Summary
In questo articolo si descrivono l'uso di una pinzetta magnetici per studiare l'effetto della forza sulla proteolisi enzimatica a livello di singola molecola in modo altamente parallelizzabile.
Abstract
La generazione e la rilevazione delle forze meccaniche è un aspetto onnipresente della fisiologia cellulare, con rilevanza diretta per metastasi tumorali 1, 2 e aterogenesi la guarigione della ferita 3. In ciascuno di questi esempi, le cellule sia esercitare una forza sul loro ambiente e contemporaneamente enzimaticamente rimodellare la matrice extracellulare (ECM). L'effetto delle forze di ECM è diventata così una zona di notevole interesse per la sua importanza biologica e medica probabile 4-7.
Tecniche di singola molecola come intrappolamento ottico 8, 9 microscopia a forza atomica, e pinzette magnetici 10,11 consentono ai ricercatori di sondare la funzione di enzimi a livello molecolare esercitando forze su singole proteine. Di queste tecniche, pinzette magnetiche (MT) si distinguono per il loro basso costo ed elevate prestazioni. MT esercitare forze nell'intervallo di 1-100 ~ pN e può fornire risoluzione temporale millisecondo,qualità che sono ben abbinate allo studio del meccanismo enzimatico a singola molecola di livello 12. Qui riportiamo un saggio MT altamente parallelizzabile per studiare l'effetto della forza sulla proteolisi di singole molecole proteiche. Presentiamo l'esempio specifico della proteolisi di un peptide collagene trimerico da metalloproteinasi della matrice 1 (MMP-1), tuttavia, questa analisi può essere facilmente adattato per studiare altri substrati e proteasi.
Protocol
1. Cella di flusso Preparazione
- Vetrini coprioggetto (# 1.5, 22x22 mm e 22x40 millimetri, VWR) vengono puliti con ultrasuoni.
- Aggiungere i coprioggetti ad un piccolo contenitore di vetro capace di contenere coprioggetto e montaggio nel sonicatore (vedi punto 2).
- Riempire il contenitore con isopropanolo e sonicare in un bagno sonicatore per 20 minuti.
- Eliminare l'isopropanolo e sciacquare i coprioggetti con abbondanti quantità di acqua deionizzata prodotta da un apparato Barnsted MilliQ o un dispositivo simile. Riempire il contenitore con acqua e ultrasuoni per 20 minuti.
- Dopo sonicazione, asciugare i coprioggetti in un flusso di filtrata, priva di polvere nell'aria. Utilizzare solo i coprioggetto che appaiono puliti (cioè senza sbavature).
- Delicatamente i coprioggetti fiamma per alcuni secondi per pulirli di eventuali residui di polvere e umidità: passano i coprioggetti attraverso una fiamma del gas prodotto con un becco Bunsen, facendo attenzione a non deformare il coprioggetti a causa del calore in eccesso. Questa fase rimuove superficie residuacontaminanti.
- Utilizzando del nastro biadesivo scotch, collegare i due coprioggetti insieme. Tagliare il nastro ~ 3 cm di lunghezza e 0,3 cm di larghezza. Fissare il nastro su coprioggetto 22x40 millimetri lasciando un canale di 1,6 cm al centro. Utilizzare un puntale per premere delicatamente verso il basso sul vetrino per garantire che il nastro è correttamente rispettati.
2. Magnetic Tweezers Setup e calibrazione
- Pinzette magnetiche erano installazione utilizzando permanenti magneti in terre rare come descritto in precedenza 10,12. Un alluminio L-staffa è stato costruito con un foro 1 mm di diametro e montato su un verticale z traduttore (Thorlabs) per modulare l'altezza delle pinzette. Due permanenti magneti in terre rare sono stati attaccati alla staffa su entrambi i lati del foro per creare la trappola magnetica (Figura 1).
- Preparazione del DNA: DNA fago lambda marcato al suo 5 'e 3' termina con biotina e digossigenina (IDT DNA, San Diego, CA) è stato usato per calibrare il MAGpinzette magnetiche.
