Summary
כדי להשיג דיכוי האוכלוסייה של Aedes aegypti באמצעות® RIDL (שחרור של חרקים הנושאים קטלני דומיננטי) מערכת, מספר גדול של יתושים זכר צריך להשתחרר. זה דורש שימוש בטכניקות גידול המוני וטכנולוגיה כדי לספק מערכות אמינות כדי להשיג את המספר המרבי של יתושים זכר באיכות גבוהה.
Abstract
טכניקות ושיטות חדשות מבוקשות כדי לנסות לנצח בקרב נגד יתושים. ההתקדמות האחרונה בטכניקות מולקולריות הובילה לפיתוח שיטות חדשות וחדשניות לבקרת יתושים המבוססות על טכניקת החרקים הסטריליים (SIT)1-3. שיטת בקרה המכונה RIDL (שחרור חרקים הנושאים קטלני דומיננטי)4, מבוסס סביב SIT, אבל משתמש בשיטות גנטיות כדי להסיר את הצורך קרינה-עיקור5-8. זן RIDL של Ae. aegypti נבדק בהצלחה בתחום גרנד קיימן9,10; שימוש נוסף בשדה מתוכנן או מתבצע במדינות אחרות ברחבי העולם.
גידול המוני של חרקים הוקם במספר מיני חרקים וברמות של מיליארדים בשבוע. עם זאת, אצל יתושים, גידול בוצע בדרך כלל בקנה מידה קטן בהרבה, עם גידול בקנה מידה גדול ביותר שבוצע בשנות השבעים והשנות ה -80. עבור תוכנית RIDL רצוי לשחרר כמה שפחות נקבות ככל האפשר כפי שהם נושכים ולהעביר מחלות. בתוכנית גידול המונית ישנם מספר שלבים כדי לייצר את הזכרים להשתחרר: ייצור ביצים, גידול ביצים עד גור, ולאחר מכן מיון זכרים מנקבות לפני השחרור. זכרים אלה משמשים לאחר מכן עבור תוכנית בקרת RIDL, שוחרר כמו גולם או מבוגרים11,12.
כדי לדכא אוכלוסיית יתושים באמצעות RIDL מספר גדול של מבוגרים גברים באיכות גבוהה צריך להיות גדל13,14. להלן מתאר את השיטות לגידול המוני של OX513A, זן RIDL של Ae. aegypti 8, לשחרור ומכסה את הטכניקות הדרושות לייצור ביצים וגידול המוני זכרים RIDL עבור תוכנית בקרה.
Introduction
יתושים להעביר פתוגנים רבים שיכולים לגרום למגוון של מחלות בבני אדם ושליטה יתושים אלה כבר קרב מתמשך במשך מאות שנים. אסטרטגיות לשלוט חרקים המבוססים על שיטות כימיות וביולוגיות היו כמה הצלחות בולטות, אבל במקרים רבים השליטה לא היה בר קיימא בטווח הארוך. לדוגמה, ברזיל השיגה חיסול של Ae. aegypti בשנות ה -50 אבל היתוש התחדש במהלך 40-50 השנים האחרונות. זה יכול להיות מיוחס לגורמים רבים, כולל עמידות קוטלי חרקים, נזק סביבתי, יישום תוכנית בקרהלקויה 15-20, ואת reinvasion מהיר ללא ניטור הולם או תגובה.
טכניקות ושיטות חדשות מבוקשות כדי לנסות לנצח בקרב הזה נגד יתושים. ההתקדמות האחרונה בטכניקות מולקולריות הובילה לפיתוח שיטות חדשות וחדשניות לבקרת יתושים המבוססות על טכניקת החרקים הסטריליים (SIT)1-3. שיטת בקרה המכונה RIDL (שחרור חרקים הנושאים קטלני דומיננטי)4 מבוססת סביב SIT, אך משתמשת בשיטות גנטיות כדי להסיר את הצורך בחיטוי קרינה. זני RIDL נבנו עבור מספר מינים מזיקים כולל Ae. aegypti 5-8, זן RIDL של Ae. aegypti נבדק בהצלחה בשדה בגרנד קיימן9,10; שימוש נוסף בשדה מתוכנן או מתבצע במדינות אחרות ברחבי העולם. דיכוי אוכלוסיות יתושים באמצעות RIDL ידרוש מספר רב של מבוגרים גברים באיכות גבוהה להיות גדל3,14.
עבור תוכנית SIT זה נחשב רצוי לשחרר רק גברים; נקבות יתושים נושכות ומעבירות מחלות. בנוסף, הזכרים סטריליים שוחרר יכול להיות "מוסח" על ידי הנקבות ששוחררו הפחתת יעילות התוכנית. שחרור לגברים בלבד הוכח כיעיל פי 3-5 משחרור מעורב-מין בניסויי שדה גדולים עם זבובי פירות ים תיכוניים מוקרנים21.
