Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Massaproductie van genetisch gemodificeerde Aedes aegypti voor veldreleases in Brazilië

Published: January 4, 2014 doi: 10.3791/3579
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 3, 3, 4, 1,5, 2,6
1Oxitec Ltd, 2Departamento de Parasitologia, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, 3Departamento de Epidemiologia, Universidade de São Paulo, 4Moscamed Brasil, 5Deptartment of Zoology, University of Oxford, 6Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Entomologia Molecular (INCT-EM)

Summary

Om populatieonderdrukking van Aedes aegypti te bereiken met behulp van het RIDL® (Release of Insects carrying a Dominant Lethal) systeem, moeten grote aantallen mannelijke muggen worden vrijgelaten. Dit vereist het gebruik van massaopfoktechnieken en -technologie om betrouwbare systemen te bieden om het maximale aantal mannelijke muggen van hoge kwaliteit te verkrijgen.

Abstract

Er wordt gezocht naar nieuwe technieken en methoden om de strijd tegen muggen te winnen. Recente vooruitgang in moleculaire technieken heeft geleid tot de ontwikkeling van nieuwe en innovatieve methoden voor muggenbestrijding op basis van de Steriele Insectentechniek (SIT)1-3. Een controlemethode die bekend staat als RIDL (Release of Insects carrying a Dominant Lethal)4, is gebaseerd op SIT, maar maakt gebruik van genetische methoden om de noodzaak van stralingssterilisatie5-8te verwijderen. Een RIDL stam van Ae. aegypti werd met succes getest in het veld in Grand Cayman9,10; verder veldgebruik is gepland of in uitvoering in andere landen over de hele wereld.

Massale opfok van insecten is vastgesteld in verschillende insectensoorten en tot een niveau van miljarden per week. Bij muggen is de opfok echter over het algemeen op een veel kleinere schaal uitgevoerd, waarbij de meeste grootschalige opfok werd uitgevoerd in de jaren 1970 en 80. Voor een RIDL-programma is het wenselijk om zo weinig mogelijk vrouwtjes vrij te laten als ze bijten en ziekte overbrengen. In een massaopfokprogramma zijn er verschillende stadia om de vrij te geven mannetjes te produceren: eierproductie, eieren fokken tot verpopping en vervolgens mannetjes sorteren van vrouwtjes voordat ze worden vrijgelaten. Deze mannetjes worden vervolgens gebruikt voor een RIDL-controleprogramma, vrijgegeven als poppen of volwassenen11,12.

Om een muggenpopulatie te onderdrukken met RIDL moet een groot aantal mannelijke volwassenen van hoge kwaliteit worden grootgebracht13,14. Het volgende beschrijft de methoden voor de massaopfok van OX513A, een RIDL-stam van Ae. aegypti 8, voor het vrijgeven en omvat de technieken die nodig zijn voor de productie van eieren en het massaopfokken van RIDL-mannetjes voor een controleprogramma.

Introduction

Muggen brengen veel ziekteverwekkers over die een reeks ziekten bij mensen kunnen veroorzaken en het beheersen van deze muggen is al eeuwenlang een voortdurende strijd. Strategieën om insecten te bestrijden op basis van chemische en biologische methoden hebben enkele opmerkelijke successen geboekt, maar in veel gevallen is de bestrijding op de lange termijn niet duurzaam geweest. Brazilië bereikte bijvoorbeeld de uitroeiing van Ae. aegypti in de jaren 50, maar de mug is de afgelopen 40-50 jaar opnieuw ingegroeid. Dit kan worden toegeschreven aan vele oorzaken, waaronder insecticideresistentie, milieuschade, slechte implementatie van het controleprogramma15-20en de snelle herinvasie zonder adequate monitoring of respons.

Er wordt gezocht naar nieuwe technieken en methoden om deze strijd tegen muggen te winnen.  Recente vooruitgang in moleculaire technieken heeft geleid tot de ontwikkeling van nieuwe en innovatieve methoden voor muggenbestrijding op basis van de Steriele Insectentechniek (SIT)1-3. Een controlemethode die bekend staat als RIDL (Release of Insects carrying a Dominant Lethal)4 is gebaseerd op SIT, maar maakt gebruik van genetische methoden om de noodzaak van stralingssterilisatie te verwijderen. RIDL-stammen zijn gebouwd voor verschillende plaagsoorten, waaronder Ae. aegypti 5-8, Een RIDL-stam van Ae. aegypti werd met succes getest in het veld in Grand Cayman9,10; verder veldgebruik is gepland of in uitvoering in andere landen over de hele wereld.  Het onderdrukken van muggenpopulaties met RIDL vereist een groot aantal mannelijke volwassenen van hoge kwaliteit om3,14te worden grootgebracht.

Voor een SIT-programma wordt het wenselijk geacht om alleen mannen vrij te laten; vrouwelijke muggen bijten en brengen ziekte over. Bovendien kunnen de vrijgegeven steriele mannetjes worden 'afgeleid' door de vrijgegeven vrouwtjes die de effectiviteit van het programma verminderen. De mannelijke versie werd getoond om 3-5 keer effectiever te zijn dan gemengde-geslachtsversie in grote gebiedsexperimenten met bestraalde Mediterrane fruitvliegen21.

In een RIDL-massaopfokprogramma zijn er verschillende stadia om de mannetjes te produceren voor vrijlating.  De eerste is de productie van de eieren die nodig zijn voor de afgiftegeneratie (figuur 1). De volgende fase is om de eieren door te brengen tot poppen of volwassenen, waarbij larven van poppen en de mannelijke poppen van de vrouwelijke poppen worden gescheiden. Grootschalige scheiding van mannetjes van vrouwtjes vereist een verschil tussen de geslachten in een bepaalde levensfase die geschikt is voor massasortering22. In Ae. aegypti (en andere muggensoorten) is er een aanzienlijk grootteverschil tussen de mannelijke en vrouwelijke poppen die kunnen worden uitgebuit voor geslachtsscheidingstechnieken. De gesorteerde RIDL mannetjes worden vervolgens vrijgegeven in een controleprogramma als poppen of als volwassenen11,12.

Hieronder worden de methoden beschreven voor de massaopfok van OX513A, een RIDL-stam van Ae. Aegypti, voor vrijlating. De beschreven methoden hebben betrekking op de technieken die nodig zijn voor de productie van eieren en RIDL-mannetjes voor een controleprogramma.

Protocol

Insectenvereisten

1. Overzicht

  1. Massaopfok kent verschillende fasen, die elk worden uitgevoerd in een afzonderlijk gebied van de massaopfokeenheid. Figuur 1 toont de hoofdfase van de opfok en waar deze zich voordoen in de massaopfokfaciliteit.

2. Bioveiligheidsoverwegingen voor de insectaire

  1. Het project werd goedgekeurd door de commissie dierenethiek van de Universiteit van São Paulo - Brazilië en alle benodigde vergunningen en goedkeuringen werden verkregen.
  2. Het RIDL-systeem maakt gebruik van voorwaardelijke letaliteit; een voedingssupplement (tetracycline) voorkomt de expressie van het RIDL-systeem waardoor de insecten massaal kunnen worden grootgebracht; zonder tetracycline sterven de muggen. Tetracycline wordt niet gevonden in de broedplaatsen van Ae. aegypti in het wild, dus eventuele nakomelingen geproduceerd uit ontsnapten zullen het niet overleven.  Dit voegt een extra beveiligingsniveau toe ten opzichte van het gebruik van wilde (WT) insecten die op andere manieren zijn gesteriliseerd(d.w.z. straling).
  3. Gebruik dubbele deurinvoer, "Alleen geautoriseerd personeel" -borden en insectenschermen in de insectenstal. Alle ramen moeten worden verzegeld om besmetting van de kolonie met WT-insecten te voorkomen en ontsnappingen vanuit de insecten te voorkomen.
  4. Lokale regelgeving en autoriteiten kunnen specifieke aanvullende of alternatieve vereisten hebben. Neem in een vroeg stadium contact op met de relevante autoriteiten voor informatie/begeleiding en beveilig alle benodigde vergunningen en goedkeuringen voordat u de RIDL-stam in een insectenstal vaststelt.
  5. De massaopfok-insecten mogen alleen worden gebruikt voor ridl-opfok. Er mogen geen andere stammen of insecten aanwezig zijn. Dit is om besmetting van de RIDL-stam en besmetting met pathogenen te voorkomen die de fitheid en overleving kunnen beïnvloeden, waardoor de productiviteit en effectiviteit van vrijgelaten mannen wordt verminderd.

3. Insectair ontwerp

  1. Figuur 2 toont een plan van de insecten die gebruikt worden bij Biofábrica Moscamed in Brazilië.
  2. Temperatuur van alle kamers was 26 °C ± 2) met een relatieve vochtigheid van ongeveer 70-80% en een 12:12 uur licht: donker cyclus met behulp van fluorescerende lichtstrips.
  3. Deze blauwdruk kan worden aangepast aan specifieke ruimtevereisten, bijvoorbeeld de schaal van de release bepaalt de totale grootte. De eierproductie, opfok en sortering, kwaliteitscontrole (QC) en releases moeten echter worden gescheiden in vier verschillende gebieden: Egg Production Colony, Release Generation, QC en Adult Storage for Release.
  4. De egg production colony room (ongeveer 20m2)wordt gebruikt om eieren te produceren voor de releasegeneratie.
  5. In het gebied kwaliteitscontrole worden experimenten uitgevoerd om de procedures en de geschiktheid van de RIDL-lijn te controleren, waaronder metingen van de broedsnelheid, poppenaantallen, poppengrootte en het meten van de effectiviteit van het sorteren en verwijderen van vrouwtjes. Er worden ook tests uitgevoerd op WT-verontreiniging door te controleren op de aanwezigheid van fluorescentiemarker en fenotype met behulp van offsettests die de letaliteit meten.
  6. De Release Generation ruimte (ongeveer 36 m2) vereist voldoende ruimte voor trays en het sorteren van larven en poppen. De trays worden bewaard in speciaal gebouwde aluminium rekken. Een groot werkgebied en gootsteen zijn nodig voor het opfokken en sorteren en een andere grote gootsteen is vereist voor het wassen van trays en kooien. In de afvalwaterafvoer van de gootstenen is een filtervangvanger opgenomen om de ontsnapping van levende muggen door het riool te beperken.
  7. Al het water dat voor de trays wordt gebruikt, wordt afgevoerd via een afvoer, die een compartiment heeft met een gaas dat de ontsnapping van insecten in elk stadium van ontwikkeling voorkomt.
  8. Er is een ruimte vereist voor de opslag van volwassenen voor vrijgave (Adult Storage for Release, figuur 2) met rekken om de ontgrendelingsapparaten vast te houden terwijl de volwassenen volwassen zijn voordat ze worden losgelaten.

Productiemethoden voor massaopfok RIDL:

De eierproductiekolonie produceert de eieren die worden gebruikt in de releasegeneratie (figuur 1) om volwassenen te produceren. Er zijn veel overeenkomsten in de twee opfokmethoden, maar ook enkele duidelijke verschillen. De opfokprocessen die voor beide procedures hetzelfde zijn, worden alleen beschreven in de sectie Eiproductiekolonie.

De Kolonie van de Productie van het ei

4. Larvale productie

De Egg Production Colony genereert homozygote OX513A RIDL eieren8 voor de Release Generation. Een hoge kwaliteitscontrole garandeert de levensvatbaarheid, geschiktheid en stamintegriteit van de geleverde eieren.

  1. De stimulans voor het uitkomen is onderdompeling in water met een laag niveau van opgeloste zuurstof. Om het zuurstofgehalte in het water te verlagen, verwarmt u het water totdat het kookt en plaatst u onmiddellijk 400 ml in glazen potten van 500 ml (74 mm openingsomtrek), bevestigt u het deksel stevig en laat u het enkele uren op kamertemperatuur afkoelen.
  2. Doe 1 g eieren in een pot gekookt water, reseal en wacht een uur. Breng de inhoud over in een bak met 2 L water en laat 's nachts onder insectenomstandigheden staan.
  3. Plaats de uitgebroede larven in een bekend volume water en roer met behulp van een magneetroerder en vlo gedurende voldoende tijd om aliquots te nemen; krachtig roeren of voor langere tijd beschadigt larven en moet tot een minimum worden beperkt. Het standaardvolume dat wordt gebruikt om larven uit te broeden is 1 L, maar dichtheden van meer dan 300 larven / ml zijn moeilijk te tellen en kunnen schadelijk zijn. Kom daarom niet meer dan ongeveer 300.000 eieren/L water uit.
  4. Bepaal de uitkomstsnelheid door drie aliquots van 1 ml te nemen en op een vel absorberend papier, met een rooster van 1 cm vierkanten, bovenop een absorberende spons te plaatsen om overtollig water op te nemen.  Tel het aantal uitgebroede en niet-uitgebroede eieren van drie vierkanten door te zoeken naar de ontbrekende dop van een uitgebroed ei. Een hatch rate rond de 80-90% wordt verwacht.
  5. Neem vier aliquots van elk 1 ml en plaats in vier zwarte weegboten (larven zijn wit en daarom beter zichtbaar tegen een zwarte achtergrond) en tel het aantal levende larven dat met het oog aanwezig is; het gebruik van een teller wordt aanbevolen. Het gemiddelde aantal larven per ml wordt vervolgens gebruikt om het volume water te berekenen dat aan elke tray moet worden toegevoegd om het gewenste aantal larven per tray te krijgen.
  6. Er kunnen grote verschillen zijn in de dichtheid waarmee larven kunnen worden grootgebracht tussen stammen en soorten. Het is ook wenselijk om ridl volwassen mannelijke grootte te vergelijken met wilde type mannetjes; idealiter wilt u vergelijkbaar zijn met grotere RIDL-mannetjes die met succes kunnen concurreren met wilde mannetjes. Daarom moet voor elke RIDL-stam de ideale dichtheid van larven worden bepaald en is het een afweging tegen ruimtebeperkingen voor de opfok en de schaal van de productie. Dichtheden variërend van 0,1-2,5 larve/ml hebben we gevonden als een goede combinatie van productie-output en kwaliteit; ook besproken door Medici23.
  7. Voeg de larven toe aan trays. In onze faciliteit gebruiken we trays van ongeveer 53 cm x 37 cm x 8 cm (L x B x H) en de vereiste hoeveelheid water om de dichtheid van larven voor productie te bereiken.
  8. Voeg een stamoplossing tetracycline (3 mg/ml water) toe aan de trays in een verdunning van 1:100 om de vereiste eindconcentratie van 30 μg/ml te verkrijgen.
  9. Voer larven dagelijks met vlokvisvoer(www.sera.de),dat tot een fijn poeder is vermalen. Tabel 1 toont het typische voedingsregime in mg voedsel per larve per dag. Voer larven tot de juiste sorteerdag onder de hierboven beschreven insectenomstandigheden.

5. Larven sorteren van poppen en mannelijke/vrouwelijke poppen

  1. Sorteer larven van poppen 8 dagen na het uitkomen door de larven van de poppen te scheiden. Dan sex-sort de poppen voor mannen. Een apparaat dat bekend staat als een plaatscheider24,25 kan larven sorteren van mannelijke poppen en van vrouwelijke poppen. Figuur 3 illustreert het gebruik van deze plaatscheider om larven van mannelijke en vrouwelijke poppen te scheiden.
  2. Gebruik een maatlepel met een gaas aan de onderkant, kalibreer deze met 500 poppen of meer en gebruik deze om kooien op te zetten en de totale hoeveelheid geproduceerde mannetjes en vrouwtjespoppen te schatten.
  3. Op de eerste dag van sortering (dag 8) zijn de meeste poppen mannetjes, dus plaats de gesorteerde larven terug in een bakje en ga naar achteren tot de volgende dag wanneer de meeste poppen vrouwtjes zijn (figuur 4).
  4. Herhaal het sorteerproces elke dag zoals beschreven in stap 2.1-2.3 totdat alle larven zijn verpopt of tot het einde van een werkweek.
  5. Plaats 1.000 mannelijke poppen (met behulp van de maatlepel) in een kooi en voeg op dag 9 3.000 vrouwelijke poppen toe aan dezelfde kooi (we gebruiken PVC-buizen met een diameter van 30 cm en een diameter van 30 cm aangepast met gaasblad en een nettoegangsgat, maar 30 cm x 30 cm x 30 cm plastic kooien zijn ook verkrijgbaar bij BugDorm).
  6. Laat volwassenen minstens 2 dagen paren en voorzie hen van sacharoseoplossing (10%) op nat katoen ad libitum voor bloedvoeding. Verzamel eieren gedurende twee weken (~ twee gonotrofe cycli) met twee bloedvoeders per week. Dit levert gemiddeld 143.000 eieren op uit een kooi van 3.000 vrouwtjes (gemiddeld 48 eieren/vrouwtjes). Voor de productie van 4 miljoen eieren per week moeten er elke week ongeveer 28 kooien worden opgezet.

6. Bloedvoeding

  1. Een aluminium plaatvoersysteem voorziet kooien twee keer per week van bloed. Een zak bloed wordt gemaakt aan de zijkant van een aluminium plaat (10 cm x 10 cm x 3 mm) met Parafilm (Figuur 5). Om het voeren aan te moedigen, wordt het bloed opgewarmd door een verwarmde zitzak bovenop de plaatvoeder te plaatsen. De zitzak bestond uit ongeveer 250 g tarwekorrels in een stoffen zak, die ongeveer 10 seconden in een magnetron wordt verwarmd. Het bloed dat we gebruiken voor het voeren is afkomstig van een lokaal slachthuis; aangezien deze dieren (voornamelijk geiten en schapen) voor menselijke consumptie zijn, worden ze getest om de aanwezigheid van ziekteverwekkers te voorkomen.
  2. Drie dagen na bloedtoevoer wordt een ovipositieplaats voor de vrouwtjes om hun eieren te leggen verstrekt. De ovipositieplaats is een ronde plastic container gevuld tot ongeveer 1/4 met water en filterpapier dat de binnenkant bedekt. Twee dagen later wordt de ovipositieplaats verwijderd. Voor een maximale eierproductie moet u ervoor zorgen dat het filterpapier het volledige beschikbare oppervlak in de container bedekt en nat blijft.
  3. Verwijder het eierpapier en plaats het op absorberend papier om te drogen onder insectenomstandigheden; eieren vereisen een periode van conditionering bij hoge luchtvochtigheid (meer dan 70%) van ten minste 48 uur na het leggen. Eieren kunnen tot 3 maanden in de insectenstal worden achtergelaten met een minimale afname van de broedsnelheid, zolang de luchtvochtigheid hoog wordt gehouden25.
  4. De eierproductiekolonie moet voldoende groot zijn om wekelijks het aantal eieren te leveren dat nodig is voor het releaseprogramma. De hierboven beschreven faciliteit kan ongeveer 4 miljoen eieren produceren met 28 kooien die wekelijks worden opgezet. Het wordt aanbevolen om voldoende eieren opgeslagen te houden om ten minste 4 weken eieren te garanderen voor Release Generation en Egg Production Colony.

Release generatie

7. Larvale productie

De broed-, opfok- en sorteerprocessen voor de afgiftegeneratie zijn identiek aan de eerder beschreven methode voor de eierproductiekolonie. De schaal van de productie is echter veel groter en dit vereist meer trays en meer inspanning.

8. Larven sorteren, mannelijke poppen en vrouwelijke poppen

  1. Het sorteren van larven, mannelijke poppen en vrouwelijke poppen is identiek aan de methode die wordt beschreven voor eiproductie.
  2. Na het sorteren van de mannelijke poppen is het belangrijk om te controleren op vrouwelijke besmetting voordat ze worden vrijgelaten; er mag niet meer dan 1% vrouwen aanwezig zijn. Neem drie aliquots van 500 poppen (drie willekeurige poppen maatlepels) en tel het aantal aanwezige vrouwelijke poppen. Vrouwtjes kunnen worden geïdentificeerd omdat zij over het algemeen groter zijn dan mannen en aan verschillen in de vorm van de geslachtskwab (figuur 6)27. Als er meer dan 1% vrouwen zijn, moeten ze hun toevlucht nemen en opnieuw worden gecontroleerd.
  3. Gebruik alleen de mannetjes vanaf dag 8 en 9 voor vrijlating; autoclaaf alle resterende larven en poppen. In Brazilië moet dit afval op dezelfde manier worden behandeld als medisch afval, maar de regelgeving kan in andere landen verschillen. Gebruik geen vrouwelijke poppen en larven van de Release Generation voor de Eiproductiekolonie vanwege verschillen in kwaliteitscontrole, opfok- en besmettingsrisico's van grotere aantallen en lagere kwaliteitscontrole.

Opslag voor volwassenen voor release: Plaats mannetjes in ontgrendelingsapparaten om te verschijnen en volwassen te worden voordat ze worden vrijgegeven. De details van de ontgrendelingsapparaten worden niet behandeld in deze methode. De capaciteit van de release-apparaten die we gebruiken is echter ongeveer 1.000 mannen. De details van de releasemethode (releaseapparaat en releasesysteem) worden niet in deze methode behandeld.

Representative Results

De verwachte verpoppingsresultaten voor de productie zijn weergegeven in figuur 4. De mannetjes verpoppen eerst, pieken op dag 8 en de vrouwtjes pieken op dag 9 na het uitkomen. Het is belangrijk om deze verpoppingscurve te meten om de beste tijd te kennen om mannetjes van vrouwtjes te sorteren.

Uit de resultaten van meer dan 6 maanden sorteren van mannelijke en vrouwelijke poppen blijkt dat de besmetting van vrouwen gemiddeld 0,02% bedraagt (figuur 5; SEM = 0,004%). Dit besmettingspercentage vertegenwoordigt slechts 400 vrouwtjes die in een maand na de vrijlating zijn vrijgelaten (ongeveer twee miljoen mannetjes). De huidige eierproductie per week is 4 miljoen. Hiervan worden er 3,5 miljoen uitgebroed voor eierkolonie en productie, terwijl de rest wordt opgeslagen voor back-up. Ongeveer 11% van de eieren wordt gebruikt voor de productiekolonie van eieren en de rest voor de afgiftegeneratie. Eierluiksnelheid gemiddeld 87,3% (SEM = 0,5%) en de opbrengst van mannelijke poppen uit L1-larven bedraagt gemiddeld 29,5% (SEM = 1,2). Twee miljoen larven worden elke week grootgebracht voor de Release Generation kolonie die ongeveer 571.000 mannelijke poppen produceert (SEM = 14.000). Poppen en volwassen sterfte tijdens opkomst en afgifte zijn gemiddeld 5%, wat resulteert in ongeveer 543.000 (SEM = 13.000) vrijgelaten volwassen mannelijke muggen per week. Er wordt verwacht dat de huidige productie van 4 miljoen eieren per week kan worden teruggebracht tot ~ 3 miljoen / week met verdere optimalisatie om verlies door verspilling en opslag te verminderen. In totaal zijn er 6 medewerkers nodig voor de beschreven productie; vier werken aan de vrijlatingsgeneratie en de resterende twee aan de eierkolonie.

Kwaliteitscontrole

Kwaliteitscontrole is essentieel om de kwaliteit van de volwassenen, efficiëntie van de opvoeding, arbeid en kosten te behouden.

Transgene fenotype controle

Om de RIDL-genexpressie te verifiëren, worden twee controles uitgevoerd, ten eerste om de expressie van fluorescentiemarker te controleren en ten tweede om de expressie van RIDL-letaliteitseigenschap te controleren bij afwezigheid van tetracycline. Alle larven moeten de fluorescerende marker uitdrukken. Om te controleren of de fluorescerende marker wordt uitgedrukt zoals verwacht, worden 2.000 eerste instar-larven gecontroleerd onder een Leica MZFLIII-stereomicroscoop met DsRed2-filter (Texas Red) om te bepalen of er niet-fluorescerende individuen aanwezig zijn. Zonder tetracycline wordt het RIDL-gen uitgedrukt en verwachten we 3-4% overleving bij volwassenen8. Om dit te controleren, wordt voor elke releasebatch zonder tetracycline een extra lade ingesteld. Het enige verschil met normale opfok is dat het voedsel vanaf dag 6 met 2/3 wordt verminderd omdat ophoping van overtollig voedsel als gevolg van dode larven kan leiden tot overmatige bacteriegroei.

Opfokcontrole

Vier trays van de releasegeneratie worden willekeurig gekozen om afzonderlijk te worden gesorteerd en geteld. Het aantal mannelijke en vrouwelijke poppen wordt elke dag uit elke lade geregistreerd (figuur 4). Elke afwijking van het verwachte aantal mannetjes en vrouwtjes duidt op een potentieel probleem dat de productie en/ of fitheid kan beïnvloeden en kan worden vergeleken met de eikolonie om de bron van problemen te helpen bepalen.

Poppen metingen

De grootte van de poppen is gecorreleerd met volwassen maat28. Als kwaliteitscontrole voor volwassen grootte wordt de cephalothoraxbreedte gemeten van ten minste 30 mannelijke poppen voor elke sorteerdag van de Release Generation; voor de Eiproductiekolonie worden ook vrouwelijke poppen gemeten. De gemiddelde breedte van cephalothorax was 1,05 mm (SEM 0,005) voor vrijgelaten mannetjes en 1,04 mm (SEM = 0,006) en 1,29 mm (SEM = 0,006) voor respectievelijk mannetjes en vrouwtjes Egg Production, Colony; soortgelijke resultaten werden verkregen voor Ae. albopictus massaopfok24.

Figure 1
Figuur 1. Stadia van massale opfokmuggen voor gebruik in een RIDL / SIT-programma. De eierproductiekolonie heeft een hoog niveau van kwaliteitscontrole om de kwaliteit van de eieren die aan de releasegeneratie worden geleverd, te garanderen.  Eieren worden doorgebracht tot poppen in de loskolonie, waar de mannetjes worden gesorteerd van de vrouwtjes.  De mannelijke volwassenen worden vervolgens gebruikt voor het RIDL-controleprogramma.

Figure 2
Figuur 2. Schematisch van de opfokfaciliteit voor de productie van RIDL-mannetjes voor een releaseprogramma. Eieren van hoge kwaliteit worden voortdurend geproduceerd in de Egg Production Colony-kamer en worden vervolgens tot poppen grootgebracht in de Release Generation-kamer. De larven en poppen worden vervolgens gescheiden en de poppen geslachtsgesorteerd voor mannetjes. De mannetjes worden vervolgens in ontgrendelingsapparaten geplaatst en mogen volwassen worden tot volwassenen voor vrijlating in de opslag- en ontgrendelingsruimte voor volwassenen. 

Figure 3
Figuur 3. Larven, mannelijke poppen en vrouwelijke poppen scheiden met behulp van een plaatscheider26.  De plaatscheider gebruikt het grootteverschil tussen larven, mannelijke poppen en vrouwelijke poppen om deze drie verschillende levensfasen te sorteren; larven zijn meestal kleiner dan mannelijke poppen die op hun beurt kleiner zijn dan vrouwelijke poppen.  Het instrument bestaat uit twee glazen platen; de ene is bevestigd aan een schuin metalen frame en de andere zit bovenop de eerste plaat en kan ten opzichte van de eerste worden verplaatst met behulp van vier stelschroeven (A).  Met de vier stelschroeven kan de buitenplaat schuin ten opzichte van de achterplaat worden geplaatst, zodat er een wigvormige ruimte tussen de platen ontstaat, die naar beneden taps toelopend is.  Larven en poppen worden tussen de glasplaten (B) gegoten en voorzichtig gewassen met een waterslang (C).  Door de hoek van de plaat aan te passen, kunnen larven, mannelijke poppen en vrouwelijke poppen worden gescheiden (D).  Met continu spoelen en het vergroten van de plaathoek kunnen de larven eerst worden doorgespoeld (in een zeef), gevolgd door de mannelijke poppen en ten slotte de vrouwelijke poppen. 

Figure 4
Figuur 4. Verpoppingscurven voor massaopfok RIDL Ae. aegypti.  Deze grafiek toont het gemiddelde percentage verpopping voor massaopfokte RIDL mannelijke en vrouwelijke poppen gedurende 23 weken observatie met ~135.000 poppen hersteld per week.  Foutbalken = standaardfout van gemiddelde, n = 23. Bij de eerste collectie (dag 8) hebben we gemiddeld 59% mannelijke en 30% vrouwelijke poppen teruggevonden uit totale poppen die gedurende 5 dagen uit trays zijn teruggevonden. 

Figure 5
Figuur 5. Gemiddelde vrouwelijke besmetting van gesorteerde mannelijke poppen. Deze grafiek toont het maandelijkse gemiddelde percentage vrouwelijke besmetting tijdens het sorteren van mannen op dag 8 na het uitkomen over een periode van zes maanden. 

Figure 6
Figuur 6. Aluminium plaat bloedtoevoersysteem. De plaat (B) is bedekt met Parafilm (A) en bloed in een zak gepijpt en vervolgens verzegeld (D). De plaat wordt op een kooi geplaatst en verwarmd door er een opgewarmde zitzak (C) bovenop (E) te plaatsen. 

Figure 7
Figuur 7. Onderscheidende mannelijke en vrouwelijke Ae. aegypti poppen. Ae. aegypti poppen kunnen betrouwbaar worden geslacht door de verschillen in de vorm van de genitale kwab (aan het einde van de pop abdominale segmenten net onder de peddels). Bovendien zijn mannetjes ook kleiner dan vrouwtjes.   

Table 1
Tabel 1. Algemeen voedingsregime voor Ae. aegypti RIDL larven (mg voedsel per larve per dag). Om de werkelijke hoeveelheid voedsel te berekenen die nodig is, vermenigvuldigt u zich met het totale aantal larven per tray.

Discussion

RIDL is een effectieve en milieuveilige methode om muggen te bestrijden3,29-31. De techniek is toepasbaar op een geïntegreerd ongediertebestrijdingsprogramma en de meeste huidige bestrijdingsmethoden, waaronder larvicides, veredelingsplaatsreductie en adulticiden zijn compatibel met deze technologie. Deze methode beschrijft hoe u tot 570.000 RIDL mannelijke poppen per week kunt produceren voor gebruik in de controle van Ae. Aegypti en voor zover wij weten is dit de eerste beschrijving van de productie van transgene muggen op deze schaal. In de jaren 60 en 70 van de25ejaren werden enkele vergelijkbare productiesystemen ontwikkeld voor wilde Ae. aegypti , maar sindsdien is er geen vergelijkbare productie op deze schaal geweest. In Brazilië zijn ongeveer 11 miljoen mannen vrijgelaten van februari 2011 tot februari 2012. Het aantal mannetjes dat nodig is om een bepaald gebied te controleren, is afhankelijk van een aantal factoren, waaronder de grootte van de wilde populatie, de verspreiding van vrijgelaten mannetjes, overlevings- en paringsconcurrentievermogen van mannetjes na vrijlating en omgevingsomstandigheden.  Eerdere studies hebben aangetoond dat RIDL een populatie muggen met ten minste 80% kan verminderen9.

Er is een balans nodig tussen het optimaliseren van de massaopfok voor de schaal van de productie en de kosten versus de kwaliteit van mannen. Het verhogen van de larvale dichtheid kan bijvoorbeeld de productiecapaciteit verhogen door de benodigde ruimte, arbeid en tijd tot verpopping te verminderen32. Te hoge dichtheden van larven kunnen echter resulteren in kleinere en korter geleefde mannetjes met een verminderde paringscapaciteit32,33. De kwaliteit van mannetjes in relatie tot een SIT-programma zal uiteindelijk worden beoordeeld door het vermogen van vrijgelaten mannetjes om te paren met vrouwtjes in het veld. Uitgebreide veldevaluatie is vereist om het paringsconcurrentievermogen ten opzichte van wilde tegenhangers te beoordelen9,10. Dit maakt het vaak onpraktisch om precies te evalueren welke factoren een 'hoogwaardige' mannelijke mug maken. Het handhaven van consistente productie en kwaliteit (voor zover dat routinematig kan worden geëvalueerd) in grootschalige massaopfok is echter van het grootste belang. Dit vereist een hoge mate van waakzaamheid en standaardisatie van alle processen met kleine fluctuaties die mogelijk een aanzienlijke impact hebben. Het aliquoteren van L1-larven is een kritieke stap en illustreert dit punt. Het juiste aantal larven in trays laten vallen is essentieel voor een goede productie. Het voedingsregime is precies afgestemd op het specifieke aantal larven. Te weinig/veel larven zullen resulteren in over/ondervoeding, wat de overleving van larven, de grootte van poppen en de tijd tot verpopping beïnvloedt. Als er een geheim is in de kunst van het massaopfokken, is het om ervoor te zorgen dat de vele kleine stappen in de productiecyclus consistent, nauwkeurig en met een hoog niveau van kwaliteitscontrole worden uitgevoerd, zoals beschreven in dit document.

Disclosures

Auteurs die zijn aangesloten bij Oxitec hebben een belang in werk en/of eigen vermogen in Oxitec Ltd. Oxitec Ltd en Oxford University bezitten intellectueel eigendom met betrekking tot het onderwerp van dit artikel.

Acknowledgments

We willen Biofábrica Moscamed Brasil, Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) en Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnologia (CNPq) bedanken voor hun financiële steun.  We willen ook de volgende mensen bedanken voor hun hulp; Miriam dos Santos, Gildeane Silva, Gessilane dos Santos, Fabio Gonçalves, John Paul Oliveira, Luiza Garziera, José Carlos Valença.

Materials

Name Company Catalog Number Comments

Vipan Premium

 Sera GmbH

190

http://www.sera.de/uk/pages/products/product/sera-vipan-3.html

Tetracycline

 Sigma Aldrich

T7660

http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?D7=0&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&N4=T7660|SIGMA&N25=0&QS=ON&F=SPEC

Plate separator

 J.W. Hock

5412

http://www.johnwhock.com/download/manuals/instr_5412_separator.pdf

Parafilm M

 Pechiney Plastic packing

PM-996

www.parafilm.com

Rearing pans for Release generation (53 cm x 38 cm x 8 cm)

 Pleion

0757

http://pleion.actcenter.com.br/produtos.asp?opcao=1

Fluorescent scope

 Leica Microsystems

MZ FLIII

http://www.leica-microsystems.com/fileadmin/downloads/Leica%20MZ%20FLIII/Brochures/M1-160-0de.pdf

Adult cages

 BugDorm

DP1000

http://bugdorm.megaview.com.tw/bugdorm-1-insect-rearing-cage-30x30x30-cm-pack-of-one-p-29.html

Filter paper

 CELAB

http://www.casadolaboratorio.com.br/subpage118.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dyck, V., et al. Sterilizing Insects with Ionizing Radiation. Sterile Insect Technique. , Springer. Netherlands. 233-268 (2005).
  2. Dyck, V., Hendrichs, J., Robinson, A. S., Klassen, W., Curtis, C. History of the Sterile Insect Technique.. Sterile Insect Technique. , Springer. Netherlands. 3-36 (2005).
  3. Alphey, L., et al. Sterile-insect methods for control of mosquito-borne diseases – an analysis. Vector Borne Zoonotic Dis. 10, 295-311 (2010).
  4. Thomas, D. D., Donnelly, C. A., Wood, R. J., Alphey, L. S. Insect population control using a dominant, repressible, lethal genetic system. Science. 287, 2474-2476 (2000).
  5. Fu, G., et al. Female-specific insect lethality engineered using alternative splicing. Nat. Biotechnol. 25, 353-357 (2007).
  6. Fu, G., et al. Female-specific flightless phenotype for mosquito control. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4550-4554 (2010).
  7. Gong, P., et al. A dominant lethal genetic system for autocidal control of the Mediterranean fruitfly. Nat. Biotechnol. 23, 453-456 (2005).
  8. Phuc, H. K., et al. Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control. BMC Biol. 5 (11), (2007).
  9. Harris, A. F., et al. Successful suppression of a field mosquito population by sustained release of engineered male mosquitoes. Nat. Biotechnol. 30, 828-830 (2012).
  10. Harris, A. F., et al. Field performance of engineered male mosquitoes. Nat. Biotechnol. 29, 1034-1037 (2011).
  11. Bailey, D. L., Lowe, R. E., Dame, D. A., Seawright, J. A. Mass rearing the genetically altered MACHO strain of Anopheles albimanus Wiedemann. Am. J. Trop. Med. Hyg. 29, 141-149 (1980).
  12. Benedict, M. Q., et al. Colonisation and mass rearing: learning from others. Malar. J.. 8 Suppl 2 (S4), (2009).
  13. Alphey, L. Re-engineering the sterile insect technique. Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1243-1247 (2002).
  14. Wise de Valdez,, R, M., et al. Genetic elimination of dengue vector mosquitoes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4772-4775 (2011).
  15. Macoris Mde,, L,, et al. Resistance of Aedes aegypti from the state of Sao Paulo, Brazil, to organophosphates insecticides. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 98, 703-708 (2003).
  16. Campos, J., Andrade, C. F. Larval susceptibility of Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus populations to chemical insecticides. Rev. Saude Publica. 37, 523-527 (2003).
  17. Gubler, D. J. Resurgent vector-borne diseases as a global health problem. Emerg. Infect. Dis. 4, 442-450 (1998).
  18. Harris, A. F., Rajatileka, S., Ranson, H. Pyrethroid resistance in Aedes aegypti from Grand Cayman. Am. J. Trop. Med. Hyg. 83, 277-284 (2010).
  19. Lima, J. B., et al. Resistance of Aedes aegypti to organophosphates in several municipalities in the State of Rio de Janeiro and Espirito Santo. Am. J. Trop. Med. Hyg. 68, Brazil. 329-333 (2003).
  20. Paris, M., et al. Persistence of Bacillus thuringiensis israelensis (Bti) in the environment induces resistance to multiple Bti toxins in mosquitoes. Pest Manag. Sci. 67, 122-128 (2010).
  21. Rendon, P., McInnis, D., Lance, D., Stewart, J. Medfly (Diptera: Tephritidae) genetic sexing: large-scale field comparison of males-only and bisexual sterile fly releases in Guatemala. J. Econ. Entomol. 97, 1547-1553 (2004).
  22. Papathanos, P. A., et al. Sex separation strategies: past experience and new approaches. Malar. J.. 8 Suppl 2 (S5), (2009).
  23. Medici, A., et al. Studies on Aedes albopictus larval mass-rearing optimization. J. Econ. Entomol. 104, 266-273 (2011).
  24. Focks, D. A. An improved separator for the developmental stages, sexes and species of mosquito (Diptera Culicidae). J. Med. Entomol. 17, 567-568 (1980).
  25. Fay, R. W., McCray, E. M., Kilpatrick, J. W. Mass production of sterilized male Aedes aegypti. Mosquito News. 23, 210-214 (1963).
  26. Christophers, S. R. Aedes aegypti the yellow fever mosquito: Its life history, Bionomics and Structure. , Cambridge University Press. (2009).
  27. Jones, J. C. A simple method for sexing living Anopheles Larvae (diptera, culicidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 50, 104-106 (1957).
  28. Koenraadt, C. J. M. Pupal Dimensions as Predictors of Adult Size in Fitness Studies of Aedes aegypti (Diptera Culicidae). J. Med. Entomol. 45, 331-336 (2008).
  29. Alphey, L., Nimmo, D., O'Connell, S., Alphey, N. Insect population suppression using engineered insects. Adv. Exp. Med. Biol. 627, 93-103 (2008).
  30. Alphey, N., Bonsall, M. B., Alphey, L. Modeling resistance to genetic control of insects. J. Theor. Biol. 270, 42-55 (2011).
  31. Atkinson, M. P., et al. Analyzing the control of mosquito-borne diseases by a dominant lethal genetic system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 9540-9545 (2007).
  32. Bargielowski, I., Nimmo, D., Alphey, L., Koella, J. C. Comparison of life history characteristics of the genetically modified OX513A line and a wild type strain of Aedes aegypti. PLoS One. 6 (e20699), (2011).
  33. Bargielowski, I., Alphey, L., Koella, J. C. Cost of mating and insemination capacity of a genetically modified mosquito Aedes aegypti OX513A compared to its wild type counterpart. PLoS One. 6 (26086), (2011).

Tags

Milieuwetenschappen Aedes aegypti massaopfok bevolkingsonderdrukking transgeen insect mug dengue
Massaproductie van genetisch gemodificeerde <em>Aedes aegypti</em> voor veldreleases in Brazilië
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Carvalho, D. O., Nimmo, D., Naish,… More

Carvalho, D. O., Nimmo, D., Naish, N., McKemey, A. R., Gray, P., Wilke, A. B. B., Marrelli, M. T., Virginio, J. F., Alphey, L., Capurro, M. L. Mass Production of Genetically Modified Aedes aegypti for Field Releases in Brazil. J. Vis. Exp. (83), e3579, doi:10.3791/3579 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter