Summary
RIDL®(優勢致死性を持つ昆虫の放出)システムを用いてAedes aegyptiの集団抑制を達成するためには、多数の雄の蚊を放出する必要がある。これは、高品質のオスの蚊の最大数を得るために信頼性の高いシステムを提供するために大量の飼育技術と技術の使用を必要とします。
Abstract
蚊との戦いに勝つために新しい技術と方法が求められています。分子技術の最近の進歩は、滅菌昆虫技術(SIT)1-3を中心に、蚊対策の新しい革新的な方法の開発につながっています。RIDL(ドミナント致死性を持つ昆虫の放出)4として知られている制御方法は、SITの周りに基づいているが、放射線滅菌の必要性を除去するために遺伝的方法を使用する5-8。Ae. aegyptiの RIDL 株はグランド ケイマン9,10のフィールドでテストに成功しました;さらに、世界中の他の国々で、さらなる分野利用が計画または進行中である。
昆虫の大量飼育は、いくつかの昆虫種で、週に数十億のレベルに確立されています。しかし、蚊では、一般的にはるかに小規模に飼育が行われ、1970年代から80年代にかけてほとんどの大規模な飼育が行われています。RIDLプログラムの場合、病気を噛んで伝染させるので、できるだけ少ない女性を放出することが望ましい。大量飼育プログラムでは、卵の生産、子犬まで卵を飼育し、放出前にメスから男性を選別するという、放出するオスを生産するいくつかの段階があります。これらの男性は、次に、子犬または成人11,12としてリリースされたRIDLコントロールプログラムに使用されます。
RIDLを使用して蚊の集団を抑制するには、高品質の男性成人の多数を飼育する必要があります13,14.以下は、放出のためのOX513A(ae.aegypti 8のRIDL株)の大量飼育方法を説明し、対照プログラムのための卵の産生およびRIDL雄の大量飼育に必要な技術をカバーする。
Introduction
蚊は、人間の病気の範囲を引き起こす可能性のある多くの病原体を伝播し、これらの蚊を制御し、何世紀にもわたって進行中の戦いでした。化学的および生物学的方法に基づいて昆虫を制御する戦略は、いくつかの顕著な成功を収めていますが、多くの場合、制御は長期的に持続可能ではありませんでした。例えば、ブラジルは50年代 にAe.aegypti の根絶を達成しましたが、蚊は過去40〜50年間に再侵略しました。これは、殺虫剤耐性、環境損傷、悪い制御プログラムの実施15-20、および十分な監視または応答なしに急速な再侵攻を含む多くの原因に起因することができる。
蚊との戦いに勝つために新しい技術と方法が求められています。 分子技術の最近の進歩は、滅菌昆虫技術(SIT)1-3を中心に、蚊対策の新しい革新的な方法の開発につながっています。RIDL(優勢致死性を持つ昆虫の放出)4として知られている制御方法は、SITの周りに基づいていますが、放射線滅菌の必要性を取り除くために遺伝的方法を使用しています。RIDL株は、Ae. aegypti 5-8を含むいくつかの害虫種のために構築されています, Ae. aegyptiのRIDL株は、グランドケイマンのフィールドで正常にテストされました9,10;さらに、世界中の他の国々で、さらなる分野利用が計画または進行中である。 RIDLを使用して蚊の集団を抑制するには、高品質の男性成人を大量に飼育する必要があります 3,14.
SITプログラムの場合、男性のみを解放することが望ましいと考えられています。メスの蚊は噛んで病気を伝播する。さらに、放出された無菌の男性は、プログラムの有効性を低下させる解放された女性によって「気を散らす」ことができます。男性のみのリリースは、照射された地中海の果実ハエ21を用いた大規模なフィールド実験において、男女混合放出よりも3〜5倍の効果が示された。
RIDL大量飼育プログラムでは、放出のための男性を生産するいくつかの段階があります。 1つ目は、放出生成に必要な卵を作製する方法です(図1)。次の段階は、卵を子犬や大人にまで飼育し、幼虫と雌の子犬から幼虫を分離することです。女性からの男性の大規模な分離は、集団選別22に適した特定のライフステージで男女間の差を必要とする。 Ae. aegypti( および他の蚊種)では、性分離技術のために利用することができるオスとメスの子犬の間に有意なサイズ差があります。ソートされたRIDL男性は、その後、子犬または大人11,12としてコントロールプログラムで解放されます。
以下に、AeのRIDL株であるOX513Aの大量飼育方法について説明 する。アエジプティ、 リリースのため。説明する方法は、コントロールプログラムのための卵およびRIDL雄の生産に必要な技術をカバーする。
Protocol
昆虫の要件
1. 概要
- 質量の飼育は、それぞれがマスリアリングユニットの異なる領域で行われるいくつかのフェーズを持っています。 図1 は、飼育の主な段階と、それらが大量の飼育施設で発生する場所を示しています。
2. 昆虫のバイオセキュリティに関する考察
- このプロジェクトは、サンパウロ大学(ブラジル)の動物倫理委員会によって承認され、必要なすべての許可と承認が得られました。
- RIDL システムは条件付き致死性を使用します。栄養補助食品(テトラサイクリン)は、昆虫を大量に飼育することを可能にするRIDL系の発現を防ぐ。テトラサイクリンがなければ蚊は死ぬ。テトラサイクリンは野生のAe.aegyptiの繁殖地には見つからないので、脱出から生み出された子孫は生き残りません。 これは、他の方法(すなわち放射線)によって殺菌された野生型(WT)昆虫を使用する上で、セキュリティの追加レベルを追加します。
- 二重ドア入力、「公認人員のみ」の標識と昆虫スクリーンを使用して、昆虫の中に。任意の窓は、WT昆虫とのコロニーの汚染を避けるために密封され、昆虫の中からの脱出を防ぐのに役立つ必要があります。
- 現地の規制および当局には、特定の追加要件または代替要件がある場合があります。早い段階で情報やガイダンスについては関係当局に連絡し、必要な許可と承認を確保してから、昆虫の中でRIDL株を確立してください。
- 大量飼育昆虫はRIDL飼育にのみ使用してください。他の株や昆虫は存在してはならない。これは、RIDL株の汚染と、フィットネスと生存に影響を与える可能性のある病原体との汚染を避け、解放された男性の生産性と有効性を低下させるためです。
3. 昆虫設計
- 図2 は、ブラジルのビオハブリカ・モスカメッドで使用された昆虫の計画を示す。
- 全室の温度は26°C±2)で、相対湿度は約70~80%、蛍光灯を用いた12:12時間の明度:暗いサイクルでした。
- このブループリントは、特定のスペース要件に従って変更できます (例えば 、リリースのスケールが全体的なサイズを決定します)。しかし、卵の生産、飼育と選別、品質管理(QC)およびリリースは、4つの異なる領域に分ける必要があります:卵生産コロニー、リリース生成、QC、およびリリースのための成人貯蔵。
- 卵生産コロニールーム(約20 m2)は、放出生成のための卵を生産するために使用されます。
- 品質管理領域は、ハッチレート、子犬の数、子犬の大きさ、女性の選別と除去の有効性を測定するなど、手順とRIDLラインの適合性をチェックするための実験を行う場所です。また、致死性を測定するオフセットアッセイを用いて蛍光マーカーと表現型の有無をチェックすることにより、WT汚染の検査も行われます。
- 剥離生成室(約36 m2)には、トレイと幼虫や子犬の選別のための十分なスペースが必要です。皿は専用のアルミニウム製の棚に保持される。大きな作業領域とシンクは、飼育と仕分けのために必要とされ、別の大きなシンクは、トレイやケージの洗浄に必要です。フィルターキャッチトラップは、下水道を通して生きている蚊の脱出を軽減するために、シンクから排水口に含まれています。
- トレイに使用されるすべての水は、開発のどの段階でも昆虫の脱出を防ぐメッシュを含むコンパートメントを持つドレインを通して配置されます。
- 大人がリリース前に成熟している間、リリースデバイスを保持するためのラックを含むリリース(リリース用の成人ストレージ、 図2)のための大人の保管には、エリアが必要です。
RIDL を大量に飼育するための製造方法:
卵生産コロニーは、成人を生産するために放出生成(図1)で使用される卵を生産します。2 つのリアリング方法には多くの類似点がありますが、いくつかの明確な違いもあります。両方の手順で同じ飼育プロセスについては、エッグ生産コロニーセクションのみで説明します。
卵生産コロニー
4. ラーバル生産
卵生産コロニーは放出生成のためのホモ接合OX513A RIDLの卵8 を発生させる。高い品質管理は、供給された卵の生存率、適合性およびひずみの完全性を保証します。
- 孵化の刺激は、溶存酸素の低レベルで水中に沈む。水中の酸素濃度を下げるには、沸騰するまで水を加熱し、すぐに500mlのガラス瓶(74mmの開口円周)に400mlを入れ、蓋をしっかりと固定し、室温で数時間放置して冷却します。
- 沸騰したお湯の瓶に卵1gを入れ、再シールし、1時間待ちます。内容物を2L水でトレイに移し、昆虫条件下で一晩放置します。
- 孵化した幼虫を既知の水の体積に入れ、磁気スターラーとノミを使用してアリコートを取るのに十分な時間をかき混ぜます。激しくかき混ぜるか、または長い時間のために幼虫を損傷し、最小限に抑えるべきです。幼虫の孵化に使用される標準的な体積は1 Lですが、300以上の幼虫/mlの密度は数えにくく、損傷を与える可能性があります。したがって、約30万個以上の水を孵化しないでください。
- 3つの1 mlアリコートを取り、1cmの正方形のグリッドを持つ吸収性紙の上に、余分な水を浸すために吸収性スポンジの上に置くことによって、ハッチレートを決定します。 孵卵の欠けているキャップを探して、3つの正方形から孵化卵と孵化していない卵の数を数えます。ハッチ率は80~90%前後と予想されます。
- それぞれ1mlの4つのアリコートを取り、4つの黒い重量を量るボート(幼虫は白く、したがって黒い背景に対してより容易に見える)に入れ、目で存在する生きた幼虫の数を数えます。カウンターの使用をお勧めします。ml当たりの平均幼虫数は、各トレイに追加する水の量を計算するために使用され、トレイあたりの必要な幼虫数を得る。
- 幼虫が系統と種の間で飼育される密度には大きな違いがある。また、RIDL成人男性のサイズを野生型の男性と比較することも望ましいです;理想的には、野生の男性と正常に競合することができる大きなサイズのRIDLの男性に似てしたいです.したがって、各RIDL株の場合、幼虫の理想的な密度を決定する必要があり、飼育のためのスペース制約と生産の規模に対するトレードオフです。0.1~2.5の幼虫/mlの密度は、生産生産と品質の良い組み合わせであることが分かりました。また、メディチ23によって議論.
- トレイに幼虫を加えます。当社の施設では、約53cm×37cm x 8cm(L x W x H)のトレイと必要な量の水を使用して、生産用の幼虫の密度を達成しています。
- テトラサイクリン(水中3mg/ml)のストック溶液を1:100希釈でトレイに加え、必要な最終濃度30μg/mlを得ます。
- 幼虫にフレークフィッシュフード(www.sera.de)を毎日食べ、細かい粉に押しつぶします。 表1 は、一日あたりの幼虫あたりの食物のmgにおける典型的な摂食体制を示す。上述の昆虫条件下での選別の適切な日まで幼虫を供給する。
5. 子犬と男性/女性の子犬から幼虫を選別
- 幼虫と子犬を分離して孵化の8日後に子犬から幼虫を選別する。その後、男性のための子犬をセックスソート。プレート分離器24,25 として知られている装置は、雄の子犬と雌の子犬から幼虫を選別することができます。 図3 は、幼虫と雌の子犬を分離するためにこのプレートセパレータを使用することを示す。
- 底にメッシュを入れた測定スプーンを使用して、500匹以上の子犬でキャリブレーションし、ケージを設置し、生産された男性とメスの子犬の総量を推定するために使用します。
- 選別の初日(8日目)は、ほとんどの子犬は男性なので、並べ替えられた幼虫をトレイに戻し、子犬のほとんどが女性である翌日まで後方に戻します(図4)。
- すべての幼虫が子犬になるまで、または作業週の終わりまで、ステップ2.1-2.3に記載されているように、毎日ソートプロセスを繰り返します。
- ケージに1,000匹のオスの子犬(メジャースプーンを使用)を入れ、9日目に同じケージに3,000匹のメスの子犬を加えます(メッシュトップとネットアクセスホールに適合した高さ30cm、直径30cmのPVCパイプを使用していますが、30cm x 30cm x 30cmのプラスチックケージもBugDormから入手可能です)。
- 大人が少なくとも2日間交尾し、スクロース溶液(10%)を提供することを許可する血液供給の前に湿った綿 のアドリビタム に。週に2回の血液供給で2週間(2回のゴトロフィックサイクル)卵を集める。これは、3,000匹のメス(平均48個の卵/メス)のケージから平均143,000個の卵を生成します。週に400万個の卵を生産するには、毎週約28個のケージを設置する必要があります。
6. 血液供給
- アルミニウム板の供給システムは週に2回の血液を入れてケージを供給する。パラフィルム(図5)を使用して、アルミニウム板(10cm x 10cm x 3 mm)の側面に血液のポケットが作成されます。給餌を促すために、加熱されたビーンバッグをプレートフィーダーの上に置くことによって血液を温める。このビーンズバッグは、約250gの小麦粒を布袋に入れ、電子レンジで約10秒間加熱した。私たちが摂食に使用する血液は、地元のアバトワールからです。これらの動物(主にヤギと羊)は、病原体の存在を避けるためにテストされている人間の消費のためである。
- 授乳の3日後に、メスが卵を産むのに卵子を産むのに対する卵子部位が設けられる。オビポジション部位は、内部を覆う水とろ紙で約1/4に充填された丸いプラスチック容器です。2日後に、卵位部位が除去される。最大の卵の生産のために、フィルターペーパーが容器の中の利用可能な表面全体を覆い、濡れたままであることを確認してください。
- 卵紙を取り出し、昆虫条件下で乾燥させるために吸収性の紙の上に置きます。卵は、高湿度でのコンディショニングの期間を必要とします (70% 以上)敷設された後、少なくとも48時間の。卵は、湿度が高く保たれている限り、孵化率の最小限の減少で最大3ヶ月間昆虫に残すことができます。
- 卵生産コロニーは、放出プログラムのために毎週必要な卵の数を提供するのに十分な大きさである必要があります。上記の施設では、毎週28個のケージを設置して約400万個の卵を生産できます。放出生成と卵生産コロニーのための卵の少なくとも4週間を保証するために十分な卵を保管することをお勧めします。
リリース生成
7. ラーバル生産
放出生成のための孵化、飼育および選別プロセスは、卵生産コロニーのための前述の方法と同一である。しかし、生産の規模ははるかに大きく、これはより多くのトレイとより多くの労力を必要とします。
8. 幼虫、男性の子犬、女性の子犬を選別する
- 幼虫、雄の子犬、雌の子犬の選別は、卵の生産のために記述された方法と同じです。
- オスの子犬を選別した後、リリース前に女性の汚染を確認することが重要です。女性が1%を超える存在であってはならない。500匹の子犬(3匹のランダムな子犬測定スプーン)の3つのアリコートを取り、存在する女性の子犬の数を数えます。女性は、一般的に男性よりも大きく、生殖器葉の形状の違いから識別することができる(図6)27。1%以上の女性がいる場合は、リゾートし、再びチェックする必要があります。
- リリースのために8日目と9日目から男性のみを使用してください。残りの幼虫と子犬をオートクレーブ。ブラジルでは、この廃棄物は医療廃棄物と同じ方法で処理する必要がありますが、規制は他の国で異なる場合があります。品質管理、大量の飼育および汚染リスクの違い、および品質管理の低下のため、卵生産コロニーの放出生成から雌の子犬や幼虫を使用しないでください。
リリースのための大人のストレージ:リリース前に出現し、成熟するために解放デバイスに男性を配置します。リリース デバイスの詳細については、この方法では説明しません。しかし、私たちが使用するリリースデバイスの容量は約1,000人の男性です。リリース方法の詳細 (リリース デバイスとリリース システム) については、この方法では説明しません。
Representative Results
生産に期待される子犬の結果を 図 4に示します。オスは最初に子犬を出し、8日目にピークを迎え、孵化後9日目にメスがピークに達する。女性から男性を並べ替える最良の時期を知るために、この子犬曲線を測定することが重要です。
男性と女性の子犬を選別する6ヶ月以上の結果は、女性の汚染が平均0.02%であることを示しています(図5;SEM = 0.004%)。この汚染率は、リリースの1ヶ月間に放出されたわずか400人の女性(約200万人の男性)を表します。現在の週あたりの卵生産量は400万です。このうち350万個は卵のコロニーと生産のために孵化し、残りはバックアップのために保管されています。卵の約11%は卵生産コロニーに使用され、残りは放出生成のために使用されます。卵の孵化率の平均は87.3%(SEM = 0.5%)L1幼虫由来の雄の子犬の収量は平均29.5%(SEM = 1.2)です。約571,000匹の雄の子犬(SEM = 14,000)を生産するリリースジェネレーションコロニーのために、毎週200万匹の幼虫が飼育されています。発育中および放出中の成人死亡率は平均5%であり、その結果、1週間に約543,000個(SEM =13,000)が成人雄蚊を放出した。現在の400万個の卵/週の生産量は、浪費と貯蔵による損失を減らすためにさらなる最適化を行い、週300万個に削減できると予想されています。合計で6人のスタッフが説明した生産のために必要とされます。4つは放出生成に取り組み、残りの2つは卵のコロニーに取り組んでいます。
品質管理
大人の質、飼育の効率、人件費、コストを維持するためには品質管理が不可欠です。
トランスジーン表現型コントロール
RIDL遺伝子発現を検証するために、2つのコントロールが行われ、まず蛍光マーカーの発現をチェックし、次にテトラサイクリンの存在しない場合にRIDL致死性形質の発現をチェックする。すべての幼虫は蛍光マーカーを発現する必要があります。蛍光マーカーが期待通り発現しているかどうかを確認するために、2,000頭の最初のインスター幼虫をDsRed2フィルター(テキサスレッド)を用いたライカMZFLIIIステレオ顕微鏡でチェックし、非蛍光個体が存在するかどうかを判断します。テトラサイクリンがなければ、RIDL遺伝子が発現し、成人8に対して3〜4%の生存率が期待される。これを確認するために、テトラサイクリンなしでリリースバッチごとに余分なトレイが設定されています。正常な飼育との唯一の違いは、死んだ幼虫による過剰な食物の蓄積が過剰な細菌増殖をもたらす可能性があるため、6日目から食品が2/3減少することです。
リアイング制御
リリース生成の4つのトレイは、ソートされ、別々にカウントされるようにランダムに選択されます。男性と女性の子犬の数は、毎日各トレイから記録されます(図4)。男性と女性の予想数からの逸脱は、生産および/またはフィットネスに影響を与える可能性があり、問題の原因を決定するのに役立つ卵コロニーと比較することができる潜在的な問題を示しています。
パパエ測定
pupaeサイズは、成体サイズ28と相関することが示されている。成人サイズの品質管理として、セファロソラックスの幅は、リリース世代からの各ソート日に対して少なくとも30人の男性の子犬を測定する。卵生産コロニーの雌の子犬も測定されます。平均頭蓋幅は、リリースされた男性の場合は1.05mm(SEM 0.005)、男性と女性の1.04mm(SEM = 0.006)と1.29mm(SEM = 0.006)でした。同様の結果が Ae. アルボピクトゥス 質量飼育24.
図 1.RIDL/SITプログラムで使用する蚊を大量に飼育する段階。 卵生産コロニーは、放出生成に供給される卵の品質を確保するために品質管理の高レベルを有する。 卵は、オスがメスから選別される放出コロニーの子犬に飼育される。 その後、男性成人はRIDLコントロールプログラムに使用されます。
図 2. リリースプログラムのためのRIDL男性の生産のための飼育施設の概略図。 高品質の卵は、卵生産コロニーの部屋で継続的に生産され、その後、リリースジェネレーションルームで子犬に飼育されています。その後、幼虫と子犬は分離され、子犬は男性のためにセックスソートされます。男性は、その後、リリースデバイスに配置され、大人の貯蔵室と解放室で解放するために成人に成熟することができます。
図 3. 幼虫、雄の子犬、および雌の子犬をプレートセパレータ26を用いて分離する。 プレートセパレータは、幼虫、オスの子犬、メスの子犬の間のサイズ差を使用して、これら3つの異なるライフステージをソートします。幼虫は雌の子犬よりも小さい雄の子犬よりも小さい傾向がある。 器械は2つのガラス板から成っている;1つは斜めの金属フレームに固定され、もう1つは最初のプレートの上に座り、4つの調整ネジ(A)を使用して最初のプレートに対して相対的に移動することができます。 4つの調整ねじは外板を裏板に対する角度で置くことを可能にするので、プレート間にくさび状のスペースが形成され、下方に先細りする。 ガラス板(B)の間に幼虫と子犬を注ぎ、水ホース(C)を用いて穏やかに洗浄する。 プレートの角度を調整することにより、幼虫、雄の子犬と雌の子犬を分離することができます(D)。 連続的な洗浄とプレートの角度を増加させると、幼虫は最初に(ふるいに)、続いて雄の子犬と最後にメスの子犬を通して洗い流すことができます。
図 4. 大量飼育RIDL Ae. aegyptiのための子犬曲線. このグラフは、週に約135,000匹の子犬が回復した23週の観察中に大量飼育RIDLの雄と女性の子犬の平均割合を示しています。 誤差範囲 = 平均の標準誤差 n = 23。最初のコレクション(8日目)では、5日間にわたってトレイから回収された総子犬から平均59%の男性と30%の女性の子犬を回復しました。
図 5. 並べ替えられた雄の子犬の平均的な女性汚染。 このグラフは、6ヶ月間に孵化した後の8日目の男性の選別中の女性汚染の月平均割合を示しています。
図 6. アルミニウム板の血の供給装置。 プレート(B)はパラフィルム(A)で覆われ、血液をポケットに入れ、密封(D)する。プレートはケージの上に置かれ、温めたビーンバッグ(C)を上に置いて加熱する(E)
図 7. 男性と女性 のAe.アエジプティ の子犬を区別する。 Ae. aegypti pupaeは、生殖器葉の形状の違い(パドルのすぐ下のプパル腹部セグメントの終わり)によって確実にセックスすることができます。さらに、男性は女性よりも小さい傾向があります。
表 1. Ae. aegypti RIDL幼虫の一般的な給餌体制 (1日あたりの幼虫あたりの食物の mg). 必要な食品の実際の量を計算するために、トレイあたりの幼虫の総数を掛ける。
Discussion
RIDL は、効果的で環境に配慮した安全な蚊3,29-31を制御する方法です。この技術は、統合された害虫管理プログラムに適用可能であり、幼虫、繁殖部位の減少および殺菌剤を含む最新の制御方法は、この技術と互換性がある。この方法は、Aeの制御で使用するために週に最大570,000人のRIDL雄の子犬を生産する方法を説明します。Aegyptiと私たちの知る限りでは、これはこの規模でトランスジェニック蚊の生産の最初の記述です。1960年代と70年代の25年代に野生型Ae.aegypti用にいくつかの同等の生産システムが開発されましたが、それ以来、この規模では同等の生産はありませんでした。ブラジルでは、2011年2月から2012年2月まで約1,100万人の男性が釈放されています。特定の領域を制御するために必要な男性の数は、野生の集団の大きさ、放出された男性の分散、放出後の男性の生存および交配競争力、および環境条件を含む多くの要因に依存する。 これまでの研究では、RIDLは蚊の個体数を少なくとも80%9減少させることができることが示されている。
生産規模とコスト対男性の品質に対する大量の飼育を最適化するバランスが必要です。例えば、幼虫密度を高めることは、必要なスペースを減らすことによって生産能力を高めることができ、分娩および子犬32にかかる時間。しかし、幼虫の密度が高すぎると、交配能力が32,33に低下した、より小さく、より短い生きた男性が生きることがある。SITプログラムに関連する男性の質は、最終的には、解放された男性が現場で女性と交尾する能力によって評価されます。野生の相手に対する交配の競争力を評価するために広範なフィールド評価が必要です9,10.これはしばしば、どの要因が「高品質」の雄の蚊を作るかを正確に評価することは現実的ではありません。しかし、大規模な大量の飼育において(日常的に評価できる範囲で)一貫した生産と品質を維持することが最も重要です。これには、大きな影響を与える可能性のある小さな変動を伴うすべてのプロセスの高いレベルの警戒と標準化が必要です。L1幼虫のアリツーチャーは重要なステップであり、この点を示しています。正しい数の幼虫をトレイにアリクォートすることは、良質の生産のために不可欠です。給餌体制は、特定の数の幼虫に合わせて正確に調整されています。幼虫が少なすぎると、過剰/下の餌となり、幼虫の生存、子犬の大きさ、子犬の時間に影響を与えます。大量飼育の技術に秘訣がある場合、この論文に記載されているように、生産サイクルの多くの小さなステップが一貫して、正確かつ高いレベルの品質管理で行われるようにすることです。
Disclosures
オキシテック社に所属する著者は、オキシテック株式会社の雇用および/または株式権益を有し、オックスフォード大学はこの論文のトピックに関連する知的財産を保有しています。
Acknowledgments
ビオファブリカ・モスカッド・ブラジル、フンダサン・デ・アンパロ・ア・ペスキサ・ド・エスタド・デ・サンパウロ(FAPESP)、コンセロ・ナシオナル・デセンボルヴィメント・シエンティフィコ・エ・テクノロジア(CNPq)の財政支援に感謝します。 また、以下の方々のご支援に感謝申し上げます。ミリアム・ドス・サントス、ギルデアン・シルバ、ゲッシラン・ドス・サントス、ファビオ・ゴンサルベス、ジョン・ポール・オリベイラ、ルイザ・ガルジエラ、ホセ・カルロス・バレンサ。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vipan Premium |
Sera GmbH | 190 |
http://www.sera.de/uk/pages/products/product/sera-vipan-3.html |
| Tetracycline |
Sigma Aldrich | T7660 |
|
| Plate separator |
J.W. Hock | 5412 |
http://www.johnwhock.com/download/manuals/instr_5412_separator.pdf |
| Parafilm M |
Pechiney Plastic packing | PM-996 |
|
| Rearing pans for Release generation (53 cm x 38 cm x 8 cm) |
Pleion | 0757 |
|
| Fluorescent scope |
Leica Microsystems | MZ FLIII |
http://www.leica-microsystems.com/fileadmin/downloads/Leica%20MZ%20FLIII/Brochures/M1-160-0de.pdf |
| Adult cages |
BugDorm | DP1000 |
http://bugdorm.megaview.com.tw/bugdorm-1-insect-rearing-cage-30x30x30-cm-pack-of-one-p-29.html |
| Filter paper |
CELAB |
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