Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

المضاعفة واحدة جزيء القياسات التحلل البروتيني باستخدام الملقط قوة مغناطيسية

Published: July 25, 2012 doi: 10.3791/3520
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemical Engineering, Stanford University

Summary

في هذه المادة ونحن وصف استخدام ملاقط المغناطيسي لدراسة تأثير القوة على التحلل البروتيني الأنزيمية على الصعيد جزيء واحد بطريقة موازاة للغاية.

Abstract

الجيل والكشف عن القوى الميكانيكية تمثل جانبا من علم وظائف الأعضاء في كل مكان الخلية، وله صلة مباشرة الانبثاث سرطان 1، 2، وتصلب الشرايين التئام الجروح 3. في كل هذه الأمثلة، والخلايا على حد سواء ممارسة القوة على البيئة المحيطة بهم وإعادة تشكيلها في وقت واحد إنزيمي المصفوفة خارج الخلية (ECM). لقد أصبح تأثير قوى على ECM وبالتالي مساحة اهتماما كبيرا لما لها من أهمية على الأرجح في والبيولوجية والطبية 4-7.

تقنيات جزيء واحد مثل الاحتباس بصري 8، ذرية المجهر قوة 9، وملاقط المغناطيسية 10،11 تسمح للباحثين للتحقيق في وظيفة من الإنزيمات على المستوى الجزيئي بما تمارسه القوات على البروتينات الفردية. من هذه التقنيات، ملاقط المغناطيسية (MT) جديرة بالملاحظة لتكلفتها المنخفضة وإنتاجية عالية. MT بذل القوات في نطاق PN 1-100 ~ ميلي ثانية واحدة ويمكن أن توفر القرار موقتا،الصفات التي تتم مطابقة تماما لدراسة آلية انزيم على مستوى واحد جزيء 12. هنا نحن الإبلاغ عن فحص MT موازاة جدا لدراسة تأثير القوة على التحلل البروتيني من جزيئات البروتين وحيد. نقدم المثال محددة من التحلل البروتيني من الببتيد الكولاجين مثلوثي بواسطة مصفوفة الفلزي 1 (MMP-1)، ومع ذلك، يمكن هذا الفحص تتكيف بسهولة لدراسة ركائز أخرى والبروتياز.

Protocol

1. تدفق خلية التحضير

  1. Coverslips (# 1.5، 22x22 مم و 22x40، VWR) يتم تنظيفها باستخدام صوتنة.
    1. إضافة إلى coverslips وعاء زجاجي صغير قادرة على اجراء coverslips وتركيب في sonicator (راجع الخطوة 2).
    2. ملء حاوية مع الأيزوبروبانول ويصوتن في sonicator حمام لمدة 20 دقيقة.
    3. تجاهل الأيزوبروبانول وشطف coverslips مع كميات وفيرة من الماء منزوع الأيونات التي ينتجها جهاز MilliQ Barnsted أو جهاز مماثل. ملء الحاويات بالماء ويصوتن لمدة 20 دقيقة.
    4. بعد صوتنة، تجفيف coverslips في تيار من الهواء التي تمت تصفيتها خالية من الغبار. استخدم coverslips فقط التي تظهر نظيفة (أي لا اللطخات).
    5. بلطف الشعلة coverslips لبضع ثوان لتنظيفها من أي غبار والرطوبة المتبقية: تمرير coverslips من خلال لهب الغاز المنتج مع ناسخ بنسن، مع الحرص على عدم تشوه في ساترة بسبب الحرارة الزائدة. هذه الخطوة يزيل سطح المتبقيةالملوثات.
  2. تستخدم على الوجهين لاصق شفاف، نعلق coverslips اثنين معا. قص الشريط ~ 3 سم في الطول، و 0.3 سم في العرض. نعلق على الشريط ساترة 22x40 ملم ترك قناة سم 1،6 في الوسط. استخدام معلومات سرية ماصة للضغط برفق لأسفل على ساترة للتأكد من أن الشريط التزمت بشكل صحيح.