בתוכנית גידול המוני RIDL, ישנם מספר שלבים לייצור הזכרים לשחרור. הראשון הוא לייצר את הביצים הנדרשות לייצור המהדורה (איור 1). השלב הבא הוא לגדל את הביצים דרך גולם או מבוגרים, הפרדת זחלים מגולם ואת הגומי הגברי מן הגומה הנשית. הפרדה בקנה מידה גדול של זכרים מן הנקבות דורש הבדל בין המינים בשלב חיים מסוים מתאים מיון המוני22. ב Ae. aegypti (ומינים יתושים אחרים) יש הבדל גודל משמעותי בין גולם זכר ונקבה אשר ניתן לנצל עבור טכניקות הפרדת מין. הזכרים RIDL ממוינים לאחר מכן משוחררים בתוכנית בקרה כמו גם גולם או כמבוגרים11,12.
להלן תיאור השיטות לגידול המוני של OX513A, זן RIDL של Ae. אגיפטי, לשחרור. השיטות המתוארות מכסות את הטכניקות הנדרשות לייצור ביצים וזכרי RIDL עבור תוכנית בקרה.
Protocol
דרישות חרקים
1. סקירה כללית
- לגידול המוני יש מספר שלבים, שכל אחד מהם מבוצע באזור נפרד של יחידת גידול המסה. איור 1 מציג את השלב העיקרי של גידול והיכן הם מתרחשים במתקן גידול ההמונים.
2. שיקולי אבטחה ביולוגית לחרק
- הפרויקט אושר על ידי הוועדה לאתיקה של בעלי חיים מאוניברסיטת סאו פאולו - ברזיל וכל האישורים הדרושים הושגו.
- מערכת RIDL משתמשת בקטלניות מותנית; תוסף תזונה (טטרציקלין) מונע את הביטוי של מערכת RIDL המאפשרת לגדל את החרקים במסה; ללא טטרציקלין היתושים מתים. טטרציקלין לא נמצא באתרי הרבייה של Ae. aegypti בטבע כך שכל צאצא המופק מהבורחים לא ישרוד. זה מוסיף רמה נוספת של ביטחון על שימוש חרקים מסוג בר (WT) מעוקרים בשיטות אחרות(כלומר קרינה).
- השתמש בכניסה לדלת כפולה, שלטי "כוח אדם מורשה בלבד" ומסכי חרקים בחרק. כל החלונות צריכים להיות אטומים כדי למנוע זיהום של המושבה עם חרקים WT ולעזור למנוע בריחה מתוך החרקים.
- לתקנות ולרשויות המקומיות עשויות להיות דרישות ספציפיות נוספות או חלופיות. צרו קשר עם הרשויות הרלוונטיות לקבלת מידע/הדרכה בשלב מוקדם, ואבטחו את כל האישורים והאישורים הדרושים לפני הקמת זן RIDL בחרק.
- יש להשתמש בגידול המוני של חרקים רק לגידול RIDL. זנים או חרקים אחרים לא צריכים להיות נוכחים. זה כדי למנוע זיהום של זן RIDL וזיהום עם פתוגנים שעלולים להשפיע על כושר והישרדות, הפחתת הפרודוקטיביות והיעילות של גברים משוחררים.
3. עיצוב חרקים
- איור 2 מציג תוכנית של חרקים המשמשים בביופאבריקה מוסקאם בברזיל.
- הטמפרטורה של כל החדרים הייתה 26 מעלות צלזיוס ± 2) עם לחות יחסית כ 70 - 80% ו 12: 12 שעות אור: מחזור כהה באמצעות רצועות אור פלואורסצנטי.
- ניתן לשנות תוכנית זו בהתאם לדרישות שטח ספציפיות, למשל קנה המידה של המהדורה יקבע את הגודל הכולל. עם זאת ייצור הביצים, גידול ומיון, בקרת איכות (QC) ושחרורים יש להפריד לארבעה תחומים נפרדים: מושבת ייצור ביצים, ייצור שחרור, QC, ואחסון למבוגרים לשחרור.
- חדר מושבת ייצור הביצים (כ-20מ')משמש לייצור ביצים לייצור ביצים.
- אזור בקרת האיכות הוא המקום בו נערכים ניסויים לבדיקת נהלים וכושר קו RIDL כולל מדידות של קצב הצוהר, מספרי גולם, גודל גולם ומדידת האפקטיביות של מיון והסרת נקבות. בדיקות נערכות גם עבור זיהום WT על ידי בדיקת נוכחות של סמן פלואורסצנטי ופנוטיפ באמצעות מבחני קיזוז מדידת קטלניות.
- חדר יצירת השחרור (כ 36 מ'2)דורש מקום הולם עבור מגשים מיון של זחלים וגולם. המגשים מוחזקים במדפי אלומיניום ייעודיים. אזור עבודה וכיור גדולים נדרשים לגידול ומיון וכיור גדול נוסף נדרש לשטיפת מגשים וכלובים. מלכודת תפיסת מסנן נכללה בשקע מי השפכים מהכיורים כדי למתן את הבריחה של יתושים חיים דרך הביוב.
- כל המים המשמשים את המגשים הוא השליך דרך ניקוז, אשר יש תא המכיל רשת המונעת בריחה של חרקים בכל שלב של התפתחות.
