In questo articolo si descrivono l'uso di una pinzetta magnetici per studiare l'effetto della forza sulla proteolisi enzimatica a livello di singola molecola in modo altamente parallelizzabile.
La generazione e la rilevazione delle forze meccaniche è un aspetto onnipresente della fisiologia cellulare, con rilevanza diretta per metastasi tumorali 1, 2 e aterogenesi la guarigione della ferita 3. In ciascuno di questi esempi, le cellule sia esercitare una forza sul loro ambiente e contemporaneamente enzimaticamente rimodellare la matrice extracellulare (ECM). L'effetto delle forze di ECM è diventata così una zona di notevole interesse per la sua importanza biologica e medica probabile 4-7.
Tecniche di singola molecola come intrappolamento ottico 8, 9 microscopia a forza atomica, e pinzette magnetici 10,11 consentono ai ricercatori di sondare la funzione di enzimi a livello molecolare esercitando forze su singole proteine. Di queste tecniche, pinzette magnetiche (MT) si distinguono per il loro basso costo ed elevate prestazioni. MT esercitare forze nell'intervallo di 1-100 ~ pN e può fornire risoluzione temporale millisecondo,qualità che sono ben abbinate allo studio del meccanismo enzimatico a singola molecola di livello 12. Qui riportiamo un saggio MT altamente parallelizzabile per studiare l'effetto della forza sulla proteolisi di singole molecole proteiche. Presentiamo l'esempio specifico della proteolisi di un peptide collagene trimerico da metalloproteinasi della matrice 1 (MMP-1), tuttavia, questa analisi può essere facilmente adattato per studiare altri substrati e proteasi.
Questo protocollo descrive un nuovo uso per una tecnica classica singola molecola. Pinzette magnetiche consentono medio high-throughput saggi singola molecola in un modo economicamente efficiente. Tuttavia, come tutte le tecniche sperimentali ci sono sfide e le insidie potenziali.
Limitazioni di pinzette magnetiche
Rispetto ad una trappola ottica la risoluzione spaziale e temporale di un apparato MT è bassa. Inoltre, le forze generate dal MT semplice qui desc…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato supportato dal Career Award Burroughs Wellcome a livello di interfaccia scientifico (ARD), il National Institutes of Health tramite il programma New Innovator il direttore NIH Award 1-DP2-OD007078 (ARD), il William Bowes Jr. Stanford Graduate Fellowship (ASA ), e la Stanford Cardiovascular Institute Fellowship Giovane Predoctoral (JC). Gli autori ringraziano James Spudich prestito attrezzature per microscopia.
Name of Reagent | Company | Catalogue Number |
Micro Cover Glass #1.5 (22×22) | VWR | 48366-067 |
Micro Cover Glass #1.5 (22×40) | VWR | 48393-048 |
Lambda DNA | Invitrogen | 25250-010 |
T4 DNA Ligase | Invitrogen | 15224-041 |
Microcon Ultracel YM-100 | Millipore | 42413 |
Anti-Digoxigenin | Roche Diagnostics | 11-333-089-001 |
Tween 20 | Sigma | P9416-100ML |
Anti-myc Antibody | Invitrogen | 46-0603 |
Bovine Serum Albumin | Sigma | B4287-5G |
Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 658.01D |
Dynabeads MyOne T1 Streptavidin | Invitrogen | 658.01D |
p-Aminophenylmercuric Acetate | Calbiochem | 164610 |
Biotin-Maleimide | Sigma Aldrich | B1267 |
Biotin labeled oligo | IDT DNA | Custom synthesis |
Digoxigenin labeled oligo | IDT DNA | Custom synthesis |
Collagen peptide gene | DNA 2.0 | Custom synthesis |
MMP-1 cDNA | Harvard Plasmid Database | |
z-translator | Thorlabs | MTS50 |
Servo controller for translator | Thorlabs | TDC001 |