2. المغناطيسي الملقط الإعداد والمعايرة

  1. وكانت ملاقط المغناطيسية الإعداد باستخدام دائم الأرضية النادرة المغناطيس كما هو موضح سابقا 10،12. تم إنشاء الألومنيوم L-قوس مع ثقب قطره 1 ملم والتي شنت على مترجم-Z العمودي (Thorlabs) لتعديل الإرتفاع من ملاقط. كانت تعلق اثنين دائم الأرضية النادرة المغناطيس إلى قوس على جانبي الثقب لإنشاء فخ مغناطيسي (الشكل 1).
  2. إعداد الحمض النووي: من الحمض النووي من امدا بالعاثية المسمى عند 5 في "و 3" وينتهي مع البيوتين وdigoxigenin (IDT الحمض النووي، وسان دييغو، كاليفورنيا) لمعايرة المجموعة الاستشارية للألغامملاقط المغنطيسية.
    1. خلط 50 ميكرولتر من 4 نانومتر λ-DNA مع 2 ميكرولتر من 40 نانومتر البيوتين قليل النوكليوتيد مترافق والحرارة عند 60 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ثم تبرد ببطء في درجة حرارة الغرفة أكثر من 1 ساعة.
    2. إضافة يغاز الحمض النووي وفقا لمواصفات الشركة الصانعة وligate في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 ساعات.
    3. إضافة 2 ميكرولتر من 400 نيوتن متر قليل النوكليوتيد digoxigenin مترافق واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة.
    4. إضافة 1،5 ميكرولتر من ATP 10 ملم وتستمر عملية ربط من قليل النوكليوتيد ومترافق digoxigenin إلى الحمض النووي λ لمدة 3 ساعات.
    5. [أليغنوكليوتيد] إزالة الزائدة ويغاز الحمض النووي باستخدام 100 مرشحات تدور كيلو دالتون (Microcon Ultracell YM-100). ما مجموعه تبادل عازلة 1000-أضعاف في الشركة المصرية للاتصالات عازلة كافية لإزالة oligos الزائدة. ملاحظة: من المهم عدم استخدام سرعات الدوران> 500xG لأنها تؤدي إلى تقطيع الحمض النووي.
    6. فحص عينة من الحمض النووي عن طريق الكهربائي على هلام الاغاروز 0.7٪ لضمان أن الحمض النووي أناليس من التشويه والتحريف أو المنفصمة.
    7. قياس تركيز الحمض النووي. من المستحسن استخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية فيس Nanodrop (الحرارية العلمية) لأن حجم العينة المتاحة قد تكون صغيرة جدا.
  3. إعداد تدفق الخلايا كما هو موضح في القسم 1.
  4. وعلى الحجز من الحمض النووي للخلية تدفق، إضافة مكافحة digoxigenin الأضداد (الأغنام مفتش؛ 1 ميكروغرام مل -1؛ روش العلوم البيولوجية، مانهايم، ألمانيا) والسماح لها على الانضمام إلى السطح الزجاجي لمدة 15 دقيقة.
  5. إيقاف فاعلية على سطح الخلية لمنع تدفق غير محددة من الحمض النووي الشائكة عن طريق إضافة 2 ملغ مل -1 جيش صرب البوسنة، 0.1٪ توين-20 في برنامج تلفزيوني 1X. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة.
  6. كرر الخطوة 2.5.
  7. إضافة 50 مساء من fuctionalized λ الحمض النووي والسماح لتعلقها على ساترة لمدة 15 دقيقة.
  8. يغسل الحمض النووي مع زيادة PBS 1X.
  9. إضافة حبات superparamagnetic streptavidin المغلفة (الخرز ميكرون 1 = 2 ميكروغرام مل -1؛ الخرز 2.8 ميكرون = 20 ميكروغرام مل -1
  10. يغسل الخرز الزائدة مع PBS 1X.
  11. المغناطيسي الملقط معايرة
    1. تحريك مغناطيس دائم إلى الموقف الذي هو بعيدا عن سطح العينة (> 15 مم).
    2. وضع خلية تدفق المعدة في المجهر.
    3. تحريك مغناطيس دائم في موقف أعلى الخلية التدفق.
    4. اختيار البؤري من λ-DNA الخرز functionalized من خلال التركيز على حبات بعيدا عن الواجهات الزجاجية على حد سواء. الطائرة الصحيح التنسيق هو واحد فيها حبات المطلوب لديها مركز مشرق.
    5. أخذ شريط فيديو من حركة حبة في 80 هرتز أو أكثر لمدة 500 إطارات.
    6. تحريك مغناطيس أقرب إلى سطح العينة. لمسافات تتجاوز 5 ملم، نقل بزيادات 1 مم. لمسافات ما بين 1 و 5 ملم، التحرك في زيادات 0،5 ملم. لمسافات أقل من 1 مم، نقل بزيادات 0.25 ملم.
    7. كرر الخطوات 2.11.5 و 2.11.6 في كل موقف جديد مغناطيس.
    8. لكل البياناتضبط وتعقب مركز من الخرز باستخدام نوبة غاوسي 2D.
    9. حساب قوة عبر تقلبات البراونية باستخدام:

    المعادلة 1
    حيث ك ب T هو الطاقة الحرارية بولتزمان، L هو طول الحمض النووي λ، و<x 2> هو التباين في موقف النقطه الوسطى.

    1. التأكد من دقة القوات عن طريق التحقق من حساب القوة عن طريق صالح طيف Lorentzian قوة من أجل العثور على وتيرة rolloff. ويرتبط تطبيق القوة على وتيرة rolloff بواسطة العلاقة:

    المعادلة 2
    حيث 0 ƒ هو التردد rolloff، وهي دائرة نصف قطرها هو حبة، و μ هي اللزوجة السائل 12.

3. الكولاجين مرفق الببتيد إلى تدفق الخلايا

من أجل تقديم مثال ملموس لتطبيق منهجية لدينا، نحن وصف العمل الذي تم مؤخرا في مختبرنا الذي يميز التحلل البروتيني من الببتيد الكولاجين نموذج مثلوثي. ونحن نتوقع أن يمكن هذا النهج العام تطبيقها على نطاق واسع على البروتينات وغيرها من عديد البيوكليوتيد.

  1. الببتيد الكولاجين نموذج يتكون من محطة N-6X TAG-له لتنقية، تليها علامة 1 myc 5X، (GPP) 10 لفرض الثلاثي تشكيل الحلزون، والكولاجين α1 بقايا 772-786 (GPQGIAGQRGVVGL)، والتي تشكل MMP- 1 موقع الاعتراف، وتسلسل foldon (GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL)، وKKCK C-محطة لتسهيل وصفها مع البيوتين maleimide. Foldon مستمد من fibritin بروتين T4-فج، وتستقر trimers نموذج الكولاجين عندما تنصهر في N إما - أو C-محطة 13،14.
  2. وأعرب عن الببتيد الكولاجين والبروتينات MMP-1 وتنقيته كما هو موضح سابقا 4،15. </ لى>
  3. إضافة مكافحة myc (15 ميكروغرام مل -1) إلى الخلية تدفق واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة للسماح لمكافحة myc لتعلقها على سطح الخلية التدفق.
  4. إيقاف فاعلية الخلية لمنع تدفق غير محددة المرفق من البروتينات باستخدام 5 ملغ مل -1 جيش صرب البوسنة في نفس الطريق كما هو موضح في الخطوة 2.5.
  5. إضافة 150 الببتيد الكولاجين بعد الظهر ويسمح لها نعلق على الأجسام المضادة عن طريق العلامة myc لمدة 45 دقيقة.
  6. يغسل الكولاجين الزائد باستخدام برنامج تلفزيوني العازلة.
  7. إضافة حبات streptavidin superparamagnetic المغلفة (الخرز ميكرون 1 = 2 ميكروغرام مل -1 و 2.8 ميكرون حبات = 20 ميكروغرام مل -1)، والسماح لهم نعلق على جزيئات الكولاجين لمدة 45 دقيقة. وينبغي أن يخفف من الخرز ميكرون من 1 إلى التركيز المطلوب في برنامج تلفزيوني. يجب أن يتم فصل حبات ميكرومتر 3 من حل باستخدام مغناطيس قوي، resolubilized ثم في برنامج تلفزيوني. وينبغي تكرار هذه العملية 3 مرات. لاحظنا أن هذه الخطوة ضرورية لجنرال الكتريكتي حبات ميكرومتر 3 إلى ربط سطح يجمد الببتيد الكولاجين.