- אזור נדרש לאחסון מבוגרים לשחרור (אחסון למבוגרים לשחרור, איור 2)המכיל ארון תקשורת להחזקת התקני השחרור בזמן שהמבוגרים מתבגרים לפני השחרור.
שיטות ייצור לגידול המוני RIDL:
מושבת ייצור הביצים מייצרת את הביצים המשמשות בדור השחרור (איור 1) לייצור מבוגרים. ישנם קווי דמיון רבים בשתי שיטות גידול אבל גם כמה הבדלים ברורים. תהליכי גידול זהים עבור שני ההליכים מתוארים בסעיף מושבת ייצור הביצים בלבד.
מושבת ייצור ביצים
4. ייצור זחל
מושבת ייצור הביצים מייצרת ביצי OX513A RIDL הומוזיגיות8 לדור השחרור. בקרת איכות גבוהה מבטיחה כדאיות, כושר ושלמות מאמץ של הביצים המסופקות.
- הגירוי לבקיעה הוא שקיעה במים עם רמה נמוכה של חמצן מומס. כדי להפחית את רמת החמצן במים, מחממים מים עד שהם רותחים ומיד מניחים 400 מ"ל לתוך 500 מ"ל צנצנות זכוכית (74 מ"מ פתיחת היקף), להדק את המכסה בבטחה ולהשאיר בטמפרטורת החדר במשך כמה שעות כדי להתקרר.
- שים 1 גרם של ביצים לתוך צנצנת של מים רותחים, reseal ולחכות שעה. מעבירים את התכולה למגש עם 2 ליטר מים ומשאירים לילה בתנאים חרקים.
- מניחים את הזחלים שבקעו לתוך נפח ידוע של מים ומערבבים באמצעות stirrer מגנטי פרעושים מספיק זמן לקחת aliquots; ערבוב נמרץ או לזמן ממושך פוגע בזחלים ויש לשמור אותם למינימום. הנפח הסטנדרטי המשמש לבקוע זחלים הוא 1 L, אולם צפיפות של יותר מ 300 זחלים / מיליליטר קשה לספור ועלול להזיק. לכן לא בוקעים יותר מ 300,000 ביצים / ליטר מים.
- לקבוע את קצב הצוהר על ידי לקיחת שלושה 1 מיליליטר aliquots והנחת על גיליון של נייר סופג, עם רשת של 1 ס"מ ריבועים, על גבי ספוג סופג כדי לספוג את כל המים העודפים. לספור את מספר הביצים בקעו ללא מים משלושה ריבועים על ידי מחפש את הכובע החסר של ביצה בקעה. צפוי שיעור צוהר סביב 80-90%.
- קח ארבעה aliquots של 1 מיליליטר כל מקום לתוך ארבע סירות שחורות לשקול (זחלים הם לבנים ולכן גלוי יותר על רקע שחור) ולספור את מספר הזחלים החיים נוכח בעין; מומלץ להשתמש במונה. המספר הממוצע של זחלים למ"ל משמש לאחר מכן כדי לחשב את נפח המים להוסיף על כל מגש כדי לקבל את המספר הרצוי של זחלים למגש.
- יכולים להיות הבדלים גדולים בצפיפות שבה ניתן לגדל זחלים בין זנים ומינים. רצוי גם להשוות את גודל הזכר הבוגר RIDL לזכרים מסוג פראי; באופן אידיאלי אתה רוצה דומה זכרים RIDL בגודל גדול יותר שיכול להתחרות בהצלחה עם זכרים פראיים. לכן עבור כל זן RIDL הצפיפות האידיאלית של זחלים צריך להיקבע והוא פשרה נגד אילוצי שטח לגידול ואת קנה המידה של הייצור. צפיפויות הנעות בין 0.1-2.5 זחלים /מיליליטר מצאנו להיות שילוב טוב של תפוקת ייצור ואיכות; נדון גם על ידי מדיצ'י23.
- מוסיפים את הזחלים למגשים. במתקן שלנו אנו משתמשים במגשים בגודל של כ 53 ס"מ x 37 ס"מ x 8 ס"מ (L x W x H) ואת כמות המים הנדרשת כדי להשיג את צפיפות הזחלים לייצור.
- הוסף תמיסת מלאי של טטרציקלין (3 מ"ג / מ"ל במים) למגשים בדילול 1:100 כדי להשיג את הריכוז הסופי הנדרש של 30 מיקרוגרם / מיליליטר.
- להאכיל זחלים עם מזון דגים פתיתים(www.sera.de)מדי יום, אשר נמחץ אבקה דקה. טבלה 1 מציגה את משטר ההאכלה הטיפוסי במ"ג מזון לזחלים ליום. להאכיל זחלים עד היום המתאים של מיון בתנאים חרקים שתוארו לעיל.
5. מיון זחלים מגפם וגלפות זכר/נקבה
- מיין זחלים מגפם 8 ימים לאחר הבקיעה על ידי הפרדת הזחלים מהגלמים. ואז סקס ממיין את הגומי לזכרים. מכשיר המכונה מפריד לוחות24,25 יכול למיין זחלים מגול זכר ומן הגומי הנשי. איור 3 ממחיש את השימוש במפריד לוחות זה כדי להפריד זחלים מהזכר ומהגלמים הנשיים.
- באמצעות כף מדידה עם רשת בתחתית, לכייל אותו עם 500 גולמים או יותר ולהשתמש בו כדי להגדיר כלובים ולהעריך את הכמות הכוללת של זכרים ונקבות גולם המיוצר.
- ביום הראשון של המיון (יום 8) רוב הגומים הם זכרים, אז הניחו את הזחלים הממוינים בחזרה למגש ואחוריים עד למחרת כאשר רוב הגומים הם נקבות(איור 4).
- חזור על תהליך המיון בכל יום כמתואר בשלבים 2.1-2.3 עד שכל הזחלים יצוצו או עד סוף שבוע עבודה.
- מניחים 1,000 גולם זכר (באמצעות כף המדידה) בכלוב וביום 9 מוסיפים 3,000 גולם נקבה לאותו כלוב (אנו משתמשים בצינורות PVC בגובה 30 ס"מ ובקוטטר 30 ס"מ המותאמים עם חולצת רשת וחור גישה מרושת, אך כלובי פלסטיק בגודל 30 ס"מ x 30 ס"מ זמינים גם מ- BugDorm).
- אפשר למבוגרים להזדווג לפחות 2 ימים ולספק להם פתרון סוכרוז (10%) על ליביטום מודעת כותנה רטובה לפני האכלת דם. לאסוף ביצים במשך שבועיים (~ שני מחזורים gonotrophic) עם שתי הזנות דם בשבוע. זה מניב בממוצע 143,000 ביצים מכלוב של 3,000 נקבות (ממוצע של 48 ביצים / נקבה). לייצור 4 מיליון ביצים בשבוע יש להקים כ-28 כלובים מדי שבוע.
6. האכלת דם
- מערכת הזנת צלחת אלומיניום מספקת לכלובים דם פעמיים בשבוע. כיס דם נוצר בצד צלחת אלומיניום (10 ס"מ x 10 ס"מ x 3 מ"מ) עם Parafilm (איור 5). כדי לעודד האכלה, הדם מתחמם על ידי הנחת שקית שעועית מחוממת על גבי מאכיל צלחת. שקית שעועית כללה כ 250 גרם של גרגרי חיטה בשקית בד, אשר מחומם במשך כ 10 שניות במיקרוגל. הדם שאנו משתמשים בו להאכלה הוא מבית מטבחיים מקומי; כמו בעלי חיים אלה (בעיקר עזים וכבשים) הם לצריכה אנושית הם נבדקים כדי למנוע נוכחות של פתוגנים.
- שלושה ימים לאחר האכלת הדם, מסופק אתר הנחה לנקבות להטיל את ביציהן. אתר oviposition הוא מיכל פלסטיק עגול מלא בערך 1/4 עם מים ונייר סינון המכסה את החלק הפנימי. יומיים לאחר מכן האתר הוסר. לייצור ביצים מקסימלי, ודאו שנייר המסנן מכסה את כל המשטח הזמין בתוך המיכל ונשאר רטוב.
- מוציאים את נייר הביצה ומניחים על נייר סופג לייבוש בתנאים חרקים; ביצים דורשות תקופה של התניה בלחות גבוהה (מעל 70%) של לפחות 48 שעות לאחר שהונח. ביצים ניתן להשאיר חרקים עד 3 חודשים עם ירידה מינימלית בקצב הצוהר, כל עוד הלחות נשמרת גבוה25.
- מושבת ייצור הביצים צריכה להיות בגודל מספיק כדי לספק את מספר הביצים הנדרש על בסיס שבועי לתוכנית השחרור. המתקן המתואר לעיל יכול לייצר כ -4 מיליון ביצים עם 28 כלובים שהוקמו מדי שבוע. מומלץ לשמור מספיק ביצים מאוחסנות כדי להבטיח לפחות 4 שבועות של ביצים לייצור ייצור שחרור מושבה לייצור ביצים.
הפקת מהדורה
7. ייצור זחלים
תהליכי הבקיעה, ההגדלה והמיון של דור השחרור זהים לשיטה שתוארה קודם לכן למושבת ייצור הביצים. עם זאת, היקף הייצור הוא הרבה יותר גדול וזה דורש יותר מגשים ומאמץ נוסף.
8. מיון זחלים, גולם זכר, ו נקבת גולם
- המיון של זחלים, גולם זכר וגומה נקבית זהה לשיטה המתוארת לייצור ביצים.
- לאחר מיון הגומה הגברית חשוב לבדוק זיהום נשי לפני השחרור; לא צריך להיות יותר מ 1% נקבות נוכחים. קח שלושה aliquots של 500 גולם (שלוש כפות מדידה אקראיות גולם) ולספור את מספר הגומי הנשי הנוכחי. ניתן לזהות נקבות מכיוון שהן בדרך כלל גדולות יותר מהזכרים ומהבדלים בצורת האונה של איברי המין (איור 6)27. אם יש יותר מ 1% נקבות הם צריכים להזדקק ולבדוק שוב.
