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Produção em massa de Aedes aegypti geneticamente modificado para lançamentos de campo no Brasil

Published: January 4, 2014 doi: 10.3791/3579
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 3, 3, 4, 1,5, 2,6
1Oxitec Ltd, 2Departamento de Parasitologia, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, 3Departamento de Epidemiologia, Universidade de São Paulo, 4Moscamed Brasil, 5Deptartment of Zoology, University of Oxford, 6Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Entomologia Molecular (INCT-EM)

Summary

Para alcançar a supressão populacional do Aedes aegypti usando o sistema RIDL® (Liberação de Insetos portadores de uma Letal Dominante), um grande número de mosquitos machos precisa ser liberado. Isso requer o uso de técnicas de criação em massa e tecnologia para fornecer sistemas confiáveis para obter o número máximo de mosquitos machos de alta qualidade.

Abstract

Novas técnicas e métodos estão sendo procurados para tentar vencer a batalha contra mosquitos. Os recentes avanços nas técnicas moleculares levaram ao desenvolvimento de novos e inovadores métodos de controle de mosquitos baseados em torno da Técnica de Insetos Estéreis (SIT)1-3. Um método de controle conhecido como RIDL (Liberação de Insetos portadores de uma Letal Dominante)4, é baseado em torno de SIT, mas usa métodos genéticos para remover a necessidade de esterilização por radiação5-8. Uma cepa RIDL de Ae. aegypti foi testada com sucesso no campo em Grand Cayman9,10; o uso adicional do campo está planejado ou em andamento em outros países ao redor do mundo.

A criação em massa de insetos foi estabelecida em várias espécies de insetos e em níveis de bilhões por semana. No entanto, nos mosquitos, a criação tem sido geralmente realizada em escala muito menor, com a maior parte da criação em larga escala sendo realizada nas décadas de 1970 e 1980. Para um programa RIDL é desejável liberar o menor número possível de fêmeas que mordam e transmitam doenças. Em um programa de criação em massa há várias etapas para produzir os machos a serem liberados: produção de ovos, criação de ovos até a pupação e, em seguida, classificação de machos de fêmeas antes da liberação. Esses machos são então usados para um programa de controle RIDL, lançado como pupas ou adultos11,12.

Para suprimir uma população de mosquitos que utilizam ridl um grande número de adultos do sexo masculino de alta qualidade precisa ser criado13,14. Descreve os métodos para a criação em massa do OX513A, uma cepa RIDL de Ae. aegypti 8, para liberação e abrange as técnicas necessárias para a produção de ovos e criação em massa de machos RIDL para um programa de controle.

Introduction

Mosquitos transmitem muitos patógenos que podem causar uma série de doenças em humanos e controlar esses mosquitos tem sido uma batalha contínua há séculos. Estratégias de controle de insetos baseadas em métodos químicos e biológicos tiveram alguns sucessos notáveis, mas em muitos casos o controle não tem sido sustentável a longo prazo. Por exemplo, o Brasil conseguiu a erradicação do Ae. aegypti na década de 50, mas o mosquito reinvadiu nos últimos 40-50 anos. Isso pode ser atribuído a muitas causas, incluindo resistência a inseticidas, danos ambientais, implementação de programas de controle ruim15-20e a rápida reinvasão sem monitoramento ou resposta adequados.

Novas técnicas e métodos estão sendo procurados para tentar vencer esta batalha contra mosquitos.  Os recentes avanços nas técnicas moleculares levaram ao desenvolvimento de novos e inovadores métodos de controle de mosquitos baseados em torno da Técnica de Insetos Estéreis (SIT)1-3. Um método de controle conhecido como RIDL (Liberação de Insetos portadores de uma Letal Dominante)4 é baseado em torno de SIT, mas usa métodos genéticos para remover a necessidade de esterilização por radiação. Cepas RIDL foram construídas para várias espécies de pragas, incluindo Ae. aegypti 5-8, Uma cepa RIDL de Ae. aegypti foi testada com sucesso no campo em Grand Cayman9,10; o uso adicional do campo está planejado ou em andamento em outros países ao redor do mundo.  Suprimir populações de mosquitos usando RIDL exigirá um grande número de adultos do sexo masculino de alta qualidade para serem criados3,14.

Para um programa SIT é considerado desejável liberar apenas homens; mosquitos fêmeas mordem e transmitem doenças. Além disso, os machos estéreis liberados podem ser 'distraídos' pelas fêmeas liberadas reduzindo a eficácia do programa. A liberação somente para homens mostrou-se 3-5 vezes mais eficaz do que a liberação de sexo misto em experimentos de campo grande com moscas de frutas irradiadas do Mediterrâneo21.

Em um programa de criação em massa RIDL, existem várias etapas para produzir os machos para lançamento.  O primeiro é produzir os ovos necessários para a geração de liberação(Figura 1). A próxima etapa é criar os ovos através de pupas ou adultos, separando larvas de pupas e pupas machos da pupa fêmea. A separação em larga escala dos machos das fêmeas requer uma diferença entre os sexos em um determinado estágio de vida adequado para a triagem em massa22. No Ae. aegypti (e em outras espécies de mosquitos) há uma diferença significativa de tamanho entre as pupas machos e fêmeas que podem ser exploradas para técnicas de separação sexual. Os machos RIDL classificados são então liberados em um programa de controle como pupas ou como adultos11,12.

O seguinte descreve os métodos para a criação em massa de OX513A, uma cepa RIDL de Ae. Aegypti, para liberação. Os métodos descritos abrangem as técnicas necessárias para a produção de ovos e machos RIDL para um programa de controle.

Protocol

Requisitos inseticidos

1. Visão geral

  1. A criação em massa tem várias fases, cada uma das quais é realizada em uma área distinta da unidade de criação em massa. A Figura 1 mostra a fase principal da criação e onde ocorrem na instalação de criação em massa.

2. Considerações de Biossegurança para o Insectary

  1. O projeto foi aprovado pela comissão de ética animal da Universidade de São Paulo - Brasil e todas as autorizações e aprovações necessárias foram obtidas.
  2. O sistema RIDL usa letalidade condicional; um suplemento dietético (tetraciclina) impede a expressão do sistema RIDL permitindo que os insetos sejam criados em massa; sem tetraciclina, os mosquitos morrem. A tetraciclina não é encontrada nos criadouros de Ae. aegypti na natureza para que qualquer descendente produzido de fugitivos não sobreviva.  Isso adiciona um nível extra de segurança sobre o uso de insetos do tipo selvagem (WT) esterilizados por outros métodos (ou seja, radiação).
  3. Use entrada de porta dupla, placas "Somente pessoal autorizado" e telas de insetos no inseto. Qualquer janela deve ser selada para evitar a contaminação da colônia com insetos WT e ajudar a evitar fugas de dentro do inseto.
  4. Regulamentos e autoridades locais podem ter requisitos adicionais ou alternativos específicos. Entre em contato com as autoridades competentes para obter informações/orientações em um estágio inicial e garanta todas as licenças e aprovações necessárias antes de estabelecer a cepa RIDL em um inseto.
  5. O inseticário de criação em massa só deve ser usado para a criação ridl. Nenhuma outra cepa ou insetos deve estar presente. Isto é para evitar a contaminação da cepa RIDL e contaminação com patógenos que podem afetar o condicionamento físico e a sobrevivência, reduzindo a produtividade e a eficácia dos machos soltos.

3. Design In insectário

  1. A Figura 2 mostra um plano do inseto utilizado na Biofábrica Moscamed no Brasil.
  2. A temperatura de todos os quartos foi de 26 °C ± 2) com umidade relativa de 70-80% e 12:12 hr luz: ciclo escuro usando tiras de luz fluorescentes.
  3. Este projeto pode ser modificado de acordo com requisitos específicos de espaço, por exemplo, a escala da versão determinará o tamanho geral. No entanto, a produção, criação e classificação de ovos, controle de qualidade (QC) e lançamentos devem ser separados em quatro áreas distintas: Colônia de Produção de Ovos, Geração de Lançamento, QC e Armazenamento Adulto para Lançamento.
  4. A sala colônia de produção de ovos (aproximadamente 20 m2) é usada para produzir ovos para a geração de lançamento.
  5. A área de Controle de Qualidade é onde são realizados experimentos para verificar procedimentos e a aptidão da linha RIDL, incluindo medidas de taxa de escotilha, números de pupas, tamanho de pupa e eficácia de medição de classificação e remoção de fêmeas. Também são realizados testes para contaminação por WT verificando a presença de marcador de fluorescência e fenótipo usando ensaios offset que medem a letalidade.
  6. A sala de Geração de Liberação (aproximadamente 36 m2) requer espaço adequado para bandejas e a triagem de larvas e pupas. As bandejas são mantidas em racks de alumínio construídos com propósito. Uma grande área de trabalho e pia são necessárias para a criação e triagem e outra pia grande é necessária para a lavagem de bandejas e gaiolas. Uma armadilha de captura de filtros foi incluída na saída de água residuais das pias para mitigar a fuga de mosquitos vivos através do esgoto.
  7. Toda a água utilizada para as bandejas é descartada através de um ralo, que possui um compartimento contendo uma malha que impede a fuga de insetos em qualquer estágio de desenvolvimento.
  8. Uma área é necessária para o armazenamento de adultos para lançamento (Adult Storage for Release, Figura 2) contendo racking para segurar os dispositivos de liberação enquanto os adultos amadurecem antes do lançamento.

Métodos de produção para criação em massa RIDL:

A Colônia de Produção de Ovos produz os ovos que são utilizados na Geração de Liberação (Figura 1)para produzir adultos. Há muitas semelhanças nos dois métodos de criação, mas também algumas diferenças distintas. Os processos de criação que são os mesmos para ambos os procedimentos são descritos apenas na seção Colônia de Produção de Ovos.

Colônia de Produção de Ovos

4. Produção larval

A Colônia de Produção de Ovos gera ovos OX513A RIDL homozigos8 para a Geração de Liberação. O controle de alta qualidade garante viabilidade, condicionamento físico e integridade dos ovos fornecidos.

  1. O estímulo para a eclosão é a submersão na água com um baixo nível de oxigênio dissolvido. Para reduzir o nível de oxigênio na água, aqueça a água até ferver e coloque imediatamente 400 ml em potes de vidro de 500 ml (circunferência de abertura de 74 mm), aperte a tampa com segurança e deixe à temperatura ambiente por várias horas para esfriar.
  2. Coloque 1 g de ovos em um pote de água fervida, sele e espere por uma hora. Transfira o conteúdo para uma bandeja com 2 L de água e deixe durante a noite em condições inseticida.
  3. Coloque as larvas eclodidas em um volume conhecido de água e mexa usando um agitador magnético e pulga por tempo suficiente para tomar alíquotas; mexer vigorosamente ou por tempo prolongado danifica larvas e deve ser mantido ao mínimo. O volume padrão usado para chocar larvas é de 1 L, porém densidades de mais de 300 larvas/ml são difíceis de contar e podem ser prejudiciais. Portanto, não eclodam mais de 300.000 ovos/L de água.
  4. Determine a taxa de escotilha tomando três alíquotas de 1 ml e colocando em uma folha de papel absorvente, com uma grade de 1 cm quadrados, em cima de uma esponja absorvente para absorver qualquer excesso de água.  Conte o número de ovos eclodidos e nãotched de três quadrados procurando a tampa faltante de um ovo eclodido. Uma taxa de escotilha em torno de 80-90% é esperada.
  5. Pegue quatro alíquotas de 1 ml cada e coloque em quatro barcos de pesagem pretos (larvas são brancas e, portanto, mais facilmente visíveis contra um fundo preto) e conte o número de larvas vivas presentes pelos olhos; recomenda-se o uso de um contador. O número médio de larvas por ml é então usado para calcular o volume de água para adicionar em cada bandeja para obter o número desejado de larvas por bandeja.
  6. Pode haver grandes diferenças na densidade em que as larvas podem ser criadas entre cepas e espécies. Também é desejável comparar o tamanho masculino adulto RIDL com os machos do tipo selvagem; idealmente você quer semelhante a machos RIDL de tamanho maior que podem competir com sucesso com machos selvagens. Portanto, para cada cepa RIDL, a densidade ideal de larvas precisa ser determinada e é uma troca contra as restrições de espaço para a criação e a escala de produção. Densidades que variam de 0,1-2,5 larva/ml que encontramos como uma boa combinação de produção e qualidade; também discutido por Medici23.
  7. Adicione as larvas às bandejas. Em nossa instalação usamos bandejas medindo cerca de 53 cm x 37 cm x 8 cm (L x W x H) e a quantidade necessária de água para alcançar a densidade de larvas para produção.
  8. Adicione uma solução de estoque de tetraciclina (3 mg/ml em água) às bandejas a uma diluição de 1:100 para obter a concentração final necessária de 30 μg/ml.
  9. Alimente larvas com alimentos de peixe floco(www.sera.de)diariamente, que foi esmagada em pó fino. A Tabela 1 mostra o regime típico de alimentação em mg de alimentos por larvas por dia. Alimentar larvas até o dia apropriado de triagem sob as condições insetíduas descritas acima.

5. Classificação de Larvas de Pupae e Pupae Macho/Fêmea

  1. Classifique larvas de pupas 8 dias após a eclosão separando as larvas da pupa. Então, sexo tipo a pupae para machos. Um dispositivo conhecido como separador deplacas 24,25 pode classificar larvas de pupas machos e de pupas fêmeas. A Figura 3 ilustra o uso deste separador de placas para separar larvas do macho e da pupa fêmea.
  2. Usando uma colher de medição com uma malha na parte inferior, calibra-a com 500 pupas ou mais e use-a para montar gaiolas e estimar a quantidade total de pupas machos e fêmeas produzidas.
  3. No primeiro dia de triagem (dia 8) a maioria das pupas são machos, então coloque as larvas classificadas de volta em uma bandeja e volte até o dia seguinte, quando a maioria das pupas são fêmeas(Figura 4).
  4. Repita o processo de triagem a cada dia, conforme descrito nas etapas 2.1-2.3 até que todas as larvas tenham filhote ou até o final de uma semana de trabalho.
  5. Coloque 1.000 pupas machos (usando a colher de medida) em uma gaiola e no dia 9 adicione 3.000 pupas fêmeas à mesma gaiola (usamos tubos de PVC de 30 cm de altura e 30 cm de diâmetro adaptados com topo de malha e um orifício de acesso líquido, mas 30 cm x 30 cm x 30 cm de gaiolas plásticas também estão disponíveis no BugDorm).
  6. Permitir que os adultos acasalem por pelo menos 2 dias e forneçam-lhes solução de sacarose (10%) em algodão molhado ad libitum antes da alimentação sanguínea. Coletar ovos por duas semanas (~dois ciclos gonotróficos) com duas rações de sangue por semana. Isso rende uma média de 143.000 ovos de uma gaiola de 3.000 fêmeas (uma média de 48 ovos/fêmea). Para a produção de 4 milhões de ovos por semana, cerca de 28 gaiolas precisam ser montadas a cada semana.

6. Alimentação sanguínea

  1. Um sistema de alimentação de placas de alumínio fornece gaiolas com sangue duas vezes por semana. Um bolsão de sangue é criado na lateral de uma placa de alumínio (10 cm x 10 cm x 3 mm) com Parafilm(Figura 5). Para incentivar a alimentação, o sangue é aquecido colocando um saco de feijão aquecido em cima do alimentador de pratos. O saco de feijão consistia de aproximadamente 250 g de grãos de trigo em um saco de pano, que é aquecido por cerca de 10 segundos em um micro-ondas. O sangue que usamos para alimentação é de um matadouro local; como esses animais (principalmente cabras e ovinos) são para consumo humano, eles são testados para evitar a presença de patógenos.
  2. Três dias após a alimentação sanguínea, um local de oviposição para as fêmeas colocarem seus ovos é fornecido. O local de oviposição é um recipiente de plástico redondo cheio de cerca de 1/4 com água e papel filtro cobrindo o interior. Dois dias depois, o local da oviposição é removido. Para a produção máxima de ovos, certifique-se de que o papel do filtro cubra toda a superfície disponível dentro do recipiente e permaneça molhado.
  3. Remova o papel do ovo e coloque no papel absorvente para secar em condições insetívias; ovos requerem um período de condicionamento em alta umidade (mais de 70%) de pelo menos 48 horas após ser colocado. Os ovos podem ser deixados no inseto por até 3 meses com redução mínima na taxa de escotilha, desde que a umidade seja mantida alta25.
  4. A colônia de produção de ovos precisa ser de tamanho suficiente para fornecer o número de ovos necessários semanalmente para o programa de liberação. A instalação descrita acima pode produzir aproximadamente 4 milhões de ovos com 28 gaiolas criadas semanalmente. Recomenda-se manter ovos suficientes armazenados para garantir pelo menos 4 semanas de ovos para a Geração de Sol e Colônia de Produção de Ovos.

Geração de Lançamento

7. Produção larval

Os processos de eclosão, criação e triagem para a geração de lançamento são idênticos ao método descrito anteriormente para a colônia de produção de ovos. No entanto, a escala de produção é muito maior e isso requer mais bandejas e mais esforço.

8. Triagem larvas, pupas machos e pupas fêmeas

  1. A classificação de larvas, pupas machos e pupas fêmeas é idêntica ao método descrito para produção de ovos.
  2. Após a triagem da pupa macho é importante verificar se há contaminação feminina antes da liberação; não deve haver mais de 1% de mulheres presentes. Pegue três alíquotas de 500 pupas (três colheres de medição aleatórias de pupas) e conte o número de pupas fêmeas presentes. As fêmeas podem ser identificadas, pois são geralmente maiores que os machos e por diferenças na forma do lobo genital(Figura 6)27. Se houver mais de 1% de fêmeas, elas devem ser recorrer e verificar novamente.
  3. Use apenas os machos dos dias 8 e 9 para liberação; autoclave qualquer larva restante e pupae. No Brasil, esse resíduo deve ser tratado da mesma forma que o lixo médico, mas as regulamentações podem diferir em outros países. Não utilize pupas e larvas fêmeas da Geração de Liberação para a Colônia de Produção de Ovos devido a diferenças no controle de qualidade, na criação e na contaminação de números maiores e menor controle de qualidade.

Armazenamento adulto para lançamento: Coloque os machos em dispositivos de liberação para emergir e amadurecer antes do lançamento. Os detalhes dos dispositivos de liberação não estão cobertos neste método. No entanto, a capacidade dos dispositivos de liberação que usamos é de cerca de 1.000 homens. Os detalhes do método de liberação (dispositivo de liberação e sistema de liberação) não estão cobertos neste método.

Representative Results

Os resultados esperados para a produção são mostrados na Figura 4. Os machos filhotes primeiro, atingindo o pico no dia 8 e as fêmeas atingem o pico no dia 9 após a eclosão. É importante medir essa curva de pupação para saber o melhor momento para classificar os machos das fêmeas.

Os resultados de mais de 6 meses de triagem de pupas masculinas e femininas mostram que a contaminação feminina, em média, é de 0,02% (Figura 5; SEM = 0,004%). Essa taxa de contaminação representa apenas 400 mulheres liberadas ao longo de um mês de lançamentos (aproximadamente dois milhões de homens). A produção atual de ovos por semana é de 4 milhões. Destes, 3,5 milhões são hatched para colônia de ovos e produção com o restante armazenado para backup. Aproximadamente 11% dos ovos são usados para colônia de produção de ovos e restante para geração de liberação. Taxa de escotilha de ovos é de 87,3% (SEM = 0,5%) e rendimento de pupas machos de larvas L1 é em média 29,5% (SEM = 1,2). Dois milhões de larvas são criadas toda semana para a colônia Geração de Libertação produzindo cerca de 571.000 pupas machos (SEM = 14.000). Pupae e mortalidade adulta durante o surgimento e liberação em média 5%, resultando em aproximadamente 543.000 (SEM = 13.000) liberados mosquitos machos adultos por semana. Espera-se que a produção atual de 4 milhões de ovos/semana possa ser reduzida para ~3 milhões/semana, com maior otimização para reduzir a perda de desperdício e armazenamento. No total, são necessários 6 funcionários para a produção descrita; quatro trabalhando na geração de liberação e os dois restantes na colônia de ovos.

Controle de Qualidade

O controle de qualidade é essencial para manter a qualidade dos adultos, eficiência da criação, mão-de-obra e custos.

Controle de fenótipo transgênico

A fim de verificar a expressão genética RIDL são realizados dois controles, primeiro para verificar a expressão do marcador de fluorescência e, em segundo lugar, verificar a expressão do traço de letalidade RIDL na ausência de tetraciclina. Todas as larvas devem expressar o marcador fluorescente. Para verificar se o marcador fluorescente está sendo expresso como esperado, 2.000 primeiras larvas instar são verificadas sob um estereótipo Leica MZFLIII com filtro DsRed2 (Texas Red) para determinar se algum indivíduo não fluorescente está presente. Sem tetraciclina, o gene RIDL é expresso e esperamos 3-4% de sobrevivência para adultos8. Para verificar isso, uma bandeja extra é configurada para cada lote de liberação sem tetraciclina. A única diferença para a criação normal é que o alimento é reduzido em 2/3 a partir do dia 6, porque o acúmulo de alimentos em excesso devido a larvas mortas pode resultar em crescimento bacteriano em excesso.

Controle de rearmamento

Quatro bandejas da geração de lançamento são escolhidas aleatoriamente para serem classificadas e contadas separadamente. O número de pupas machos e fêmeas é registrado a partir de cada bandeja todos os dias(Figura 4). Qualquer desvio do número esperado de machos e fêmeas indica um problema potencial que pode afetar a produção e/ou a aptidão e pode ser comparado à colônia de ovos para ajudar a determinar a origem dos problemas.

Medidas de pupae

O tamanho do pupae mostrou-se correlacionado com o tamanhoadulto 28. Como um controle de qualidade para tamanho adulto, a largura cefalóxe é medida de pelo menos 30 pupas machos para cada dia de classificação da Geração de Lançamento; para a Colônia de Produção de Ovos pupas fêmeas também são medidas. A largura média do cefalóxe foi de 1,05 mm (SEM 0,005) para homens soltos e 1,04 mm (SEM = 0,006) e 1,29 mm (SEM = 0,006) para homens e mulheres, respectivamente, Produção de Ovos, Colônia; resultados semelhantes foram obtidos para a criação de massa Ae. albopictus 24.

Figure 1
Figura 1. Estágios de criação de massa de mosquitos para uso em um programa RIDL/SIT. A Colônia de Produção de Ovos possui um alto nível de controle de qualidade para garantir a qualidade dos ovos fornecidos à geração de liberação.  Os ovos são criados até pupas na colônia de libertação, onde os machos são classificados das fêmeas.  Os adultos do sexo masculino são então usados para o programa de controle RIDL.

Figure 2
Figura 2. Esquema da instalação de criação para a produção de machos RIDL para um programa de lançamento. Ovos de alta qualidade são continuamente produzidos na sala da Colônia de Produção de Ovos e, em seguida, são criados através de pupas na sala Geração de Liberação. As larvas e as pupas são então separadas e as pupas classificadas para os machos. Os machos são então colocados em dispositivos de liberação e autorizados a amadurecer para adultos para liberação na sala de armazenamento e liberação de adultos. 

Figure 3
Figura 3. Separando larvas, pupas machos e pupas fêmeas usando um separador deplacas 26.  O separador de placas usa a diferença de tamanho entre larvas, pupas machos e pupas fêmeas para classificar essas três diferentes fases de vida; larvas tendem a ser menores do que pupas machos que por sua vez são menores do que pupas fêmeas.  O instrumento é composto por duas placas de vidro; um é fixado em uma estrutura metálica inclinada e o outro fica em cima da primeira placa e pode ser movido em relação ao primeiro usando quatro parafusos de ajuste(A).  Os quatro parafusos de ajuste permitem que a placa externa seja fixada em um ângulo para a placa traseira para que um espaço em forma de cunha seja formado entre as placas, afunilando para baixo.  Larvas e pupas são derramadas entre as placas de vidro(B)e lavadas suavemente usando uma mangueira de água(C).  Ajustando o ângulo da placa, larvas, pupas machos e pupas fêmeas podem ser separadas(D).  Com a descarga contínua e o aumento do ângulo da placa, as larvas podem ser lavadas primeiro (em uma peneira), seguidas pela pupae macho e, finalmente, a pupa fêmea. 

Figure 4
Figura 4. Curvas de pupação para ae. aegyptide criação em massa .  Este gráfico mostra a porcentagem média de pupação para pupas de massa criadas ridl macho e fêmea durante 23 semanas de observação com ~135.000 pupas recuperadas por semana.  Barras de erro = erro padrão de média, n = 23. Na primeira coleta (dia 8) recuperamos em média 59% de pupas machos e 30% fêmeas do total de pupas recuperadas de bandejas ao longo de 5 dias. 

Figure 5
Figura 5. Contaminação feminina média de pupas machos classificadas. Este gráfico mostra a porcentagem média mensal de contaminação feminina durante a triagem masculina no dia 8 após a eclosão durante um período de seis meses. 

Figure 6
Figura 6. Sistema de alimentador de sangue de placa de alumínio. A placa (B) é coberta com Parafilm (A) e sangue pipetado em um bolso e, em seguida, selado(D). A placa é colocada em uma gaiola e aquecida colocando um saco de feijão aquecido(C)em cima(E). 

Figure 7
Figura 7. Distinguindo pupas machos e fêmeas Ae. aegypti. Ae. aegypti pupae pode ser alimentado de forma confiável pelas diferenças na forma do lobo genital (no final dos segmentos abdominais pupais logo abaixo das pás). Além disso, os machos também tendem a ser menores que as fêmeas.   

Table 1
Mesa 1. Regime geral de alimentação para larvas Ae. aegypti RIDL (mg de alimento por larva por dia). Para calcular a quantidade real de alimentos necessários multiplique pelo número total de larvas por bandeja.

Discussion

RIDL é um método eficaz e ambientalmente seguro de controle de mosquitos3,29-31. A técnica é aplicável a um programa integrado de manejo de pragas e a maioria dos métodos de controle atuais, incluindo larvicidas, redução de criadouros e adulticicidas são compatíveis com essa tecnologia. Este método descreve como produzir até 570.000 pupas machos RIDL por semana para uso no controle de Ae. Aegypti e até onde sabemos esta é a primeira descrição da produção de mosquitos transgênicos nesta escala. Alguns sistemas de produção comparáveis foram desenvolvidos para o tipo selvagem Ae. aegypti nas décadas de 1960 e 197025, porém não houve produção comparável nesta escala desde então. No Brasil, cerca de 11 milhões de homens foram soltos de fevereiro de 2011 até fevereiro de 2012. O número de machos necessários para que uma determinada área seja controlada depende de uma série de fatores, incluindo o tamanho da população selvagem, dispersão de machos soltos, sobrevivência e competitividade do acasalamento dos machos após a liberação e condições ambientais.  Estudos anteriores mostraram que o RIDL pode reduzir uma população de mosquitos em pelo menos 80%9.

É necessário um equilíbrio entre a otimização da criação em massa para escala de produção e custo versus qualidade dos machos. Por exemplo, o aumento da densidade larval pode aumentar a capacidade de produção reduzindo o espaço necessário, o trabalho e o tempo para a pupação32. No entanto, densidades muito altas de larvas podem resultar em machos de vida menor e mais curta com capacidade de acasalamento reduzida32,33. A qualidade dos machos em relação a um programa SIT será avaliada pela capacidade dos machos soltos de acasalar com fêmeas em campo. Uma avaliação extensiva de campo é necessária para avaliar a competitividade do acasalamento em relação às contrapartes selvagens9,10. Isso muitas vezes torna impraticável avaliar exatamente quais fatores fazem um mosquito macho de "alta qualidade". No entanto, manter a produção e a qualidade consistentes (na medida em que pode ser avaliado rotineiramente) na criação em massa em larga escala é primordial. Isso requer um alto nível de vigilância e padronização de todo o processo com pequenas flutuações potencialmente tendo um impacto significativo. A alíquota das larvas L1 é um passo crítico e ilustra este ponto. Aliquotar o número correto de larvas em bandejas é essencial para uma produção de boa qualidade. O regime alimentar é precisamente adaptado para o número específico de larvas. Poucas/muitas larvas resultarão em excesso/sob alimentação, o que influencia a sobrevivência larval, o tamanho da pupae e o tempo para a pupação. Se há um segredo para a arte da criação em massa é garantir que os muitos pequenos passos no ciclo de produção sejam conduzidos de forma consistente, precisa e com um alto nível de controle de qualidade, como descrito neste artigo.

Disclosures

Os autores afiliados à Oxitec possuem participação em emprego e/ou participação acionária na Oxitec Ltd. A Oxitec Ltd e a Universidade de Oxford possuem propriedade intelectual relacionada ao tema deste artigo.

Acknowledgments

Agradecemos à Biofábrica Moscamed Brasil, à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnologia (CNPq) pelo apoio financeiro.  Gostaríamos também de agradecer às seguintes pessoas pela ajuda; Miriam dos Santos, Gildeane Silva, Gessilane dos Santos, Fabio Gonçalves, João Paulo Oliveira, Luiza Garziera, José Carlos Valença.

Materials

Name Company Catalog Number Comments

Vipan Premium

 Sera GmbH

190

http://www.sera.de/uk/pages/products/product/sera-vipan-3.html

Tetracycline

 Sigma Aldrich

T7660

http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?D7=0&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&N4=T7660|SIGMA&N25=0&QS=ON&F=SPEC

Plate separator

 J.W. Hock

5412

http://www.johnwhock.com/download/manuals/instr_5412_separator.pdf

Parafilm M

 Pechiney Plastic packing

PM-996

www.parafilm.com

Rearing pans for Release generation (53 cm x 38 cm x 8 cm)

 Pleion

0757

http://pleion.actcenter.com.br/produtos.asp?opcao=1

Fluorescent scope

 Leica Microsystems

MZ FLIII

http://www.leica-microsystems.com/fileadmin/downloads/Leica%20MZ%20FLIII/Brochures/M1-160-0de.pdf

Adult cages

 BugDorm

DP1000

http://bugdorm.megaview.com.tw/bugdorm-1-insect-rearing-cage-30x30x30-cm-pack-of-one-p-29.html

Filter paper

 CELAB

http://www.casadolaboratorio.com.br/subpage118.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Ciências Ambientais Questão 83 Aedes aegypti,criação em massa supressão populacional transgênico inseto mosquito dengue
Produção em massa de <em>Aedes aegypti</em> geneticamente modificado para lançamentos de campo no Brasil
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Carvalho, D. O., Nimmo, D., Naish, N., McKemey, A. R., Gray, P., Wilke, A. B. B., Marrelli, M. T., Virginio, J. F., Alphey, L., Capurro, M. L. Mass Production of Genetically Modified Aedes aegypti for Field Releases in Brazil. J. Vis. Exp. (83), e3579, doi:10.3791/3579 (2014).

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