4. قوة التحلل البروتيني الفحص

  1. بمجرد أن يتم تجميع هذه الخلية مع تدفق الببتيد الكولاجين وحبات المغناطيسي، وصورة لخلية تدفق في فخ مغناطيسي تحت منخفض، ~ قوة PN 1. في تجربتنا، وأحيانا جزء من السكان من الخرز الالتزام ضعيف إلى السطح بطريقة غير محددة. تطبيق قوة متواضعة يضمن أن هذه الخرزات المحررة.
  2. إضافة انزيم تفعيلها إلى الخلية التدفق. في هذه الحالة كان MMP-1 مفعلة مسبقا وذلك بإضافة 3.5 ملم APMA (4-aminophenylmercuric خلات) وحضنت على 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات. تم التحقق من تفعيل استخدام SDS-PAGE.
  3. حالما يتم الخلية تدفق إعادة إدخالها في جهاز ملاقط المغناطيسي، وتسجيل فيديو تمتد حقول قليلة من رأي، وينتج عادة عدة مئات من الخرز المرفقة. وسيكون هذا ر = 0.
  4. كرر نفس العملية من تسجيل العديد من المجالات من عرض (بينما كان عائدا تيس نفس المجال من رأي) في نقطة زمنية منتظمة، حتى كل فصل حبات أو أي التحلل البروتيني آخر هو ملحوظ.
  5. الحركية تحليل البيانات
    1. عد حبات في مختلف المجالات للعرض في نقاط زمنية مختلفة ومتوسط ​​منهم. تطبيع عدد من الخرز بقسمة متوسط ​​عدد حبات في كل نقطة مرة من قبل عدد من الخرز في تي = 0. وهذا يضمن أن نتمكن من مقارنة معدلات التحلل البروتيني من تجارب مختلفة، وذلك لأن العدد المطلق من الخرز سوف تختلف من تجربة إلى تجربة.
    2. رسم نسبة بوصفها وظيفة من الزمن. في هذه الحالة، مزودة نحن عليه إلى اضمحلال أسى زائد ثابت أ.

    المعادلة 3
    حيث ƒ (ر) هي نسبة من الخرز تعلق (أو جزيئات الكولاجين unproteolyzed)، ر هو الوقت، هو جزء من الخرز التي توليها حبل الكولاجين، (ب) هو معدل الاضمحلال ثابت، و (ج)هو جزء من الخرز التي تعلق غير محدد.

    1. يتم تكرار التجربة نفسها في متفاوتة القوة وتركيزات MMP-1 لإلقاء الضوء على تأثير القوة على التحلل البروتيني الكولاجين بواسطة MMP-1.

5. ممثل النتائج

بروتوكول فوق يصف استخدام رواية من ملاقط المغناطيسية (الشكل 1) لدراسة تأثير القوة على التحلل البروتيني الأنزيمية. نحن معايرة ملاقط ل1 ميكرومتر و 3 حبات ميكرومتر باستخدام كل من حجم التقلبات في البراونية الملاحظة وحساب وتيرة لفة قبالة على مواقع جذب مختلفة (الشكل 2). في تجارب قوة التحلل البروتيني، والإعداد يشبه إلا أن يتم استبدال الحمض النووي مع الكولاجين (أرقام 3، 4). يمكن رسم عدد من الخرز تطبيع المتبقية كما هو وظيفة من الوقت للعثور على معدلات التحلل البروتيني (الشكل 5)، وهذه العملية يمكن أن يكونوكرر لاختلاف تركيز الانزيم والقوات.

الشكل 1
الشكل 1. تخطيطي لعملية معايرة فخ مغناطيسي (وليس على النطاق). اثنين من مغناطيس دائم الأرضية النادرة خلق مجال مغناطيسي أن تسحب على حبة superparamagnetic. ترجمة مغناطيس صعودا وهبوطا يضبط القوة المطبقة. والتقط حبات باستخدام التقليدية مشرق الميدان المجهر مع مرور الضوء من خلال ثقب بين المغناطيس 2 أقحم: الصورة التي اتخذت مع هدف جوي 40X. الحادة، وبقع مستديرة تتوافق مع الخرز تعلق على سطح ساترة. كائنات من خارج التركيز هي حبات منفصلة.