- השתמש רק הזכרים מהיום 8 ו 9 לשחרור; אוטוקלאב כל הזחלים והגלמי הנותרים. בברזיל, יש להתייחס לפסולת זו באותו אופן כמו פסולת רפואית, אך התקנות עשויות להיות שונות במדינות אחרות. אין להשתמש בגלפים ובזחלים נשיים מדור השחרור למושבת ייצור הביצים בשל הבדלים בבקרת האיכות, בגידול ובזיהום ממספרים גדולים יותר ובבקרת איכות נמוכה יותר.
אחסון למבוגרים לשחרור: הכניסו גברים למכשירי שחרור כדי שיצצו ויתבגרו לפני השחרור. פרטי התקני ההפצה אינם מכוסים בשיטה זו. עם זאת, הקיבולת של מכשירי השחרור שאנו משתמשים בהם היא כ-1,000 זכרים. פרטי שיטת ההפצה (התקן הפצה ומערכת הפצה) אינם מכוסים בשיטה זו.
Representative Results
תוצאות הגור הצפויות לייצור מוצגות באיור 4. הזכרים גורים ראשונים, מגיעים לשיאם ביום השמיני והנקבות מגיעות לשיא ביום ה-9 לאחר הבקיעה. חשוב למדוד עקומת גור זו כדי לדעת את הזמן הטוב ביותר למיין זכרים מנקבות.
תוצאות מלמעלה מ-6 חודשים של מיון גולם זכר ונקבה מראות כי הזיהום הנשי עומד בממוצע על 0.02% (איור 5; SEM = 0.004%). שיעור זיהום זה מייצג רק 400 נקבות שפורסמו במשך חודש של שחרורים (כשני מיליון זכרים). ייצור הביצים הנוכחי בשבוע הוא 4 מיליון. מתוכם, 3.5 מיליון בוקעים למושבת ביצים וייצור כאשר השאר מאוחסנים לגיבוי. כ-11% מהביצים משמשות לייצור ביצים ושאריות לייצור ביצים. קצב בקעת הביצים הממוצע 87.3% (SEM = 0.5%) ותשואה של גולם זכר מזחלי L1 ממוצעים 29.5% (SEM = 1.2). שני מיליון זחלים גדלים מדי שבוע עבור מושבת דור השחרור המייצרת כ-571,000 גולמים זכריים (SEM = 14,000). גולם ותמותה למבוגרים במהלך הופעת ושחרור ממוצעים 5%, וכתוצאה מכך כ 543,000 (SEM = 13,000) שוחרר יתושים זכר בוגר בשבוע. זה צפוי הייצור הנוכחי של 4 מיליון ביצים בשבוע יכול להיות מופחת ~ 3 מיליון בשבוע עם אופטימיזציה נוספת כדי להפחית את ההפסד מבזבוז ואחסון. בסך הכל דרושים 6 עובדים להפקה המתוארת; ארבעה עובדים על ייצור שחרור והשניים הנותרים במושבת הביצים.
בקרת איכות
בקרת איכות חיונית לשמירה על איכות המבוגרים, יעילות גידול, עבודה ועלויות.
בקרת פנוטיפ טרנסג'ין
על מנת לאמת ביטוי גנים RIDL שני פקדים מבוצעים, ראשית כדי לבדוק את הביטוי של סמן פלואורסצנטי ושנית כדי לבדוק את הביטוי של תכונת הקטלניות RIDL בהיעדר טטרציקלין. כל הזחלים צריכים לבטא את סמן הפלואורסצנט. כדי לבדוק אם סמן הפלואורסצנט מבוטא כצפוי, 2,000 זחלי instar הראשון נבדקים תחת סטריאומיקרוסקופ לייקה MZFLIII עם מסנן DsRed2 (טקסס אדום) כדי לקבוע אם כל אנשים שאינם פלואורסצנטיים קיימים. ללא טטרציקלין הגן RIDL מתבטא ואנו מצפים 3-4% הישרדות למבוגרים8. כדי לבדוק זאת, מגש נוסף מוגדר עבור כל אצוות שחרור ללא טטרציקלין. ההבדל היחיד לגידול רגיל הוא שהמזון מצטמצם ב -2/3 מהיום השישי מכיוון שהצטברות של מזון עודף עקב זחלים מתים עלולה לגרום לצמיחה חיידקית עודפת.
בקרת גידול
ארבעה מגשים מדור ההפצה נבחרים באופן אקראי למיון ולספר בנפרד. מספר הגומיים הזכריים והנקביים נרשם בכל מגש מדי יום (איור 4). כל סטייה מהמספר הצפוי של זכרים ונקבות מצביעה על בעיה פוטנציאלית שעלולה להשפיע על הייצור ו/או הכושר וניתן להשוות אותה למושבת הביצים כדי לקבוע את מקור הבעיות.
מדידות גולם
גודל גולם הוכח להיות בקורלציה עם גודל מבוגר28. כבקרת איכות לגודל מבוגר רוחב cephalothorax נמדד של לפחות 30 גולם זכר עבור כל יום מיון מדור השחרור; עבור מושבת ייצור הביצים נמדדים גם גולמים נקבה. רוחב cephalothorax הממוצע היה 1.05 מ"מ (SEM 0.005) עבור זכרים משוחררים ו 1.04 מ"מ (SEM = 0.006) ו 1.29 מ"מ (SEM = 0.006) עבור זכרים ונקבות בהתאמה ייצור ביצים, מושבה; תוצאות דומות התקבלו עבור Ae. albopictus מסה גידול24.
איור 1. שלבים של גידול המוני יתושים לשימוש בתוכנית RIDL / SIT. למושבת ייצור הביצים יש רמה גבוהה של בקרת איכות כדי להבטיח את איכות הביצים המסופקות לדור השחרור. ביצים גדלות דרך גולם במושבת השחרור, שם הזכרים ממוינים מהנקבות. המבוגרים הזכרים משמשים לאחר מכן עבור תוכנית הבקרה RIDL.
איור 2. סכמטי של מתקן גידול לייצור זכרים RIDL עבור תוכנית שחרור. ביצים איכותיות מיוצרות ללא הרף בחדר מושבת ייצור הביצים ולאחר מכן גדלות דרך גולם בחדר דור השחרור. הזחלים והגלמים מופרדים לאחר מכן והגלמים ממוינים למין עבור גברים. הזכרים מוצבים לאחר מכן במכשירי שחרור ומורשים להבשיל למבוגרים לשחרור בחדר האחסון והשחרור למבוגרים.
איור 3. הפרדת זחלים, גולם זכר, וגומה נקבה באמצעות מפריד צלחת26. מפריד הלוחות משתמש בהבדל הגודל בין זחלים, גולמים זכריים וגול נקבי כדי למיין את שלושת שלבי החיים השונים האלה; זחלים נוטים להיות קטנים יותר מאשר גולם זכר אשר בתורו קטן יותר מאשר גולם נקבה. המכשיר כולל שתי צלחות זכוכית; אחד קבוע למסגרת מתכת מלוכסנת והשני יושב על גבי הלוח הראשון וניתן להזיזו יחסית לראשון באמצעות ארבעה ברגים לכוונון(A). ארבעת בורגי ההתאמה מאפשרים להגדיר את הלוח החיצוני בזווית ללוח האחורי כך שנוצר חלל בצורת טריז בין הלוחות, המתחדד כלפי מטה. זחלים וגולים נשפכים בין צלחות הזכוכית(B)ונשטפים בעדינות באמצעות צינור מים(C). על ידי התאמת הזווית של הצלחת, זחלים, גולם זכר וגומה נקבה ניתן להפריד (D). עם שטיפה רציפה והגדלת זווית הצלחת ניתן לשטוף את הזחלים דרך הראשון (לתוך מסננת), ואחריו את הגלם הגברי ולבסוף את הגלם הנשי.
איור 4. עקומות גור עבור מסה גדל RIDL Ae. aegypti. גרף זה מראה את האחוז הממוצע גור עבור המוני גדל RIDL זכר ונקבה גולם במהלך 23 שבועות תצפית עם ~ 135,000 גולם התאושש בשבוע. קווי שגיאה = שגיאת תקן של ממוצע, n = 23. באוסף הראשון (יום 8) התאוששנו בממוצע 59% זכר ו 30% גולם נקבה מן הגומי הכולל התאושש מגשים מעל 5 ימים.
איור 5. זיהום נשי ממוצע של גולם זכר ממוין. גרף זה מציג את האחוז החודשי של זיהום נשי במהלך מיון גברים ביום 8 לאחר הבקיעה במשך תקופה של שישה חודשים.
איור 6. מערכת מאכיל דם צלחת אלומיניום. הצלחת(B)מכוסה בפרפילם(A)ודם צנרת לתוך כיס ולאחר מכן אטום(D). הצלחת מונחת על כלוב ומחוממת על ידי הנחת שקית שעועית מחוממת(C)על גבי(E).
איור 7. הבחנה בין זכר לנקבה Ae. גולם aegypti. Ae. גולם aegypti יכול להיות מין אמין על ידי ההבדלים בצורת האונה המין (בסוף קטעי הבטן pupal ממש מתחת משוטים). בנוסף, זכרים נוטים גם להיות קטנים יותר מאשר נקבות.
שולחן 1. משטר האכלה כללי לזחלי Ae. aegypti RIDL (מ"ג מזון לזחל ליום). כדי לחשב את כמות המזון הנדרשת בפועל, הכפל את המספר הכולל של הזחלים למגש.
Discussion
RIDL היא שיטה יעילה ובטוחה לסביבה של שליטה יתושים3,29-31. הטכניקה חלה על תוכנית משולבת לניהול מזיקים ורוב שיטות הבקרה הנוכחיות, כולל קוטלי זחלים, הפחתת אתרי רבייה וקוטלי מבוגרים תואמות לטכנולוגיה זו. שיטה זו מתארת כיצד לייצר עד 570,000 גדיים זכר RIDL בשבוע לשימוש בשליטה של Ae. Aegypti ולידיעה שלנו זהו התיאור הראשון של הייצור של יתושים מהונדסים בקנה מידה זה. כמה מערכות ייצור דומות פותחו עבור סוג פראי Ae. aegypti בשנות ה -60 וה-70 25, אולם לא היה ייצור דומה בקנה מידה זה מאז. בברזיל כ-11 מיליון גברים שוחררו מפברואר 2011 עד פברואר 2012. מספר הזכרים הנדרשים לשליטה באזור נתון תלוי במספר גורמים, כולל גודל אוכלוסיית הבר, פיזור זכרים משוחררים, הישרדות ותחרותיות הזדווגות של זכרים לאחר השחרור, ותנאים סביבתיים. מחקרים קודמים הראו כי RIDL יכול להפחית את האוכלוסייה של יתושים על ידי לפחות 80%9.
יש צורך באיזון בין אופטימיזציה של גידול המוני להיקף הייצור והעלות לעומת איכות הזכרים. לדוגמה, הגדלת צפיפות הזחל יכולה להגדיל את כושר הייצור על ידי צמצום השטח הנדרש, העבודה והזמן לגור32. עם זאת, צפיפויות גבוהות מדי של זחלים יכול לגרום זכרים חיים קטנים וקצרים יותר עם קיבולת הזדווגות מופחתת32,33. איכות הזכרים ביחס לתוכנית SIT תוערך בסופו של דבר על ידי היכולת של זכרים משוחררים להזדווג עם נקבות בשדה. הערכת שדה נרחבת נדרשת כדי להעריך את התחרותיות בהזדווגות ביחס לעמיתיהם הפראיים9,10. זה לעתים קרובות עושה את זה לא מעשי להעריך בדיוק אילו גורמים להפוך יתוש זכר "באיכות גבוהה". עם זאת, שמירה על ייצור ואיכות עקביים (במידה שניתן להעריך באופן שגרתי) בגידול מסה בקנה מידה גדול היא בעלת חשיבות עליונה. זה דורש רמה גבוהה של ערנות ותקינה של כל התהליך עם תנודות קטנות שעלולות להיות בעלות השפעה משמעותית. aliquoting של זחלי L1 הוא צעד קריטי וממחיש נקודה זו. Aliquoting את המספר הנכון של זחלים לתוך מגשים חיוני לייצור באיכות טובה. משטר ההזנה מותאם בדיוק למספר מסוים של זחלים. זחלים מעטים מדי / רבים יגרמו מעל / תחת האכלה, אשר משפיע על הישרדות הזחל, גודל של גולם וזמן גור. אם יש סוד לאמנות גידול ההמונים זה כדי להבטיח את הצעדים הקטנים הרבים במחזור הייצור מתנהלים באופן עקבי, בדיוק עם רמה גבוהה של בקרת איכות, כמתואר במאמר זה.
Disclosures
מחברים הקשורים Oxitec יש תעסוקה ו / או הון עצמי עניין Oxitec בע"מ. Oxitec בע"מ ואוניברסיטת אוקספורד להחזיק קניין רוחני הקשורים לנושא של מאמר זה.
Acknowledgments
ברצוננו להודות Biofábrica Moscamed ברזיל, Fundação דה Amparo א פסקיסה דו אסטדו דה סאו פאולו (FAPESP) ו Conselho נאסיונאל דה Desenvolvimento Científico e Tecnologia (CNPq) לתמיכה כספית. ברצוננו גם להודות לאנשים הבאים על עזרתם; מרים דוס סנטוס, גילדן סילבה, גסילאן דוס סנטוס, פאביו גונסאלבס, ג'ון פול אוליביירה, לואיזה גרזירה, חוסה קרלוס ולנצ'ה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vipan Premium |
Sera GmbH | 190 |
http://www.sera.de/uk/pages/products/product/sera-vipan-3.html |
| Tetracycline |
Sigma Aldrich | T7660 |
|
| Plate separator |
J.W. Hock | 5412 |
http://www.johnwhock.com/download/manuals/instr_5412_separator.pdf |
| Parafilm M |
Pechiney Plastic packing | PM-996 |
|
| Rearing pans for Release generation (53 cm x 38 cm x 8 cm) |
Pleion | 0757 |
|
| Fluorescent scope |
Leica Microsystems | MZ FLIII |
http://www.leica-microsystems.com/fileadmin/downloads/Leica%20MZ%20FLIII/Brochures/M1-160-0de.pdf |
| Adult cages |
BugDorm | DP1000 |
http://bugdorm.megaview.com.tw/bugdorm-1-insect-rearing-cage-30x30x30-cm-pack-of-one-p-29.html |
| Filter paper |
CELAB |
References
- Dyck, V., et al. Sterilizing Insects with Ionizing Radiation. Sterile Insect Technique. , Springer. Netherlands. 233-268 (2005).
- Dyck, V., Hendrichs, J., Robinson, A. S., Klassen, W., Curtis, C. History of the Sterile Insect Technique.. Sterile Insect Technique. , Springer. Netherlands. 3-36 (2005).
- Alphey, L., et al. Sterile-insect methods for control of mosquito-borne diseases – an analysis. Vector Borne Zoonotic Dis. 10, 295-311 (2010).
- Thomas, D. D., Donnelly, C. A., Wood, R. J., Alphey, L. S. Insect population control using a dominant, repressible, lethal genetic system. Science. 287, 2474-2476 (2000).
- Fu, G., et al. Female-specific insect lethality engineered using alternative splicing. Nat. Biotechnol. 25, 353-357 (2007).
- Fu, G., et al. Female-specific flightless phenotype for mosquito control. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4550-4554 (2010).
- Gong, P., et al. A dominant lethal genetic system for autocidal control of the Mediterranean fruitfly. Nat. Biotechnol. 23, 453-456 (2005).
- Phuc, H. K., et al. Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control. BMC Biol. 5 (11), (2007).
- Harris, A. F., et al. Successful suppression of a field mosquito population by sustained release of engineered male mosquitoes. Nat. Biotechnol. 30, 828-830 (2012).
- Harris, A. F., et al. Field performance of engineered male mosquitoes. Nat. Biotechnol. 29, 1034-1037 (2011).
- Bailey, D. L., Lowe, R. E., Dame, D. A., Seawright, J. A. Mass rearing the genetically altered MACHO strain of Anopheles albimanus Wiedemann. Am. J. Trop. Med. Hyg. 29, 141-149 (1980).
- Benedict, M. Q., et al. Colonisation and mass rearing: learning from others. Malar. J.. 8 Suppl 2 (S4), (2009).
- Alphey, L. Re-engineering the sterile insect technique. Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1243-1247 (2002).
- Wise de Valdez,, R, M., et al. Genetic elimination of dengue vector mosquitoes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4772-4775 (2011).
- Macoris Mde,, L,, et al. Resistance of Aedes aegypti from the state of Sao Paulo, Brazil, to organophosphates insecticides. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 98, 703-708 (2003).
- Campos, J., Andrade, C. F. Larval susceptibility of Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus populations to chemical insecticides. Rev. Saude Publica. 37, 523-527 (2003).
- Gubler, D. J. Resurgent vector-borne diseases as a global health problem. Emerg. Infect. Dis. 4, 442-450 (1998).
- Harris, A. F., Rajatileka, S., Ranson, H. Pyrethroid resistance in Aedes aegypti from Grand Cayman. Am. J. Trop. Med. Hyg. 83, 277-284 (2010).
- Lima, J. B., et al. Resistance of Aedes aegypti to organophosphates in several municipalities in the State of Rio de Janeiro and Espirito Santo. Am. J. Trop. Med. Hyg. 68, Brazil. 329-333 (2003).
- Paris, M., et al. Persistence of Bacillus thuringiensis israelensis (Bti) in the environment induces resistance to multiple Bti toxins in mosquitoes. Pest Manag. Sci. 67, 122-128 (2010).
- Rendon, P., McInnis, D., Lance, D., Stewart, J. Medfly (Diptera: Tephritidae) genetic sexing: large-scale field comparison of males-only and bisexual sterile fly releases in Guatemala. J. Econ. Entomol. 97, 1547-1553 (2004).
- Papathanos, P. A., et al. Sex separation strategies: past experience and new approaches. Malar. J.. 8 Suppl 2 (S5), (2009).
- Medici, A., et al. Studies on Aedes albopictus larval mass-rearing optimization. J. Econ. Entomol. 104, 266-273 (2011).
- Focks, D. A. An improved separator for the developmental stages, sexes and species of mosquito (Diptera Culicidae). J. Med. Entomol. 17, 567-568 (1980).
- Fay, R. W., McCray, E. M., Kilpatrick, J. W. Mass production of sterilized male Aedes aegypti. Mosquito News. 23, 210-214 (1963).
- Christophers, S. R. Aedes aegypti the yellow fever mosquito: Its life history, Bionomics and Structure. , Cambridge University Press. (2009).
- Jones, J. C. A simple method for sexing living Anopheles Larvae (diptera, culicidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 50, 104-106 (1957).
- Koenraadt, C. J. M. Pupal Dimensions as Predictors of Adult Size in Fitness Studies of Aedes aegypti (Diptera Culicidae). J. Med. Entomol. 45, 331-336 (2008).
- Alphey, L., Nimmo, D., O'Connell, S., Alphey, N. Insect population suppression using engineered insects. Adv. Exp. Med. Biol. 627, 93-103 (2008).
- Alphey, N., Bonsall, M. B., Alphey, L. Modeling resistance to genetic control of insects. J. Theor. Biol. 270, 42-55 (2011).
- Atkinson, M. P., et al. Analyzing the control of mosquito-borne diseases by a dominant lethal genetic system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 9540-9545 (2007).
- Bargielowski, I., Nimmo, D., Alphey, L., Koella, J. C. Comparison of life history characteristics of the genetically modified OX513A line and a wild type strain of Aedes aegypti. PLoS One. 6 (e20699), (2011).
- Bargielowski, I., Alphey, L., Koella, J. C. Cost of mating and insemination capacity of a genetically modified mosquito Aedes aegypti OX513A compared to its wild type counterpart. PLoS One. 6 (26086), (2011).
