frequentie, een de kraal radius en μ de viscositeit 12.
3. Collageen Peptide Bijlage bij Flow cellen
Om een concreet voorbeeld voor de toepassing van onze methodologie te bieden, beschrijven we recent werk in ons laboratorium dat de proteolyse van een trimere collageen model peptide kenmerkt. We verwachten dat deze algemene benadering kan breed worden toegepast op andere eiwitten en polynucleotiden.
- Het collageen model peptide bestaat uit een N-terminaal 6x His-tag voor zuivering, gevolgd door een 5 x Myc-label (GPP) 10 drievoudige helix-formatie te handhaven, het collageen α1 residuen 772-786 (GPQGIAGQRGVVGL) in de vorm MMP- een herkenningsplaats de foldon sequentie (GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL) en een C-terminale KKCK vergemakkelijking labelen met biotine-maleïmide. Foldon afgeleid van de T4-faag eiwit fibritin en stabiliseert collageen model trimeren bij gefuseerd aan de N - of C-terminus 13,14.
- Het collageen peptide en MMP-1 eiwitten werden tot expressie gebracht en gezuiverd als eerder beschreven 4,15. </ Li>
- Voeg anti-myc (15 ug ml-1) tot de meetcel en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten om de anti-myc te hechten aan het oppervlak van de doorstroomcel.
- Passiveren de doorstroomcel niet-specifieke bevestiging van eiwitten met 5 mg BSA ml'1 op dezelfde wijze als beschreven in stap 2.5 voorkomen.
- Voeg 150 pM collageen peptide en laat het aan het antilichaam hechten via de myc-tag voor 45 minuten.
- Verwijder de overmaat collageen met PBS-buffer.
- Voeg streptavidine gecoate superparamagnetische kralen (1 micrometer = kralen 2 ug ml-1 en 2,8 micrometer kralen = 20 ug ml -1) en laat ze hechten aan de collageen moleculen gedurende 45 minuten. De 1 pm korrels worden verdund tot de gewenste concentratie in PBS. De 3 urn korrels te scheiden van de oplossing met sterke magneten dan resolubilized in PBS. Dit proces wordt herhaald 3 keer. We hebben gemerkt dat deze stap is essentieel voor get de 3 urn korrels te binden aan het oppervlak geïmmobiliseerd collageen peptide.
4. Force Proteolyse Assay
- Zodra de stroom cel wordt gemonteerd met collageen peptide en magnetische korrels, het imago van de stroom cel in de magnetische val onder lage, ~ 1 pN kracht. In onze ervaring is een subpopulatie van de korrels soms zwak hechtten aan het oppervlak in een niet-specifieke wijze. De toepassing van bescheiden kracht zorgt ervoor dat deze kralen bevrijd zijn.
- Voeg geactiveerd enzym de doorstroomcel. In dit geval MMP-1 werd vooraf geactiveerd door toevoeging 3,5 mM APMA (4-aminophenylmercuric acetaat) en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 3 uur. De activering werd gecontroleerd met behulp van SDS-PAGE.
- Zodra de stroom cel wordt teruggeleid in de magnetische pincet apparaat, een video spanning enkele gezichtsveld, meestal waarbij honderden bijgevoegde kralen. Dit zal t = 0.
- Herhaal hetzelfde proces betreffende het opslaan van verschillende gezichtsveld (terwijl t weero hetzelfde gezichtsveld) op regelmatige tijdstippen, tot alle korrels los te koppelen of geen verdere proteolyse waarneembaar is.
- Kinetische data-analyse
- Tel de kralen in de verschillende domeinen van uitzicht op verschillende tijdstippen en gemiddeld hen. Normaliseren aantal korrels door de gemiddelde aantal korrels op elk tijdstip het aantal korrels bij t = 0. Dit zorgt ervoor dat we de tarieven van de proteolyse van verschillende experimenten te vergelijken, omdat het absolute aantal kralen zal verschillen van experiment om te experimenteren.
- Zet de verhouding als functie van de tijd. In dit geval verdient gemonteerd aan een exponentieel plus een constante.
waarbij ƒ (t) is de verhouding van de korrels bevestigd (of collageenmoleculen unproteolyzed) t de tijd, a de fractie van korrels gemonteerd door collageen ketting, b is het verval constant en cde fractie korrels die niet specifiek verbonden.- Hetzelfde experiment wordt herhaald bij verschillende kracht en MMP-1 concentraties om het effect van werking op collageen proteolyse verduidelijken van MMP-1.
5. Representatieve resultaten
De bovenstaande protocol beschrijft een nieuwe toepassing van magnetische pincet (figuur 1) voor het bestuderen van het effect van werking van enzymatische proteolyse. We gekalibreerd pincet 1 pm en 3 pm kralen met zowel de omvang van de waargenomen Brownse fluctuaties en berekening van de roll-off frequentie verschillende posities magneet (figuur 2). In de kracht proteolyse experimenten de installatie is gelijk behalve dat het DNA wordt vervangen collageen (figuren 3, 4). De genormaliseerde aantal korrels nog worden uitgezet als functie van de tijd de Proteolyse percentages (figuur 5) te vinden, en dit proces kanherhaald voor verschillende enzymconcentraties en krachten.
Figuur 1. Schematische weergave van de magnetische val kalibratie (niet op schaal). Twee permanente zeldzame aarde magneten zorgen voor een magnetisch veld dat trekt aan de superparamagnetische kraal. Het vertalen van de magneet op en neer past de uitgeoefende kracht. De kralen worden afgebeeld met behulp van een conventionele bright-field microscoop met het licht dat door een gaatje tussen de twee magneten Inzet:. Foto gemaakt met een 40x lucht doelstelling. De scherpe ronde punten overeen met de korrels aan het dekglaasje oppervlak. De out-of-focus objecten zijn vrijstaande kralen.
Figuur 2. Stukken de gekalibreerde kracht als functie van magneet afstand van het monster oppervlak van 1 mm (links) en 2,8 pm (rechts) beads. De gegevens werden bevestigd aan de empirische functie 
, Waarbij x de afstand van de magneet. A = 31,8, b = 5,61 en c = 4,39 voor 1 pm kralen en a = 140 b = 3,10 en c = 1,86 voor de 3 pm kralen. Deze waarden zijn specifiek voor onze specifieke instrument en experimentele geometrie en elk instrument moet individueel worden gekalibreerd. De foutmarges in elk punt vertegenwoordigen ~ 10% variabiliteit uitgeoefende kracht op een kraal naar hiel basis als gevolg van de variabiliteit in korrelgrootte. De toegepaste kracht is evenredig met de hoeveelheid van de korrels en de kraal volume varieert ~ 9% over het gemiddelde (volgens de specificaties).
Figuur 3. Force proteolyse test setup (niet op schaal). Het collageen model trimeer is aan het oppervlak van het dekglaasje via myc / anti-myc conjugatie. De streptavidine gecoate parels superparamagnetische zijn aan het collageen trimeren via een biotine-streptavidine koppeling. Actief MMP-1 snijdt het collageen in de tijd, waardoor de kralen op los te maken van het oppervlak en af te stappen van het brandvlak.
Figuur 4. Schematische tekening van Proteolyse als functie van de tijd. De cartoon toont een voorbeeld gezichtsveld in de tijd als proteolyse optreedt. Na verloop van tijd, MMP-1 snijdt collageen en de kralen verwijderen en verder van het brandvlak onder invloed van het magnetische veld.
Figuur 5. Proteolyse tarieven zijn afhankelijk van de toegepaste kracht 16. Getoond zijn gegevens verzameld bij 1,0 pN (3 uM MMP-1, zwart), 6,2 pN (3 uM MMP-1, rood) en 13 pN (0,2 uM MMP-1; magenta). De tarieven van proteolyse (fit parameters) zijn: 0,22 ± 0,02 min -1 (1 PN), 0,46 ± 0,09 min -1 (6,2 PN), en 2,08 ± 0,18 min -1 (13 PN). De fractie van kralen unproteolyzed op lange tijd de punten (> 15 minuten) ongeveer constant blijft op ~ 0,25 in de verschillende experimenten. Error bars komen overeen met de Poisson statistieken als gevolg van het aantal waarnemingen op elk tijdstip. De fout op elk tijdstip van n korrels n 1/2. De fout in de fractie van de bijgevoegde kralen werd berekend door fout propagation.1 um kralen werden gebruikt voor de 1.0 en 6.2 pN pN experimenten en 2,8 micrometer kralen werden gebruikt voor 13 pN experimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft een nieuwe toepassing voor een klassieke single molecule techniek. Magnetisch pincet laten medium tot high-throughput enkel molecuul testen op een kosten-efficiënte manier. Echter, net als alle andere experimentele technieken zijn er uitdagingen en mogelijke valkuilen.
Beperkingen van magnetische pincet
In vergelijking met een optische val van de ruimtelijke en temporele resolutie van een MT apparaat is laag. Bovendien is de krachten opgewekt door de eenvoudige MT hier beschreven 30 pN of minder, aanzienlijk minder dan krachten routinematig toegankelijk AFM experimenten. Deze beperking kan een deugd zijn: MT zijn zeer geschikt voor de toepassing van sub-PN krachten.
In tegenstelling tot een optische val of AFM conventionele MT, zoals de inrichting hier niet toe de manipulatie van de afzonderlijke deeltjes. Optische vallen worden meestal gebruikt om kracht evenwijdig aan het dekglaasje toe te passen, terwijl de MT zijn het best geschikt voor verticale trekken experimenten. Electromagnetic MT pakken deze beperkingen, maar ten koste van een verhoogde complexiteit.
Tweezer Kalibratie
Zowel de Brownse fluctuaties en de macht spectrum analyse voor van kracht kalibratie hebben hun beperkingen. We vonden dat de Brownse fluctuaties methode is bijzonder gevoelig voor de camera onscherpte. Omdat de frame rate verhoogd (belichtingstijd af) de berekende kracht afgenomen. In de praktijk hebben we verhoogd frame rate tot de krachten berekend op basis van de Brownse fluctuaties in overleg met de krachten berekend met behulp van het spectrum tot binnen 10%. Omgekeerd, het spectrum analyse is meer bestand tegen camera onscherpte, maar iets moeilijker uit te voeren. Wij raden het uitvoeren van beide berekeningen te controleren op de robuustheid van de resultaten.
Wij merken op dat variaties in korrelgrootte en magnetische deeltjes gehalte gevolg variaties in aangebrachte kracht van ~ 10%. Dit effect was niet belangrijk in onze recente experiment zijnomdat we gemiddeld meer dan honderden kralen in elke meting. Er kon echter experimenten die unieke informatie halen uit elke kraal tethered mogelijk een meer nauwkeurige kalibratie methode.
Controls om een punt bijlagen te garanderen
Het bereiken van specifieke, gerichte, op een punt bijlagen is vaak een praktische uitdaging in de bestudering van enkelvoudige moleculen. De volgende controles bevestigd specifieke aanhechting van collageen aan antilichaam, en kralen om collageen:
- Alleen kralen toegevoegd aan een flow cel gepassiveerd met BSA.
- Toegevoegd anti-myc, gepassiveerd met BSA en vervolgens toegevoegd kralen.
- Toegevoegd anti-myc, gepassiveerd met BSA, voegde niet-gebiotinyleerde collageen en vervolgens toegevoegd kralen.
- Gepassiveerd met BSA, toegevoegd niet-gebiotinyleerde collageen en vervolgens toegevoegd kralen.
- Gepassiveerd met BSA, voegde gebiotinyleerd collageen en vervolgens toegevoegd kralen.
- Toegevoegd anti-myc, gepassiveerd met BSA, toegevoegde biotineylated collageen en vervolgens toegevoegd kralen.
In gevallen 1-5, een component van de bijlage serie opzettelijk is weggelaten, werden overal 0 tot 4 kralen gezien aan de stroom cel per veld (80.000 um 2). Alleen indien 6, waarbij de bevestiging groepen aanwezig zijn, hebben wij ~ 30-60 2,8 pm kralen en 80-200 1 pm korrels aan het oppervlak. De Proteolyse kinetiek waargenomen voldoende geschikt door een exponentiële en een constante term die sterk suggereert dat er slechts een snelheidsbepalende stap, en derhalve slechts een ketting. De constante term weerspiegelt waarschijnlijk kralen die niet-specifiek verbonden aan het dekglaasje aan.
Wij rapporteren de concentraties van antilichamen en eiwitten die werkte voor ons experiment. Een groot aantal concentraties voor elke component worden onderzocht bij het ontwikkelen van een nieuwe assay. BSA werkt en een oppervlaktepassivering agent in ons experiment. Echter voldaanhod werkt mogelijk niet in alle omstandigheden. Andere protocollen voor oppervlaktepassivering ook met succes gebruikt. Voorbeelden hiervan zijn polyethyleenglycol gefunctionaliseerd glazen dia's 17, ondersteund lipidendubbellagen 18, of caseïne als een blokkerend middel.
Opmerkingen over data-analyse
In werking proteolyse experimenten er altijd enige niet-specifieke afscheiding (vooral bij hogere krachten 19) door dissociatie van niet-covalente (bijvoorbeeld biotine - streptavidine) interacties. Wij verklaren dit verschijnsel meten proteolyse op verschillende MMP-1-concentraties, waaronder geen MMP-1, zoals beschreven in Adhikari et. al.. meten proteolyse op verschillende MMP-1 concentraties alle krachten kunnen we genereren Michaelis-Menten bochten, waarbij worden gebruikt om de katalytische efficiëntie Kcat / K M van het enzym te berekenen. Anderzijds, als verschillende concentraties van het enzym niet worden gebruikt, raden wijcontrolemeting worden zonder enzym bij de gegeven krachten aftrekken van het percentage niet-specifieke onthechting.
Mogelijke toepassingen
De magnetische pincet bestrijken een breed scala van kracht. De krachten die worden uitgeoefend afhankelijk van de grootte van de korrels. 1 micrometer en 2,8 micrometer kralen overlappen in toegankelijke krachten, en in onze ervaring, met een van de parels op het intermediaire krachten werkt goed.
We verwachten dat soortgelijke experimentele benaderingen kunnen zijn breed toepasbaar in het bestuderen van kracht is afhankelijk van proteolyse 4,20, ontvouwen 21 en bindingsinteracties 22. Wij en andere 23 hebben opgemerkt dat de straal van diffractie ringen voor onscherp kralen gevoelig middel voor het volgen van de positie van de kraal opzichte van de dekglaasje 23 bepaalt. Hoewel over het algemeen niet op deze manier gebruikt, zijn wij van mening dat MT assays de capaciteit om nanometer-precisie-MMO's te bieden hebbenurements van proteïne structurele dynamica. Deze aanvullende informatie kan bijzonder waardevol zijn in de context van geweld-afhankelijke proteolyse of bindend metingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Burroughs Wellcome Career Award op het Wetenschappelijk Interface (ARD), de National Institutes of Health door New Innovator Award van de NIH Director's Programma 1-DP2-OD007078 (ARD), de William Bowes Jr Stanford Graduate Fellowship (ASA ), en aan de Stanford Cardiovascular Institute Jongere Predoctoraal Fellowship (JC). De auteurs danken James Spudich voor lenen microscopie apparatuur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro Cover Glass #1.5 (22x22) | VWR | 48366-067 | |
| Micro Cover Glass #1.5 (22x40) | VWR | 48393-048 | |
| Lambda DNA | Invitrogen | 25250-010 | |
| T4 DNA Ligase | Invitrogen | 15224-041 | |
| Microcon Ultracel YM-100 | Millipore | 42413 | |
| Anti-Digoxigenin | Roche Diagnostics | 11-333-089-001 | |
| Tween 20 | Sigma | P9416-100ML | |
| Anti-myc Antibody | Invitrogen | 46-0603 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | B4287-5G | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 658.01D | |
| Dynabeads MyOne T1 Streptavidin | Invitrogen | 658.01D | |
| p-Aminophenylmercuric Acetate | Calbiochem | 164610 | |
| Biotin-Maleimide | Sigma Aldrich | B1267 | |
| Biotin labeled oligo | IDT DNA | Custom synthesis | |
| Digoxigenin labeled oligo | IDT DNA | Custom synthesis | |
| Collagen peptide gene | DNA 2.0 | Custom synthesis | |
| MMP-1 cDNA | Harvard Plasmid Database | ||
| z-translator | Thorlabs | MTS50 | |
| Servo controller for translator | Thorlabs | TDC001 |
References
- Ingber, D. E. Can cancer be reversed by engineering the tumor microenvironment. Semin. Cancer Biol. 18, 356-364 (2008).
- Hahn, C., Schwartz, M. A. Mechanotransduction in vascular physiology and atherogenesis. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 53-62 (2009).
- Laurens, N., Koolwijk, P., de Maat, M. P.
- Adhikari, A. S., Chai, J., Dunn, A. R. Mechanical Load Induces a 100-Fold Increase in the Rate of Collagen Proteolysis by MMP-1. J. Am. Chem. Soc. 133, (2011).
- Zareian, R. Probing collagen/enzyme mechanochemistry in native tissue with dynamic, enzyme-induced creep. Langmuir. 26, (2010).
- Ellsmere, J. C., Khanna, R. A., Lee, J. M. Mechanical loading of bovine pericardium accelerates enzymatic degradation. Biomaterials. 20, 1143-1150 (1999).
- Jesudason, R. Mechanical forces regulate elastase activity and binding site availability in lung elastin. Biophys. J. 99, 3076-3083 (2010).
- Neuman, K. C., Block, S. M.
- Lee, C. K., Wang, Y. M., Huang, L. S., Lin, S. Atomic force microscopy: determination of unbinding force, off rate and energy barrier for protein-ligand interaction. Micron. 38, 446-461 (2007).
- Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads. Science. 258, 1122-1126 (1992).
- Tanase, M., Biais, N., Sheetz, M.
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat. Methods. 5, 491-505 (2008).
- Frank, S. Stabilization of short collagen-like triple helices by protein engineering. J. Mol. Biol. 308, 1081-1089 (2001).
- Stetefeld, J. Collagen stabilization at atomic level: crystal structure of designed (GlyProPro)10foldon. Structure. 11, 339-346 (2003).
- Chung, L. Collagenase unwinds triple-helical collagen prior to peptide bond hydrolysis. EMBO J. 23, 3020-3030 (2004).
- Bell, G. I. Models for the specific adhesion of cells to cells. Science. 200, 618-627 (1978).
- Selvin, P. R., Ha, T. Single-molecule techniques: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).
- Graneli, A., Yeykal, C. C., Prasad, T. K., Greene, E. C. Organized arrays of individual DNA molecules tethered to supported lipid bilayers. Langmuir. 22, 292-299 (2006).
- Danilowicz, C., Greenfield, D., Prentiss, M. Dissociation of ligand-receptor complexes using magnetic tweezers. Anal. Chem. 77, 3023-3028 (2005).
- Zhang, X., Halvorsen, K., Zhang, C. Z., Wong, W. P., Springer, T. A. Mechanoenzymatic cleavage of the ultralarge vascular protein von Willebrand factor. Science. 324, 1330-1334 (2009).
- Woodside, M. T. Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 6190-6195 (2006).
- del Rio, A. Stretching single talin rod molecules activates vinculin binding. Science. 323, 638-641 (2009).
- Gosse, C., Croquette, V. Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level. Biophys. J. 82, 3314-3329 (2002).