الشكل 2
الشكل 2. كيد قوة معايرة بوصفها وظيفة من مسافة المغناطيس من سطح عينة ل1 ميكرومتر (يسار) و 2.8 ميكرون (يمين) حبةق. وتناسب البيانات إلى وظيفة تجريبية Equation4 ، حيث x هو المسافة من المغناطيس. أ = 31.8، ب = 5.61، و ج = 4.39 لحبات ميكرومتر (1) و= 140، ب = ج = 3،10 و 1،86 لحبات ميكرومتر 3. هذه القيم هي محددة لدينا صك معين والهندسة التجريبية، ويجب معايرة كل آلة على حدة. أشرطة الخطأ في كل نقطة تمثل تقلب ~ 10٪ في القوة المطبقة على حبة حبة على أساس، وذلك بسبب التباين في حجم حبة. القوة المستخدمة غير متناسبة مع حجم من الخرز، وحجم حبة يختلف ~ 9٪ على مدى متوسط ​​(وفقا لمواصفات الشركة المصنعة).

الشكل (3)
الرقم التحلل البروتيني قوة 3. إعداد مقايسة (وليس على النطاق). يتم إرفاق نموذج ترايمر الكولاجين لسطح ساترة عن طريق مالبطاقة الصفراء / تصريف الافعال المعادية للmyc. وترد حبات superparamagnetic streptavidin المغلفة للtrimers الكولاجين عن طريق الربط البيوتين streptavidin. المنشط MMP-1 التخفيضات الكولاجين مع مرور الوقت، مما تسبب في فصل حبات من على سطح الأرض، والابتعاد عن المستوى البؤري.

الشكل 4
الشكل 4. الكرتون تخطيطي من التحلل البروتيني بوصفها وظيفة من الزمن. الرسوم المتحركة تظهر حقل عينة من مشاهدة أكثر من مرة كما يحدث التحلل البروتيني. مع مرور الوقت، MMP-1 التخفيضات الكولاجين والخرز وفصل والابتعاد عن البؤري تحت تأثير المجال المغناطيسي.

الشكل 5
معدلات التحلل البروتيني الشكل 5. تعتمد على قوة التطبيقية 16. أظهرت البيانات التي تم جمعها هي في PN 1.0 (3 ميكرومتر MMP-1، أسود)، 6.2 PN (3 ميكرومتر MMP-1، أحمر) و 13 PN (0.2 ميكرومتر MMP-1؛ بركهNTA). معدلات التحلل البروتيني (معلمات صالح) هي: 0.22 ± 0.02 دقيقة -1 (1 PN)، 0.46 ± 0.09 دقيقة -1 (6.2 PN)، و 2.08 ± 0.18 دقيقة -1 (13 PN). وجزء من الخرز unproteolyzed في نقطة زمنية طويلة (> 15 دقيقة) لا تزال مستمرة في ما يقرب من 0.25 ~ عبر تجارب مختلفة. أشرطة الخطأ تتوافق مع إحصاءات بويسون يعكس عددا من الملاحظات في كل نقطة زمنية. الخطأ في كل نقطة زمنية لحبات n هو رقم 1/2. تم احتساب خطأ في جزء من الخرز التي توليها خطأ استخدمت الخرز ميكرومتر propagation.1 لPN 1.0 و 6.2 PN التجارب والخرز 2.8 ميكرون واستخدمت لاجراء تجارب PN 13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هذا البروتوكول وصفا لاستخدام تقنية جديدة لجزيء واحد الكلاسيكية. ملاقط المغناطيسية تسمح متوسطة إلى عالية الإنتاجية المقايسات جزيء واحد بطريقة فعالة من حيث التكلفة. لكن، مثل كل التقنيات التجريبية هناك تحديات ومخاطر محتملة.

القيود المفروضة على ملاقط المغناطيسية

بالمقارنة مع فخ البصرية القرار المكاني والزماني للجهاز MT منخفضة. وعلاوة على ذلك، فإن القوات التي تم إنشاؤها بواسطة MT بسيط وصفها هنا هي 30 PN أو أقل، أقل بكثير من القوات الوصول إليها بشكل روتيني في التجارب فؤاد. ويمكن أن يكون هذا القيد الفضيلة: هي مناسبة تماما لتطبيق MT الفرعية PN القوات.

وخلافا للمصيدة ضوئية أو فؤاد، MT التقليدية، مثل الجهاز هنا، لا تسمح للتلاعب من الجزيئات الفردية. وعادة ما تستخدم المصائد الضوئية لتطبيق قوة موازية للساترة، بينما MT أفضل مناسبة تماما لسحب رأسي التجارب. Electromagneعرة MT معالجة هذه القيود، على الرغم من ذلك على حساب زيادة التعقيد.

منتاش معايرة

كلا من تقلب البراونية والطاقة تحليل الطيف لمعايرة قوة لها حدودها. وجدنا أن طريقة تذبذب البراونية حساسة بشكل خاص لطمس الكاميرا. كما ارتفع معدل الإطار (زمن التعرض للانخفاض) انخفضت القوة المحسوبة. في الواقع، قمنا بزيادة معدل الإطار إلى أن قوى محسوبة من تقلبات البراونية المتفق عليها مع قوى محسوبة باستخدام طيف الطاقة إلى حدود 10٪. وعلى العكس، تحليل طيف الطاقة هو أكثر قوة ضد طمس الكاميرا، ولكن قليلا من الصعب تنفيذها. نوصي أداء كل العمليات الحسابية للتحقق من مدى متانة النتائج.

نلاحظ أن التغيرات في حجم حبة والمغناطيسية نتيجة محتوى الجسيمات في الاختلافات في القوة المطبقة من 10٪ ~. وكان هذا التأثير ليس مهما في تجربتنا الأخيرة أن تكونتسبب لنا المتوسط ​​على مدى مئات من الخرز في كل قياس. ومع ذلك، يمكن أن التجارب التي انتزاع معلومات فريدة من نوعها من كل حبة المربوطة قد يقتضي طريقة معايرة أكثر دقة.

ضوابط لضمان إرفاق نقطة واحدة

تحقيق، موجهة نحو معين، نقطة واحدة المرفقات وغالبا ما يكون التحدي العملي في دراسات جزيء واحد. وأكد عناصر التحكم التالية مرفق معين من الكولاجين لالأضداد، والخرز على الكولاجين:

  1. وأضاف حبات فقط إلى خلية تدفق تخميلها مع جيش صرب البوسنة.
  2. وأضاف لمكافحة myc والخرز تخميلها مع جيش صرب البوسنة، وأضاف بعد ذلك.
  3. وأضاف لمكافحة myc، تخميلها مع جيش صرب البوسنة، وأضاف غير المعقدة البيروكسيديز الكولاجين وأضاف ثم الخرز.
  4. وأضاف تخميلها مع جيش صرب البوسنة، غير المعقدة البيروكسيديز الكولاجين والخرز وأضاف بعد ذلك.
  5. وأضاف تخميلها مع جيش صرب البوسنة، والكولاجين المعقدة البيروكسيديز والخرز وأضاف بعد ذلك.
  6. وأضاف لمكافحة myc، وأضاف البيوتين تخميلها مع جيش صرب البوسنة،ylated الكولاجين والخرز وأضاف بعد ذلك.

في حالات 1-5، حيث سقط عمدا بعض العناصر المكونة لسلسلة التعلق، وشوهدت في أي مكان من 0-4 حبات تعلق على خلية تدفق في مجال الرؤية (80،000 ميكرومتر 2). فقط في حالة 6، حيث كل الأنصاف المرفقات موجودة، ولم نرى ~ 30-60 2.8 ميكرون، وحبات الخرز 1 80-200 ميكرون تعلق على السطح. لاحظ حركية التحلل البروتيني وتناسب على نحو كاف من جانب واحد زائد الأسي لمدة ثابتة، الأمر الذي يوحي بقوة بأن هناك صينا واحدة معدل الحد خطوة، وبالتالي سوى حبل واحد. على المدى المستمر يعكس على الأرجح الخرز التي هي على وجه التحديد غير موصولة إلى ساترة.

نحن الإبلاغ عن تركيزات من الأجسام المضادة والبروتين الذي يعمل لتجربتنا. ينبغي النظر في مجموعة واسعة من التركيزات لكل عنصر عند تطوير فحص جديد. عمل ديوان الرقابة المالية فضلا عن وكيل سطح التخميل في تجربتنا. ومع ذلك، اجتمع هذاقد هود لا تعمل في جميع الظروف. كما تم بروتوكولات أخرى لالتخميل السطح تستخدم بنجاح. ومن الأمثلة على ذلك مادة البولي ايثيلين جلايكول الشرائح الزجاجية functionalized 17، طبقات ثنائية الدهون أيد 18، أو الكازين كعامل عرقلة.

ملاحظات حول تحليل البيانات

في التجارب التحلل البروتيني قوة، وهناك دائما بعض مفرزة غير محددة (وخاصة عند ارتفاع قوى 19) بسبب تفكك (على سبيل المثال البيوتين - streptavidin) غير التساهمية التفاعلات. نحن مسؤولة عن هذه الظاهرة من خلال قياس التحلل البروتيني بتركيزات MMP-1 شتى، بما في ذلك أي MMP-1، كما هو موضح في أديكاري آخرون. آل. التحلل البروتيني قياس بتركيزات MMP-1 مختلف عن كل القوى يسمح لنا لتوليد ميكايليس-Menten المنحنيات، حيث يتم استخدامها لحساب الحفاز القط ك كفاءة / K M من الانزيم. بدلا من ذلك، إذا لم يتم استخدام تركيزات مختلفة من الانزيم، نوصيينبغي القيام به لقياس سيطرة مع عدم وجود الانزيم في القوات نظرا إلى طرح قبالة نسبة غير محددة مفرزة.

التطبيقات المحتملة

وملاقط المغناطيسية تغطي مجموعة واسعة قوة. القوى التي يمكن أن تمارس يتوقف على حجم الخرز. 1 ميكرومتر والخرز 2.8 ميكرون تتداخل في القوات الوصول إليها، وفي تجربتنا، وذلك باستخدام أي من الخرز على قوات وسيطة تعمل بشكل جيد.

ونحن نتوقع أن النهج التجريبي مماثلة قد تكون قابلة للتطبيق على نطاق واسع في دراسة التحلل البروتيني قوة تعتمد على 4،20، 21، والتفاعلات التي تتكشف ملزم 22. لقد لاحظنا وغيرهم (23) بأن دائرة نصف قطرها من حلقات الحيود للتخلص من الخرز التركيز يوفر وسيلة حساسة لتتبع موقف نسبي حبة إلى ساترة 23. على الرغم من أن عادة لا تستخدم في هذه الطريقة، ونحن نعتقد أن المقايسات طن متري لديها القدرة على توفير نانومتر دقة الاتفاقات البيئية المتعددة الأطرافurements ديناميات البروتين الهيكلي. هذا قد يكون من المفيد حصول على معلومات إضافية لا سيما في سياق القوة التي تعتمد على التحلل البروتيني أو القياسات ملزم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل شهادة جائزة بوروز ويلكوم في واجهة العلم (ARD)، والمعاهد الوطنية للصحة من خلال مدير المعاهد الوطنية للصحة الجديد المبتكر برنامج جائزة-1-DP2 OD007078 (ARD)، وباوز وليام الابن ستانفورد زمالة دراسات عليا (ASA )، والقلب والأوعية الدموية ستانفورد زمالة معهد Predoctoral الأصغر سنا (JC). المؤلفان بالشكر جيمس Spudich لإعارة معدات الفحص المجهري.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Micro Cover Glass #1.5 (22x22) VWR 48366-067
Micro Cover Glass #1.5 (22x40) VWR 48393-048
Lambda DNA Invitrogen 25250-010
T4 DNA Ligase Invitrogen 15224-041
Microcon Ultracel YM-100 Millipore 42413
Anti-Digoxigenin Roche Diagnostics 11-333-089-001
Tween 20 Sigma P9416-100ML
Anti-myc Antibody Invitrogen 46-0603
Bovine Serum Albumin Sigma B4287-5G
Dynabeads M-280 Streptavidin Invitrogen 658.01D
Dynabeads MyOne T1 Streptavidin Invitrogen 658.01D
p-Aminophenylmercuric Acetate Calbiochem 164610
Biotin-Maleimide Sigma Aldrich B1267
Biotin labeled oligo IDT DNA Custom synthesis
Digoxigenin labeled oligo IDT DNA Custom synthesis
Collagen peptide gene DNA 2.0 Custom synthesis
MMP-1 cDNA Harvard Plasmid Database
z-translator Thorlabs MTS50
Servo controller for translator Thorlabs TDC001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ingber, D. E. Can cancer be reversed by engineering the tumor microenvironment. Semin. Cancer Biol. 18, 356-364 (2008).
  2. Hahn, C., Schwartz, M. A. Mechanotransduction in vascular physiology and atherogenesis. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 53-62 (2009).
  3. Laurens, N., Koolwijk, P., de Maat, M. P. Fibrin structure and wound healing. J. Thromb. Haemost. 4, 932-939 (2006).
  4. Adhikari, A. S., Chai, J., Dunn, A. R. Mechanical Load Induces a 100-Fold Increase in the Rate of Collagen Proteolysis by MMP-1. J. Am. Chem. Soc. 133, (2011).
  5. Zareian, R. Probing collagen/enzyme mechanochemistry in native tissue with dynamic, enzyme-induced creep. Langmuir. 26, (2010).
  6. Ellsmere, J. C., Khanna, R. A., Lee, J. M. Mechanical loading of bovine pericardium accelerates enzymatic degradation. Biomaterials. 20, 1143-1150 (1999).
  7. Jesudason, R. Mechanical forces regulate elastase activity and binding site availability in lung elastin. Biophys. J. 99, 3076-3083 (2010).
  8. Neuman, K. C., Block, S. M. Optical trapping. Rev. Sci. Instrum. 75, 2787-2809 (2004).
  9. Lee, C. K., Wang, Y. M., Huang, L. S., Lin, S. Atomic force microscopy: determination of unbinding force, off rate and energy barrier for protein-ligand interaction. Micron. 38, 446-461 (2007).
  10. Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads. Science. 258, 1122-1126 (1992).
  11. Tanase, M., Biais, N., Sheetz, M. Magnetic tweezers in cell biology. Methods Cell Biol. 83, 473-493 (2007).
  12. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat. Methods. 5, 491-505 (2008).
  13. Frank, S. Stabilization of short collagen-like triple helices by protein engineering. J. Mol. Biol. 308, 1081-1089 (2001).
  14. Stetefeld, J. Collagen stabilization at atomic level: crystal structure of designed (GlyProPro)10foldon. Structure. 11, 339-346 (2003).
  15. Chung, L. Collagenase unwinds triple-helical collagen prior to peptide bond hydrolysis. EMBO J. 23, 3020-3030 (2004).
  16. Bell, G. I. Models for the specific adhesion of cells to cells. Science. 200, 618-627 (1978).
  17. Selvin, P. R., Ha, T. Single-molecule techniques: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).
  18. Graneli, A., Yeykal, C. C., Prasad, T. K., Greene, E. C. Organized arrays of individual DNA molecules tethered to supported lipid bilayers. Langmuir. 22, 292-299 (2006).
  19. Danilowicz, C., Greenfield, D., Prentiss, M. Dissociation of ligand-receptor complexes using magnetic tweezers. Anal. Chem. 77, 3023-3028 (2005).
  20. Zhang, X., Halvorsen, K., Zhang, C. Z., Wong, W. P., Springer, T. A. Mechanoenzymatic cleavage of the ultralarge vascular protein von Willebrand factor. Science. 324, 1330-1334 (2009).
  21. Woodside, M. T. Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 6190-6195 (2006).
  22. del Rio, A. Stretching single talin rod molecules activates vinculin binding. Science. 323, 638-641 (2009).
  23. Gosse, C., Croquette, V. Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level. Biophys. J. 82, 3314-3329 (2002).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 65، الهندسة الكيميائية، الفيزياء، واحدة جزيء التحليل الطيفي، وملاقط المغناطيسي، والتحلل البروتيني قوة، والكولاجين، MMP-1
المضاعفة واحدة جزيء القياسات التحلل البروتيني باستخدام الملقط قوة مغناطيسية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Adhikari, A. S., Chai, J., Dunn, A.… More

Adhikari, A. S., Chai, J., Dunn, A. R. Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers. J. Vis. Exp. (65), e3520, doi:10.3791/3520 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter