Summary
For at opnå befolkningsundertrykkelse af Aedes aegypti ved hjælp af RIDL® (Frigivelse af insekter, der bærer et dominant lethal) system, skal et stort antal mandlige myg frigives. Dette kræver brug af masseopdrætsteknikker og teknologi til at levere pålidelige systemer til at opnå det maksimale antal mandlige myg af høj kvalitet.
Abstract
Nye teknikker og metoder søges at forsøge at vinde kampen mod myg. Nylige fremskridt inden for molekylære teknikker har ført til udvikling af nye og innovative metoder til mygkontrol baseret på steril insektteknik (SIT)1-3. En kontrolmetode kendt som RIDL (Frigivelse af insekter, der bærer en dominerende dødelig)4, er baseret på SIT, men bruger genetiske metoder til at fjerne behovet for strålingsterilisering5-8. En RIDL stamme af Ae. aegypti blev med succes testet i marken i Grand Cayman9,10; yderligere brug i marken er planlagt eller i gang i andre lande rundt om i verden.
Masseopdræt af insekter er blevet etableret i flere insektarter og til niveauer på milliarder om ugen. Men i myg er opdræt generelt blevet udført i meget mindre skala, hvor de fleste store opdræt udføres i 1970'erne og 80'erne. For et RIDL-program er det ønskeligt at frigive så få kvinder som muligt, da de bider og overfører sygdom. I en masse opdræt program er der flere faser til at producere hannerne, der skal frigives: ægproduktion, opdræt æg indtil hvalp, og derefter sortering hanner fra kvinder før frigivelsen. Disse mænd bruges derefter til et RIDL-kontrolprogram, udgivet som enten pupper eller voksne11,12.
For at undertrykke en mygpopulation ved hjælp af RIDL skal et stort antal mandlige voksne af høj kvalitet opdrættes13,14. Følgende beskriver metoderne til masseopdræt af OX513A, en RIDL stamme af Ae. aegypti 8, til frigivelse og dækker de teknikker, der kræves til produktion af æg og masseopdræt RIDL hanner til et kontrolprogram.
Introduction
Myg overfører mange patogener, der kan forårsage en række sygdomme hos mennesker, og kontrol af disse myg har været en igangværende kamp i århundreder. Strategier til bekæmpelse af insekter baseret på kemiske og biologiske metoder har haft nogle bemærkelsesværdige succeser, men i mange tilfælde har kontrollen ikke været bæredygtig på lang sigt. For eksempel opnåede Brasilien udryddelse af Ae. aegypti i 50'erne, men myggen har invaderet i løbet af de sidste 40-50 år. Dette kan tilskrives mange årsager, herunder insekticidresistens, miljøskader, dårlig implementering af kontrolprogram15-20, og den hurtige reinvasion uden tilstrækkelig overvågning eller reaktion.
Nye teknikker og metoder bliver forsøgt at forsøge at vinde denne kamp mod myg. Nylige fremskridt inden for molekylære teknikker har ført til udvikling af nye og innovative metoder til mygkontrol baseret på steril insektteknik (SIT)1-3. En kontrolmetode kendt som RIDL (Frigivelse af insekter, der bærer en dominerende dødelig)4 er baseret på SIT, men bruger genetiske metoder til at fjerne behovet for strålingsterilisering. RIDL stammer er blevet bygget til flere skadedyrsarter, herunder Ae. aegypti 5-8, en RIDL stamme af Ae. aegypti blev med succes testet i marken i Grand Cayman9,10; yderligere brug i marken er planlagt eller i gang i andre lande rundt om i verden. Undertrykke myg befolkninger ved hjælp af RIDL vil kræve et stort antal af høj kvalitet mandlige voksne, der skal opdrættes3,14.
For et SIT-program anses det for ønskeligt kun at frigive mænd; kvindelige myg bider og overfører sygdom. Derudover kan de frigivne sterile mænd blive 'distraheret' af de frigivne kvinder, hvilket reducerer programeffektiviteten. Hannudgivelse viste sig at være 3-5 gange mere effektiv end frigivelse af blandet køn i store feltforsøg med bestrålede middelhavsfrugtfluer21.
I en RIDL masse opdræt program, der er flere faser til at producere hannerne til frigivelse. Den første er at producere de æg, der er nødvendige for udsætningen (Figur 1). Den næste fase er at opdrætte æggene igennem til pupper eller voksne, der adskiller larver fra pupper og den mandlige pupper fra den kvindelige pupper. Storstilet adskillelse af mænd fra kvinder kræver en forskel mellem kønnene på et bestemt livsstadium, der er egnet til massesortering22. I Ae. aegypti (og andre myg arter) der er en betydelig størrelse forskel mellem den mandlige og kvindelige pupper, som kan udnyttes til sex separation teknikker. Den sorterede RIDL hanner derefter frigives i et kontrolprogram som enten pupper eller som voksne11,12.
I det følgende beskrives metoderne til masseopdræt af OX513A, en RIDL-stamme af Ae. Aegypti, til løsladelse. De beskrevne metoder dækker de teknikker, der kræves til produktion af æg og RIDL-hanner til et kontrolprogram.
Protocol
Insektbehov
1. Oversigt
- Masseopdræt har flere faser, som hver især udføres i et særskilt område af masseopdrætsenheden. Figur 1 viser hovedfasen af opdræt, og hvor de forekommer i masseopdrætsanlægget.
2. Overvejelser om biosikkerhed i forbindelse med insekticidet
- Projektet blev godkendt af komitéen for dyreetik fra universitetet i São Paulo - Brasilien, og alle nødvendige tilladelser og godkendelser blev opnået.
- RIDL-systemet bruger betinget dødelighed. et kosttilskud (tetracyklin) forhindrer, at RIDL-systemet udtrykker, at insekterne kan masseopavle uden tetracyklin dør myggene. Tetracyklin findes ikke på ynglepladserne i Ae. aegypti i naturen, så ethvert afkom, der er fremstillet af undslupne, ikke vil overleve. Dette tilføjer et ekstra sikkerhedsniveau over brug af vilde (WT) insekter steriliseret ved andre metoder(dvs. stråling).
- Brug dobbeltdørsindgang, "Kun autoriseret personale" skilte og insektskærme i insektet. Eventuelle vinduer skal forsegles for at undgå forurening af kolonien med WT-insekter og hjælpe med at forhindre flugt inde fra insektet.
- Lokale regler og myndigheder kan have specifikke yderligere eller alternative krav. Kontakt de relevante myndigheder for at få oplysninger/vejledning på et tidligt tidspunkt, og sikre alle nødvendige tilladelser og godkendelser, inden du etablerer RIDL-stammen i et insektmiddel.
- Masseopdræt af insektbekæmpelse bør kun anvendes til RIDL-opdræt. Ingen andre stammer eller insekter bør være til stede. Dette er for at undgå forurening af RIDL-stammen og forurening med patogener, der kan påvirke fitness og overlevelse, hvilket reducerer de frigivne mænds produktivitet og effektivitet.
3. Insektdesign
- Figur 2 viser en plan over det insektmiddel, der blev brugt på Biofábrica Moscamed i Brasil.
- Temperaturen i alle værelser var 26 °C ± 2) med en relativ luftfugtighed ca. 70-80% og en 12:12 timers lys:mørk cyklus ved hjælp af lysstofrør strimler.
- Denne plan kan ændres i henhold til specifikke pladskrav, f.eks. Men ægproduktion, opdræt og sortering, Kvalitetskontrol (QC) og udgivelser bør opdeles i fire forskellige områder: Egg Production Colony, Release Generation, QC, og Adult Storage for Release.
- Æggeproduktionskolonirummet (ca. 20 m2)bruges til at producere æg til frigivelsesgenerering.
- Kvalitetskontrolområdet er det sted, hvor der udføres forsøg for at kontrollere procedurer og RIDL-linjens egnethed, herunder målinger af lugehastighed, pupper, puppestørrelse og måling af effektiviteten af sortering og fjernelse af hunner. Der udføres også test for WT-kontaminering ved at kontrollere, om der er fluorescensmarkør og fænotype ved hjælp af offsetanalyser, der måler dødelighed.
- Release Generation-rummet (ca. 36 m2)kræver tilstrækkelig plads til bakker og sortering af larver og pupper. Bakkerne holdes i specialbyggede aluminiumsstativer. Et stort arbejdsområde og vask er påkrævet til opdræt og sortering, og en anden stor vask er nødvendig til vask af bakker og bure. Et filter fangst fælde er blevet medtaget i spildevandet stikkontakten fra dræn for at afbøde flugten af levende myg gennem kloakken.
- Alt vand, der bruges til bakkerne, bortskaffes gennem et afløb, som har et rum, der indeholder et net, der forhindrer udslip af insekter i ethvert udviklingsstadium.
- Der kræves et område til opbevaring af voksne til frigivelse (Adult Storage for Release, Figur 2), der indeholder reoler til at holde frigivelsesenhederne, mens de voksne modnes før frigivelsen.
Produktionsmetoder til masseopdræt RIDL:
Ægproduktionskolonien producerer de æg, der bruges i releasegenerering (figur 1) til at producere voksne. Der er mange ligheder i de to opdrætsmetoder, men også nogle forskellige forskelle. De opdrætsprocesser, der er ens for begge procedurer, er kun beskrevet i afsnittet Ægproduktionskoloni.
Ægproduktionskoloni
4. Larveproduktion
Ægproduktionskolonien genererer homozygotiske OX513A RIDL-æg8 til frigivelsesgenerering. Høj kvalitetskontrol sikrer levedygtighed, kondition og belastning integritet af de leverede æg.
- Stimulus til udklækning er nedsænkning i vand med et lavt niveau af opløst ilt. For at reducere iltniveauet i vandet opvarmes vandet, indtil det koges, og straks placeres 400 ml i 500 ml glaskrukker (74 mm åbningsomkreds), fastgør låget sikkert og lad det stå ved stuetemperatur i flere timer for at køle af.
- Sæt 1 g æg i en krukke kogt vand, reseal og vent i en time. Overfør indholdet til en bakke med 2 L vand og lad natten over under insektforhold.
- Placer de udklækkede larver i et kendt volumen vand og rør ved hjælp af en magnetisk omrører og loppe i tilstrækkelig tid til at tage aliquots; omrøring kraftigt eller i længere tid skader larver og bør holdes på et minimum. Det standardvolumen, der bruges til at luge larver, er 1 L, men tætheder på mere end 300 larver / ml er svære at tælle og kan være skadelige. Derfor må du ikke klække mere end ca. 300.000 æg/L vand.
- Lugehastigheden bestemmes ved at tage tre 1 ml aliquots og placere på et ark absorberende papir med et gitter på 1 cm firkanter oven på en absorberende svamp for at opsuge overskydende vand. Tæl antallet af udklækkede og ikke-udkvælgede æg fra tre firkanter ved at kigge efter den manglende hætte af et udklækket æg. En luge sats omkring 80-90% forventes.
- Tag fire aliquots på 1 ml hver og læg dem i fire sorte vejebåde (larver er hvide og derfor lettere synlige mod en sort baggrund) og tæl antallet af levende larver til stede med øjet; brugen af en tæller anbefales. Det gennemsnitlige antal larver pr. Ml bruges derefter til at beregne mængden af vand, der skal tilsættes på hver bakke for at få det ønskede antal larver pr. Bakke.
- Der kan være store forskelle i tætheden, hvor larver kan opdrættes mellem stammer og arter. Det er også ønskeligt at sammenligne RIDL voksen mandlig størrelse til vilde type mænd; ideelt set du ønsker ligner større størrelse RIDL mænd, der kan konkurrere med succes med vilde mænd. Derfor skal den ideelle tæthed af larver bestemmes for hver RIDL-stamme og er en afvejning mod pladsbegrænsninger for opdræt og produktionens omfang. Tætheder fra 0,1-2,5 larve/ml har vi fundet en god kombination af produktionsproduktion og kvalitet; også drøftet af Medici23.
- Tilsæt larverne til bakker. På vores anlæg bruger vi bakker, der måler ca. 53 cm x 37 cm x 8 cm (L x W x H) og den nødvendige mængde vand for at opnå tætheden af larver til produktion.
- Der tilsættes en stamopløsning af tetracyklin (3 mg/ml i vand) til bakkerne ved en fortynding på 1:100 for at opnå den krævede endelige koncentration på 30 μg/ml.
- Foder larver med flage fiskefoder (www.sera.de) dagligt, som er blevet knust til et fint pulver. Tabel 1 viser det typiske fodringsregime i mg mad pr. larver om dagen. Foder larver indtil den passende sorteringsdag under de insektforhold, der er beskrevet ovenfor.
5. Sortering larver fra pupper og mandlige / kvindelige pupper
- Sorter larver fra pupper 8 dage efter udklækning ved at adskille larverne fra pupperne. Så sex-sortere pupperne for mænd. En enhed kendt som en pladeseparator24,25 kan sortere larver fra mandlige pupper og fra kvindelige pupper. Figur 3 illustrerer brugen af denne pladeseparator til at adskille larver fra han og fra hunpupper.
- Ved hjælp af en måleske med et net på bunden kalibreres den med 500 pupper eller mere og bruge den til at oprette bure og estimere den samlede mængde hanner og hunner, der produceres.
- På den første sorteringsdag (dag 8) er de fleste af pupperne mænd, så læg de sorterede larver tilbage i en bakke og bag igennem til den følgende dag, når de fleste af pupperne er kvinder (Figur 4).
- Sorteringsprocessen gentages hver dag som beskrevet i trin 2.1-2.3, indtil alle larverne er poppet, eller indtil udgangen af en arbejdsuge.
- Placer 1.000 mandlige pupper (ved hjælp af måleskeen) i et bur, og på dag 9 tilsættes 3.000 kvindelige pupper til det samme bur (vi bruger 30 cm høje og 30 cm diameter PVC-rør tilpasset med mesh top og et nettet adgangshul, men 30 cm x 30 cm x 30 cm plastbure er også tilgængelige fra BugDorm).
- Lad voksne parre sig i mindst 2 dage og give dem saccharoseopløsning (10%) på våd bomuld ad libitum før blodfodring. Saml æg i to uger (~ to gonotrofiske cyklusser) med to blodfoder om ugen. Dette giver i gennemsnit 143.000 æg fra et bur på 3.000 hunner (i gennemsnit 48 æg / kvinder). Til produktion af 4 millioner æg om ugen skal der oprettes ca. 28 bure hver uge.
6. Blodfodring
- Et aluminiumspladefodringssystem forsyner bure med blod to gange om ugen. En lomme af blod er skabt på siden af en aluminium plade (10 cm x 10 cm x 3 mm) med Parafilm (Figur 5). For at tilskynde til fodring opvarmes blodet ved at placere en opvarmet bønnepose oven på pladeføderen. Bønneposen bestod af ca. 250 g hvedekorn i en kludpose, som opvarmes i ca. 10 sek. i en mikrobølgeovn. Blodet, vi bruger til fodring, er fra et lokalt slagteri; da disse dyr (hovedsagelig geder og får) er til konsum, testes de for at undgå forekomst af patogener.
- Tre dage efter blodfodring leveres et ovipositionssted for hunnerne til at lægge deres æg. Ovipositionsstedet er en rund plastbeholder fyldt til ca. 1/4 med vand og filterpapir, der dækker indersiden. To dage senere fjernes ovipositionsstedet. For maksimal ægproduktion skal du sørge for, at filterpapiret dækker hele den tilgængelige overflade inde i beholderen og forbliver våd.
- Fjern æggepapiret og læg det på absorberende papir for at tørre under insektforhold; æg kræver en konditionering ved høj luftfugtighed (over 70 %) mindst 48 timer efter at være blevet lagt. Æg kan efterlades i insektet i op til 3 måneder med minimalt fald i lugehastighed, så længe fugtigheden holdes høj25.
- Ægproduktionskolonien skal være af tilstrækkelig størrelse til at give det antal æg, der kræves ugentligt til frigivelsesprogrammet. Anlægget beskrevet ovenfor kan producere ca. 4 millioner æg med 28 bure oprettet ugentligt. Det anbefales at opbevare nok æg til at garantere mindst 4 ugers æg til frigivelsesgenerering og ægproduktionskolononi.
Oprettelse af udgivelse
7. Larveproduktion
Ruge-, opdræts- og sorteringsprocesserne for frigivelsesgenerering er identiske med den tidligere beskrevne metode til ægproduktionskolonien. Produktionens omfang er dog meget større, og det kræver flere bakker og en større indsats.
8. Sortering larver, mandlige pupper, og kvindelige pupper
- Sorteringen af larver, hanpupper og kvindelige pupper er identisk med den metode, der er beskrevet for ægproduktion.
- Efter sortering af hanpæpen er det vigtigt at kontrollere for kvindelig forurening før frigivelse; der bør ikke være mere end 1% kvinder til stede. Tag tre aliquots af 500 pupper (tre tilfældige pupper måle skeer) og tælle antallet af kvindelige pupper til stede. Hunnerne kan identificeres, da de generelt er større end mænd og fra forskelle i kønslappeformen (figur 6)27. Hvis der er mere end 1% kvinder, bør de tyes og kontrolleres igen.
- Brug kun hannerne fra dag 8 og 9 til frigivelse; autoklave eventuelle resterende larver og pupper. I Brasilien skal dette affald behandles på samme måde som medicinsk affald, men reglerne kan variere i andre lande. Brug ikke kvindelige pupper og larver fra frigivelsesgenerering til ægproduktionskolonien på grund af forskelle i kvalitetskontrol, opdræt og forureningsrisici fra større antal og lavere kvalitetskontrol.
Voksen opbevaring til frigivelse: Placer mænd i frigivelse enheder til at dukke op og modne før frigivelsen. Detaljerne i frigivelsesenhederne er ikke dækket af denne metode. Men kapaciteten af frigivelse enheder, vi bruger, er omkring 1.000 mænd. Oplysninger om frigivelsesmetoden (frigivelsesenhed og frigivelsessystem) er ikke omfattet af denne metode.
Representative Results
De forventede pupper til produktion er vist i figur 4. Hannerne popper først og topper på dag 8, og hunnerne topper på dag 9 efter udklækning. Det er vigtigt at måle denne hvalp kurve at kende det bedste tidspunkt at sortere mænd fra kvinder.
Resultater fra mere end 6 måneders sortering af mandlige og kvindelige pupper viser, at den kvindelige kontaminering i gennemsnit er på 0,02%(figur 5; SEM = 0,004%). Denne kontamineringsrate repræsenterer kun 400 kvinder, der frigives over en måneds udslip (ca. to millioner mænd). Nuværende ægproduktion om ugen er 4 millioner. Af disse udklækkes 3,5 millioner til ægkoloni og produktion med resten opbevaret til backup. Ca. 11% af æggene anvendes til ægproduktion koloni og resten til frigivelse generation. Æg luge sats gennemsnit 87,3% (SEM = 0,5%) og udbyttet af hanpupper fra L1 larver gennemsnit 29,5% (SEM = 1,2). To millioner larver opdrættes hver uge til Release Generation kolonien producerer omkring 571.000 mandlige pupper (SEM = 14.000). Pupper og voksendødelighed under fremkomsten og frigivelsen gennemsnit 5%, hvilket resulterer i ca 543.000 (SEM = 13.000) frigivet voksne mandlige myg om ugen. Det forventes nuværende produktion af 4 millioner æg / uge kunne reduceres til ~ 3 millioner om ugen med yderligere optimering for at reducere tab fra spild og opbevaring. Der er i alt behov for 6 medarbejdere til den beskrevne produktion; fire arbejder på frigivelse generation og de resterende to på æggekolonien.
kvalitetskontrol
Kvalitetskontrol er afgørende for at opretholde kvaliteten af de voksne, effektiviteten af opdræt, arbejdskraft og omkostninger.
Transgene fænotypekontrol
For at verificere RIDL genekspression udføres to kontroller, for det første for at kontrollere ekspressionen af fluorescensmarkør og for det andet for at kontrollere ekspressionen af RIDL-dødelighedstræk i mangel af tetracyklin. Alle larver skal udtrykke den fluorescerende markør. For at kontrollere, om lysstofrøret udtrykkes som forventet, kontrolleres 2.000 første instar larver under et Leica MZFLIII stereomikroskop med DSRed2 filter (Texas Red) for at afgøre, om der er nogen ikke-fluorescerende individer til stede. Uden tetracyklin udtrykkes RIDL-genet, og vi forventer 3-4% overlevelse for voksne8. For at kontrollere dette er der oprettet en ekstra bakke til hvert frigivelsesbatch uden tetracyklin. Den eneste forskel til normal opdræt er, at maden reduceres med 2/3 fra dag 6, fordi akkumulering af overskydende mad på grund af døde larver kan resultere i overskydende bakterievækst.
Opdrætskontrol
Fire bakker fra frigivelse generation er tilfældigt valgt til at blive sorteret og tælles separat. Antallet af han- og hunpupper registreres fra hver bakke hver dag (figur 4). Enhver afvigelse fra det forventede antal hanner og hunner indikerer et potentielt problem, der kan påvirke produktionen og/eller fitness og kan sammenlignes med ægkolonien for at hjælpe med at bestemme kilden til problemer.
Pupper Målinger
Puppernes størrelse har vist sig at være korreleret med voksen størrelse28. Som kvalitetskontrol for voksenstørrelse måles cephalothoraxbredden på mindst 30 mandlige pupper for hver sorteringsdag fra frigivelsesgenerering; for æggeproduktionskolonien måles også kvindelige pupper. Gennemsnitlig cephalothorax bredde var 1,05 mm (SEM 0,005) for frigivne hanner og 1,04 mm (SEM = 0,006) og 1,29 mm (SEM = 0,006) for henholdsvis mænd og kvinder Egg Production, Colony; lignende resultater blev opnået for Ae. albopictus masse opdræt24.
Figur 1. Stadier af masse opdræt myg til brug i en RIDL / SIT program. Ægproduktionskolonien har en høj grad af kvalitetskontrol for at sikre kvaliteten af de æg, der leveres til frigivelsesgenereringen. Æg opdrættes igennem til pupper i frigivelseskolonien, hvor mændene sorteres fra hunnerne. De voksne hannen bruges derefter til RIDL-kontrolprogrammet.
Figur 2. Skematisk af opdræt facilitet til produktion af RIDL mænd til en udgivelse program. Æg af høj kvalitet produceres løbende i æggeproduktionskolonirummet og opdrættes derefter igennem til pupper i Release Generation-rummet. Larverne og pupperne adskilles derefter og pupperne sexsorteret for mænd. Hannerne placeres derefter i frigivelsesenheder og får lov til at modnes til voksne til frigivelse i voksenopbevarings- og frigivelsesrummet.
Figur 3. Adskillelse larver, mandlige pupper, og kvindelige pupper ved hjælp af en plade separator26. Pladeseparatoren bruger størrelsesforskellen mellem larver, hanpupper og kvindelige pupper til at sortere disse tre forskellige livsstadier; larver tendens til at være mindre end mandlige pupper, som igen er mindre end kvindelige pupper. Instrumentet består af to glasplader; den ene er fastgjort til en skrå metalramme, og den anden sidder oven på den første plade og kan flyttes i forhold til den første ved hjælp af fire justeringsskruer (A). De fire justeringsskruer gør det muligt at indstille yderpladen i en vinkel til bagpladen, så der dannes et kileformet rum mellem pladerne, aftagende nedad. Larver og pupper hældes mellem glaspladerne (B) og vaskes forsigtigt ved hjælp af en vandslange (C). Ved at justere pladens vinkel kan larver, hanpupper og kvindelige pupper adskilles (D). Ved kontinuerlig skylning og forøgelse af pladevinklen kan larverne skylles gennem først (i en sigte), efterfulgt af den mandlige pupper og endelig den kvindelige pupper.
Figur 4. Pupation kurver for masse opdrættet RIDL Ae. aegypti. Denne graf viser den gennemsnitlige procentdel af pupation for masse opdrættet RIDL mandlige og kvindelige pupper i løbet af 23 uger observation med ~ 135.000 pupper inddrives om ugen. Fejllinjer = standardfejl for middelværdi, n = 23. På den første samling (dag 8) genvandt vi i gennemsnit 59% mandlige og 30% kvindelige pupper fra den samlede pupper genvundet fra bakker over 5 dage.
Figur 5. Gennemsnitlig kvindelig forurening af sorteret mandlig pupper. Denne graf viser den månedlige gennemsnitlige procentdel af kvindelige kontaminering under mandlig sortering på dag 8 efter udklækning over en seksmåneders periode.
Figur 6. Aluminium plade blod feeder system. Pladen (B) er dækket af parafilm (A) og blod pipetteret i en lomme og derefter forseglet (D). Pladen placeres på et bur og opvarmes ved at placere en opvarmet bønnepose (C) på toppen (E).
Figur 7. Skelner mellem mandlige og kvindelige Ae. aegypti pupper. Ae. aegypti pupper kan pålideligt sexed af forskellene i genital lap form (i slutningen af pupal abdominal segmenter lige under padler). Derudover har mænd også tendens til at være mindre end kvinder.
Tabel 1. Generelt fodringsregime for Ae. aegypti RIDL larver (mg mad pr. Larve om dagen). For at beregne den faktiske mængde mad, der kræves, multipliceres med det samlede antal larver pr. Bakke.
Discussion
RIDL er en effektiv og miljømæssigt sikker metode til at kontrollere myg3,29-31. Teknikken gælder for et integreret skadedyrsbekæmpelsesprogram, og de fleste nuværende bekæmpelsesmetoder, herunder larvicider, reduktion af ynglepladser og voksne, er kompatible med denne teknologi. Denne metode beskriver, hvordan man producerer op til 570.000 RIDL mandlige pupper om ugen til brug i kontrollen af Ae. Aegypti og så vidt vi ved, er dette den første beskrivelse af produktionen af transgene myg på denne skala. Nogle sammenlignelige produktionssystemer blev udviklet for vilde type Ae. aegypti i 1960'erne og 70'erne25, men der har ikke været nogen sammenlignelig produktion af denne størrelsesorden siden da. I Brasilien omkring 11 millioner mænd er blevet løsladt fra februar 2011 til februar 2012. Antallet af hanner, der kræves for at kontrollere et givet område, afhænger af en række faktorer, herunder størrelsen af den vilde bestand, spredning af frigivne hanner, mænds overlevelse og parringskonkurrenceevne efter udsætning og miljøforhold. Tidligere undersøgelser har vist, at RIDL kan reducere en population af myg med mindst 80%9.
Der er behov for en balance mellem optimering af masseopdræt til produktion og omkostninger vs. kvalitet af mænd. For eksempel kan stigende larvetæthed øge produktionskapaciteten ved at reducere den krævede plads, arbejdskraft og tid til hvalp32. Imidlertid kan for høj tæthed af larver resultere i mindre og kortere levede mænd med reduceret parringskapacitet32,33. Kvaliteten af mænd i forhold til et SIT-program vil i sidste ende blive vurderet af muligheden for frigivne mænd til at parre sig med kvinder i marken. Der er behov for en omfattende feltevaluering for at vurdere parringskonkurrenceevnen i forhold til vilde modparter9,10. Dette gør det ofte upraktisk at vurdere nøjagtigt, hvilke faktorer der gør en 'høj kvalitet' mandlig myg. Det er imidlertid altafgørende at opretholde en ensartet produktion og kvalitet (i det omfang, det rutinemæssigt kan evalueres) i storstilet masseopdræt. Dette kræver en høj grad af årvågenhed og standardisering af alle processer med små udsving, der potentielt har en betydelig indvirkning. Den aliquoting af L1 larver er et kritisk skridt og illustrerer dette punkt. Aliquoting det korrekte antal larver i bakker er afgørende for god kvalitet produktion. Fodringsregimet er nøjagtigt skræddersyet til specifikt antal larver. For få/mange larver vil resultere i over/under fodring, hvilket påvirker larveoverlevelse, puppernes størrelse og tid til hvalp. Hvis der er en hemmelighed til kunsten at masseopdræt, er det for at sikre, at de mange små trin i produktionscyklussen udføres konsekvent, præcist og med et højt kvalitetskontrolniveau, som beskrevet i dette papir.
Disclosures
Forfattere tilknyttet Oxitec har beskæftigelse og / eller egenkapital interesse i Oxitec Ltd Oxitec Ltd og Oxford University har intellektuel ejendomsret i forbindelse med emnet for dette papir.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Biofábrica Moscamed Brasil, Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) og Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnologia (CNPq) for finansiel støtte. Vi vil også gerne takke følgende personer for deres hjælp. Miriam dos Santos, Gildeane Silva, Gessilane dos Santos, Fabio Gonçalves, John Paul Oliveira, Luiza Garziera, José Carlos Valença.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vipan Premium |
Sera GmbH | 190 |
http://www.sera.de/uk/pages/products/product/sera-vipan-3.html |
| Tetracycline |
Sigma Aldrich | T7660 |
|
| Plate separator |
J.W. Hock | 5412 |
http://www.johnwhock.com/download/manuals/instr_5412_separator.pdf |
| Parafilm M |
Pechiney Plastic packing | PM-996 |
|
| Rearing pans for Release generation (53 cm x 38 cm x 8 cm) |
Pleion | 0757 |
|
| Fluorescent scope |
Leica Microsystems | MZ FLIII |
http://www.leica-microsystems.com/fileadmin/downloads/Leica%20MZ%20FLIII/Brochures/M1-160-0de.pdf |
| Adult cages |
BugDorm | DP1000 |
http://bugdorm.megaview.com.tw/bugdorm-1-insect-rearing-cage-30x30x30-cm-pack-of-one-p-29.html |
| Filter paper |
CELAB |
References
- Dyck, V., et al. Sterilizing Insects with Ionizing Radiation. Sterile Insect Technique. , Springer. Netherlands. 233-268 (2005).
- Dyck, V., Hendrichs, J., Robinson, A. S., Klassen, W., Curtis, C. History of the Sterile Insect Technique.. Sterile Insect Technique. , Springer. Netherlands. 3-36 (2005).
- Alphey, L., et al. Sterile-insect methods for control of mosquito-borne diseases – an analysis. Vector Borne Zoonotic Dis. 10, 295-311 (2010).
- Thomas, D. D., Donnelly, C. A., Wood, R. J., Alphey, L. S. Insect population control using a dominant, repressible, lethal genetic system. Science. 287, 2474-2476 (2000).
- Fu, G., et al. Female-specific insect lethality engineered using alternative splicing. Nat. Biotechnol. 25, 353-357 (2007).
- Fu, G., et al. Female-specific flightless phenotype for mosquito control. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4550-4554 (2010).
- Gong, P., et al. A dominant lethal genetic system for autocidal control of the Mediterranean fruitfly. Nat. Biotechnol. 23, 453-456 (2005).
- Phuc, H. K., et al. Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control. BMC Biol. 5 (11), (2007).
- Harris, A. F., et al. Successful suppression of a field mosquito population by sustained release of engineered male mosquitoes. Nat. Biotechnol. 30, 828-830 (2012).
- Harris, A. F., et al. Field performance of engineered male mosquitoes. Nat. Biotechnol. 29, 1034-1037 (2011).
- Bailey, D. L., Lowe, R. E., Dame, D. A., Seawright, J. A. Mass rearing the genetically altered MACHO strain of Anopheles albimanus Wiedemann. Am. J. Trop. Med. Hyg. 29, 141-149 (1980).
- Benedict, M. Q., et al. Colonisation and mass rearing: learning from others. Malar. J.. 8 Suppl 2 (S4), (2009).
- Alphey, L. Re-engineering the sterile insect technique. Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1243-1247 (2002).
- Wise de Valdez,, R, M., et al. Genetic elimination of dengue vector mosquitoes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4772-4775 (2011).
- Macoris Mde,, L,, et al. Resistance of Aedes aegypti from the state of Sao Paulo, Brazil, to organophosphates insecticides. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 98, 703-708 (2003).
- Campos, J., Andrade, C. F. Larval susceptibility of Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus populations to chemical insecticides. Rev. Saude Publica. 37, 523-527 (2003).
- Gubler, D. J. Resurgent vector-borne diseases as a global health problem. Emerg. Infect. Dis. 4, 442-450 (1998).
- Harris, A. F., Rajatileka, S., Ranson, H. Pyrethroid resistance in Aedes aegypti from Grand Cayman. Am. J. Trop. Med. Hyg. 83, 277-284 (2010).
- Lima, J. B., et al. Resistance of Aedes aegypti to organophosphates in several municipalities in the State of Rio de Janeiro and Espirito Santo. Am. J. Trop. Med. Hyg. 68, Brazil. 329-333 (2003).
- Paris, M., et al. Persistence of Bacillus thuringiensis israelensis (Bti) in the environment induces resistance to multiple Bti toxins in mosquitoes. Pest Manag. Sci. 67, 122-128 (2010).
- Rendon, P., McInnis, D., Lance, D., Stewart, J. Medfly (Diptera: Tephritidae) genetic sexing: large-scale field comparison of males-only and bisexual sterile fly releases in Guatemala. J. Econ. Entomol. 97, 1547-1553 (2004).
- Papathanos, P. A., et al. Sex separation strategies: past experience and new approaches. Malar. J.. 8 Suppl 2 (S5), (2009).
- Medici, A., et al. Studies on Aedes albopictus larval mass-rearing optimization. J. Econ. Entomol. 104, 266-273 (2011).
- Focks, D. A. An improved separator for the developmental stages, sexes and species of mosquito (Diptera Culicidae). J. Med. Entomol. 17, 567-568 (1980).
- Fay, R. W., McCray, E. M., Kilpatrick, J. W. Mass production of sterilized male Aedes aegypti. Mosquito News. 23, 210-214 (1963).
- Christophers, S. R. Aedes aegypti the yellow fever mosquito: Its life history, Bionomics and Structure. , Cambridge University Press. (2009).
- Jones, J. C. A simple method for sexing living Anopheles Larvae (diptera, culicidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 50, 104-106 (1957).
- Koenraadt, C. J. M. Pupal Dimensions as Predictors of Adult Size in Fitness Studies of Aedes aegypti (Diptera Culicidae). J. Med. Entomol. 45, 331-336 (2008).
- Alphey, L., Nimmo, D., O'Connell, S., Alphey, N. Insect population suppression using engineered insects. Adv. Exp. Med. Biol. 627, 93-103 (2008).
- Alphey, N., Bonsall, M. B., Alphey, L. Modeling resistance to genetic control of insects. J. Theor. Biol. 270, 42-55 (2011).
- Atkinson, M. P., et al. Analyzing the control of mosquito-borne diseases by a dominant lethal genetic system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 9540-9545 (2007).
- Bargielowski, I., Nimmo, D., Alphey, L., Koella, J. C. Comparison of life history characteristics of the genetically modified OX513A line and a wild type strain of Aedes aegypti. PLoS One. 6 (e20699), (2011).
- Bargielowski, I., Alphey, L., Koella, J. C. Cost of mating and insemination capacity of a genetically modified mosquito Aedes aegypti OX513A compared to its wild type counterpart. PLoS One. 6 (26086), (2011).