- Mescolare 50 pl di 4 nM λ-DNA con 2 pl di 40 nM biotina oligonucleotide coniugato e scaldare a 60 ° C per 10 minuti. Poi, lentamente raffreddare a temperatura ambiente per 1 ora.
- Aggiungere DNA ligasi secondo le specifiche del costruttore e legare a temperatura ambiente per 3 ore.
- Aggiungere 2 microlitri di 400 nM oligonucleotide digossigenina coniugato ed incubare a temperatura ambiente per 45 minuti.
- Aggiungere 1,5 microlitri di 10 mM ATP e continuare ligazione dell'oligonucleotide digossigenina coniugato alla λ-DNA per 3 ore.
- Rimuovere gli oligonucleotidi in eccesso e la DNA ligasi con 100 filtri di spin kDa (Microcon Ultracell YM-100). Un totale di 1000 volte scambio tampone in tampone TE è sufficiente a rimuovere i oligonucleotidi eccesso. Nota: è importante non utilizzare velocità di rotazione> 500xG perché porterà al taglio del DNA.
- Esaminare un campione di DNA tramite elettroforesi su un gel di agarosio 0,7% per garantire che il DNA is non denaturato o tranciati.
- Misurare la concentrazione di DNA. L'uso di un NanoDrop UV-Vis spettrofotometro (Thermo Scientific) è raccomandato poiché il volume del campione disponibile può essere molto piccolo.
- Preparare celle di flusso come descritto nella sezione 1.
- Per il fissaggio del DNA alla cella a flusso, aggiungere anticorpo anti-digossigenina (pecora IgG; 1 mg mL -1; Bioscience Roche, Mannheim, Germania) e consentono di aderire alla superficie di vetro per 15 minuti.
- Passivazione della superficie della cella di flusso per prevenire non-specifica incollaggio di DNA aggiungendo 2 mg mL -1 BSA, 0,1% Tween-20 in PBS 1x. Incubare a temperatura ambiente per 45 minuti.
- Ripetere il punto 2.5.
- Aggiungere 50 pM di fuctionalized λ-DNA e permettono di allegare al vetrino per 15 minuti.
- Lavare via il DNA in eccesso con PBS 1x.
- Aggiungere streptavidina-perle rivestite superparamagnetiche (1 perline micron = 2 mg mL -1; 2,8 perle um = 20 pg mL -1
- Lavare via perline in eccesso con PBS 1x.
- Magnetic Tweezers calibrazione
- Spostare i magneti permanenti ad una posizione che è lontano dalla superficie del campione (> 15 mm).
- Posizionare la cella preparato flusso nel microscopio.
- Spostare i magneti permanenti in posizione sopra la cella di flusso.
- Scegliere il piano focale di λ-DNA perline funzionalizzati concentrandosi sui talloni da entrambe le superfici di vetro. Il piano focale corretta è quella in cui le perle desiderati hanno un centro luminoso.
- Prendete un video del movimento del tallone a 80 Hz o maggiore di 500 frames.
- Spostare il magnete vicino alla superficie del campione. Per distanze superiori a 5 mm, si muovono in incrementi di 1 mm. Per distanze comprese tra 1 e 5 mm, si muovono in incrementi di 0,5 mm. Per distanze inferiori a 1 mm, si muovono in incrementi di 0,25 mm.
- Ripetere i punti 2.11.5 e 2.11.6 ad ogni nuova posizione del magnete.
- Per ciascun datoimpostare, monitorare il centro delle sfere utilizzando una vestibilità 2D gaussiana.
- Calcolare la forza tramite le fluttuazioni browniani utilizzando:
dove k B T è l'energia termica Boltzmann, L è la lunghezza di λ-DNA, e <x 2> è la varianza in posizione centroide.- Confermare l'accuratezza delle forze controllando il calcolo della forza tramite un fit Lorentzian spettro di potenza al fine di trovare la frequenza attenuazione. Forza applicata è legata alla frequenza di attenuazione dalla relazione:
Dove 0 ƒ è la frequenza rolloff, a è il raggio tallone, e μ è la viscosità del fluido 12.
3. Collagene Allegato Peptide alle celle di flusso
Per fornire un esempio concreto per l'applicazione del nostro metodo, si descrive un recente lavoro nostro laboratorio che caratterizza la proteolisi di un peptide trimerico modello collagene. Prevediamo che questo approccio generale può essere diffusamente applicate ad altre proteine e polinucleotidi.
- Il peptide modello collagene è costituito da un N-terminale 6x His-tag per la purificazione, seguita da un tag 5x myc, (GPP) 10 per applicare formazione tripla elica, il collagene a1 residui 772-786 (GPQGIAGQRGVVGL), che costituiscono la MMP- 1 sito di riconoscimento, la sequenza foldon (GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL), ed un C-terminale per facilitare KKCK etichettatura con biotina-maleimide. Foldon deriva dal fago T4-fibritin proteina, e stabilizza trimeri modello collagene quando fuse sia nella N - o C-terminale 13,14.
- Il peptide collagene e MMP-1 proteine sono state espresse e purificate come descritto in precedenza 4,15. </ Li>
- Aggiungere anti-myc (15 pg ml -1) alla cella a flusso e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti per consentire l'anti-myc per attaccarsi alla superficie della cella di flusso.
- Passivazione della cella di flusso per prevenire non-specifica fissaggio di proteine usando 5 mg mL -1 BSA allo stesso modo come descritto al punto 2.5.
- Aggiungere 150 pM peptide di collagene e permettono di allegare l'anticorpo tramite il tag myc per 45 minuti.
- Lavare via collagene in eccesso con tampone PBS.
- Aggiungi perle rivestite di streptavidina superparamagnetiche perle (1 micron = 2 mg ml -1 e 2,8 perline micron = 20 mg ml -1) e consentire loro di attaccare le molecole di collagene per 45 minuti. Le perle di 1 micron deve essere diluito fino alla concentrazione desiderata in PBS. Le perle 3 um deve essere separato dalla soluzione tramite magneti, poi risolubilizzato in PBS. Questo processo deve essere ripetuto 3 volte. Abbiamo notato che questo passaggio è essenziale per la get le 3 perle micron di legarsi alla superficie-peptide immobilizzato collagene.
4. Forza proteolisi Assay
- Una volta che la cella a flusso è assemblato con il peptide collagene e biglie magnetiche, l'immagine cella di flusso nella trappola magnetica in basso, ~ 1 forza pN. Nella nostra esperienza, una sottopopolazione delle perle è talvolta debolmente aderire alla superficie in un modo non specifico. L'applicazione della forza modesta assicura che queste perle sono liberati.
- Aggiungere enzima attivato alla cella a flusso. In questo caso MMP-1 è stato pre-attivato con l'aggiunta di 3,5 mM APMA (4-aminophenylmercuric acetato) e incubate a 37 ° C per 3 ore. L'attivazione è stata verificata mediante SDS-PAGE.
- Appena la cella di flusso viene nuovamente introdotto nell'apparecchio magnetico pinzette, registrare un video estende alcuni campi di vista, tipicamente ottenendo diverse centinaia perline allegate. Questo sarà t = 0.
- Ripetere lo stesso processo di registrazione di diversi campi di vista (mentre tornava tO lo stesso campo di vista) in punti regolari di tempo, fino a tutte le perline si staccano o non proteolisi più è percepibile.
- Kinetic analisi dei dati
- Contare le perline nei vari campi di vista a tempi diversi e loro media. Normalizza il numero di perle dividendo il numero medio di perline in ogni punto temporale per il numero di perle di t = 0. In questo modo siamo in grado di confrontare i tassi di proteolisi da diversi esperimenti, perché il numero assoluto di perline sarà diverso da esperimento esperimento.
- Tracciare il rapporto in funzione del tempo. In questo caso, abbiamo montato un decadimento esponenziale più una costante.
dove ƒ (t) è il rapporto delle perline allegate (o molecole di collagene unproteolyzed), t è il tempo, a è la frazione di sfere collegate da una ritenuta collagene, b è il tasso costante di decadimento, ecè la frazione di perle che sono attaccate in modo non specifico.- Lo stesso esperimento viene ripetuto a varie forze e MMP-1 concentrazioni di chiarire l'effetto della forza sulla proteolisi collagene di MMP-1.
5. Risultati rappresentativi
Il protocollo sopra descrive un nuovo uso di pinzette magnetico (Figura 1) per studiare l'effetto della forza sulla proteolisi enzimatica. Abbiamo calibrato le pinzette di 1 um e 3 perline micron utilizzando sia l'ampiezza delle fluttuazioni osservati browniani e calcolo del roll-off frequenza diverse posizioni magneti (Figura 2). In esperimenti di proteolisi delle forze, la configurazione è simile tranne che il DNA viene sostituito con collagene (figure 3, 4). Il numero normalizzato di perline rimanenti possono essere tracciate in funzione del tempo per trovare le tariffe proteolisi (Figura 5), e questo processo può essereripetuto per diverse concentrazioni degli enzimi e forze.
Figura 1. Schematica del processo di calibrazione magnetico trappola (non in scala). Due magneti permanenti terre rare creare un campo magnetico che tira sulla superparamagnetico tallone. Tradurre il magnete su e giù regola la forza applicata. Le perle vengono esposte con un convenzionale in campo chiaro microscopio con la luce che passa attraverso un forellino fra i due magneti Inset:. Immagine ripresa con un obiettivo 40x aria. I taglienti, macchie rotonde corrispondono ai talloni attaccati alla superficie coverslip. Gli out-of-focus oggetti sono perle indipendenti.
Figura 2. Grafici della forza calibrata in funzione della distanza dal magnete superficie del campione di 1 micron (sinistra) e 2,8 micron (a destra) di tallones. I dati sono stati adatti alla funzione empirica 
, Dove x è la distanza dal magnete. A = 31,8, b = 5,61, e c = 4,39 per le perle 1 um e uno = 140, b = 3,10 e c = 1,86 per le perle 3 micron. Questi valori sono specifici per il nostro strumento specifico e geometria sperimentale, e ciascuno strumento deve essere calibrato individualmente. Le barre di errore in ciascun punto rappresenta una variabilità ~ 10% in forza applicata su una base di tallone tallone, a causa della variabilità di dimensioni del tallone. La forza applicata è proporzionale al volume delle perline, e il volume tallone varia ~ 9% rispetto alla media (secondo le specifiche del costruttore).
Figura 3. Forza test di setup proteolisi (non in scala). Il modello trimero collagene è attaccato alla superficie del vetrino via mYC / anti-myc coniugazione. Le perle rivestite con streptavidina superparamagnetici sono attaccati alle trimeri collagene tramite un legame di biotina-streptavidina. Attivato MMP-1 tagli il collagene nel tempo, causando le perline a staccarsi dalla superficie e si allontana dal piano focale.
Figura 4. Cartone schematica di proteolisi in funzione del tempo. La vignetta mostra un campo di campione di vista nel corso del tempo, come accade proteolisi. Nel tempo, MMP-1 tagli il collagene e le perline staccare e allontanarsi dal piano focale sotto l'influenza del campo magnetico.
Tassi di proteolisi Figura 5. Dipendono forza applicata 16. Vengono mostrati i dati raccolti a 1,0 pN (3 uM MMP-1, nero), 6,2 pN (3 uM MMP-1, rosso) e 13 pN (0,2 uM MMP-1; magoNTA). I tassi di proteolisi parametri (fit) sono: 0,22 ± 0,02 min -1 (1 pN), 0,46 ± 0,09 min -1 (6,2 PN), e 2,08 ± 0,18 min -1 (13 PN). La frazione di perle unproteolyzed a tempi lunghi (> 15 minuti) resta pressoché costante a ~ 0,25 in diversi esperimenti. Le barre di errore corrispondono alle statistiche Poisson che riflette il numero di osservazioni in ogni punto. L'errore ad ogni tempo di perline n n è 1/2. L'errore nella frazione di perline attaccate è stato calcolato errore propagation.1 perle um sono stati utilizzati per pN 1,0 e 6,2 esperimenti pN e 2,8 um perline sono state usate per gli esperimenti pN 13.
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Discussion
Questo protocollo descrive un nuovo uso per una tecnica classica singola molecola. Pinzette magnetiche consentono medio high-throughput saggi singola molecola in un modo economicamente efficiente. Tuttavia, come tutte le tecniche sperimentali ci sono sfide e le insidie potenziali.
Limitazioni di pinzette magnetiche
Rispetto ad una trappola ottica la risoluzione spaziale e temporale di un apparato MT è bassa. Inoltre, le forze generate dal MT semplice qui descritte sono pN 30 o meno, molto meno forze normalmente accessibili in esperimenti AFM. Questa limitazione può essere una virtù: MT sono adatti per l'applicazione di sub-pN forze.
A differenza di una trappola ottica o AFM, MT convenzionale, come l'apparecchiatura qui, non consentono la manipolazione delle singole particelle. Trappole ottici sono usati solitamente per applicare una forza parallela al vetrino, mentre MT sono più adatti per esperimenti di trazione verticali. Elettromagnetismotic MT questi limiti, anche se a costo di una maggiore complessità.
Tweezer calibrazione
Sia la fluttuazione browniano e analisi dello spettro di potenza per la taratura in forza hanno i loro limiti. Abbiamo trovato che il metodo di fluttuazione browniano è particolarmente sensibile a sfocatura telecamera. Poiché il frame rate è aumentato (tempo di esposizione ridotto) la forza calcolata diminuito. In pratica, abbiamo aumentato il frame rate fino a quando le forze calcolate dalle fluttuazioni browniani concordato con le forze calcolate utilizzando lo spettro di potenza entro il 10%. Al contrario, l'analisi dello spettro di potenza è più forte contro fotocamera blur, ma leggermente più difficile da attuare. Si consiglia di eseguire entrambi i calcoli per verificare la robustezza dei risultati.
Prendiamo atto che le variazioni in termini di dimensioni del tallone e magnetici risultato contenuto di particelle in variazioni di carico applicato al ~ 10%. Questo effetto non era importante nel nostro recente esperimento essereperché noi media su centinaia di perle in ogni misurazione. Tuttavia, gli esperimenti che estraggono informazioni univoche da ogni tethered tallone potrebbe richiedere un metodo di calibrazione più accurata.
I controlli per garantire gli allegati a punto singolo
Il raggiungimento di specifici, orientati, single-point allegati è spesso una sfida pratica negli studi di singola molecola. I controlli successivi hanno confermato allegato specifico del collagene all'anticorpo, e perline al collagene:
- Aggiunto perline solo in una cella di flusso passivato con BSA.
- Aggiunto anti-myc, perline passivato con BSA e quindi aggiunto.
- Aggiunto anti-myc, passivato con BSA, ha aggiunto non biotinilato collagene e quindi aggiunto perline.
- Passivato con BSA, ha aggiunto non biotinilato collagene e perline poi aggiunto.
- Passivato con BSA, ha aggiunto collagene biotinilato e perline poi aggiunto.
- Aggiunto anti-myc, passivato con BSA, ha aggiunto biotinacollagene ylated e perline poi aggiunti.
In casi 1-5, in cui alcuni componenti della serie allegato è stato volutamente omessi, ovunque da 0 a 4 perle sono state viste attaccata alla cella di flusso per campo di vista (80.000 um 2). Solo in caso 6, in cui tutte le porzioni di fissaggio sono presenti, abbiamo visto ~~~HEAD=NNS 30-60 2.8 perline 80-200 micron e 1 micron perline attaccate alla superficie. La cinetica proteolisi osservati siano adeguatamente forma da un esponenziale singolo e di un termine costante, il che suggerisce fortemente che vi è un solo fattore limitante, e quindi solo una pastoia singolo. Il termine costante probabilmente riflette perline che non sono specificamente attaccato al vetrino.
Riportiamo le concentrazioni di anticorpi e proteine che hanno lavorato per il nostro esperimento. Una vasta gamma di concentrazioni di ogni componente deve essere esaminato durante lo sviluppo di un nuovo saggio. BSA ha funzionato bene come agente di superficie passivazione nel nostro esperimento. Tuttavia, questo ha incontratoHod potrebbe non funzionare in tutte le circostanze. Altri protocolli per la passivazione della superficie sono stati utilizzati con successo. Gli esempi includono polietilene glicole vetrini funzionalizzati 17, doppi strati lipidici supportati 18, o caseina come un agente bloccante.
Note sulla analisi dei dati
In esperimenti di proteolisi forza, c'è sempre un non-specifica distacco (specialmente alle alte forze 19) a causa della dissociazione di non-covalenti (ad esempio biotina - streptavidina) interazioni. Abbiamo spiegare questo fenomeno misurando proteolisi a varie concentrazioni di MMP-1, incluse senza MMP-1, come descritto in Adhikari et. al. proteolisi di misura a varie concentrazioni di MMP-1 per tutte le forze ci permette di generare Michaelis-Menten curve, in cui vengono utilizzati per calcolare l'efficienza catalitica cat k / K M dell'enzima. In alternativa, se diverse concentrazioni di enzima non vengono utilizzati, si consiglia diuna misurazione di controllo avvenire senza enzima alle forze date per sottrarre sconto sulla tariffa di non-specifica distacco.
Le possibili applicazioni
Le pinzette magnetiche coprono una vasta gamma forza. Le forze che possono essere esercitate dipendono dalla dimensione delle perle. 1 micron e 2,8 micron perline si sovrappongono nelle forze accessibili, e nella nostra esperienza, utilizzando una delle perle alle forze intermedie funziona bene.
Anticipiamo che simili approcci sperimentali possono essere generalmente applicabili a studiare proteolisi dipendente forza 4,20, 21 e svolgimento interazioni di legame 22. Noi e altri 23 hanno notato che il raggio di anelli di diffrazione di perline per fuoco fornisce un mezzo sensibile per tracciare la posizione del relativo tallone al vetrino 23. Anche se non è generalmente usata in questo modo, riteniamo che MT saggi hanno la capacità di fornire nanometri precisione measurements della dinamica delle proteine strutturali. Questa informazione aggiuntiva può essere particolarmente utile nel contesto della forza dipendente dalla proteolisi o misurazioni di legame.
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Disclosures
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal Career Award Burroughs Wellcome a livello di interfaccia scientifico (ARD), il National Institutes of Health tramite il programma New Innovator il direttore NIH Award 1-DP2-OD007078 (ARD), il William Bowes Jr. Stanford Graduate Fellowship (ASA ), e la Stanford Cardiovascular Institute Fellowship Giovane Predoctoral (JC). Gli autori ringraziano James Spudich prestito attrezzature per microscopia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro Cover Glass #1.5 (22x22) | VWR | 48366-067 | |
| Micro Cover Glass #1.5 (22x40) | VWR | 48393-048 | |
| Lambda DNA | Invitrogen | 25250-010 | |
| T4 DNA Ligase | Invitrogen | 15224-041 | |
| Microcon Ultracel YM-100 | Millipore | 42413 | |
| Anti-Digoxigenin | Roche Diagnostics | 11-333-089-001 | |
| Tween 20 | Sigma | P9416-100ML | |
| Anti-myc Antibody | Invitrogen | 46-0603 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | B4287-5G | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 658.01D | |
| Dynabeads MyOne T1 Streptavidin | Invitrogen | 658.01D | |
| p-Aminophenylmercuric Acetate | Calbiochem | 164610 | |
| Biotin-Maleimide | Sigma Aldrich | B1267 | |
| Biotin labeled oligo | IDT DNA | Custom synthesis | |
| Digoxigenin labeled oligo | IDT DNA | Custom synthesis | |
| Collagen peptide gene | DNA 2.0 | Custom synthesis | |
| MMP-1 cDNA | Harvard Plasmid Database | ||
| z-translator | Thorlabs | MTS50 | |
| Servo controller for translator | Thorlabs | TDC001 |
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