Summary
För att uppnå populationsdämpning av Aedes aegypti med hjälp av RIDL® (Release of Insects carrying a Dominant Lethal) system måste ett stort antal manliga myggor släppas ut. Detta kräver användning av massuppfostringstekniker och teknik för att tillhandahålla tillförlitliga system för att få maximalt antal högkvalitativa manliga myggor.
Abstract
Nya tekniker och metoder söks för att försöka vinna kampen mot myggor. De senaste framstegen inom molekylära tekniker har lett till utvecklingen av nya och innovativa metoder för myggbekämpning baserade på steril insektsteknik (SIT)1-3. En kontrollmetod som kallas RIDL (Release of Insects carrying a Dominant Lethal)4, är baserad på SIT, men använder genetiska metoder för att avlägsna behovet av strålningssterilisering5-8. En RIDL stam av Ae. aegypti testades framgångsrikt i fältet i Grand Cayman9,10; ytterligare fältanvändning planeras eller pågår i andra länder runt om i världen.
Massuppfödning av insekter har etablerats i flera insektsarter och till nivåer av miljarder i veckan. Men i myggor har uppfödningen i allmänhet utförts i mycket mindre skala, med de flesta storskaliga uppfödningar som utförs på 1970- och 80-talet. För ett RIDL-program är det önskvärt att släppa så få honor som möjligt eftersom de biter och överför sjukdom. I ett massuppfostringsprogram finns det flera steg för att producera hanarna som ska släppas: äggproduktion, uppfödning av ägg fram till poppning och sedan sortering av män från kvinnor före frisättning. Dessa män används sedan för ett RIDL-kontrollprogram, släppt som antingen puppar eller vuxna11,12.
För att undertrycka en myggpopulation med RIDL måste ett stort antal högkvalitativa manliga vuxna födas upp13,14. Följande beskriver metoderna för massuppfödning av OX513A, en RIDL-stam av Ae. aegypti 8, för frisättning och täcker de tekniker som krävs för produktion av ägg och massuppfödning RIDL-hanar för ett kontrollprogram.
Introduction
Myggor överför många patogener som kan orsaka en rad sjukdomar hos människor och att kontrollera dessa myggor har varit en pågående kamp i århundraden. Strategier för att kontrollera insekter baserade på kemiska och biologiska metoder har haft några anmärkningsvärda framgångar, men i många fall har kontrollen inte varit hållbar på lång sikt. Till exempel uppnådde Brasilien utrotning av Ae. aegypti på 50-talet men myggan har åter invaderat under de senaste 40-50 åren. Detta kan hänföras till många orsaker, inklusive insekticidresistens, miljöskador, dålig kontrollprogramimplementering15-20, och snabb återvasion utan adekvat övervakning eller respons.
Nya tekniker och metoder söks för att försöka vinna denna kamp mot myggor. De senaste framstegen inom molekylära tekniker har lett till utvecklingen av nya och innovativa metoder för myggbekämpning baserade på steril insektsteknik (SIT)1-3. En kontrollmetod som kallas RIDL (Release of Insects carrying a Dominant Lethal)4 är baserad kring SIT, men använder genetiska metoder för att avlägsna behovet av strålningssterilisering. RIDL stammar har konstruerats för flera skadedjursarter inklusive Ae. aegypti 5-8, en RIDL stam av Ae. aegypti testades framgångsrikt på fältet i Grand Cayman9,10; ytterligare fältanvändning planeras eller pågår i andra länder runt om i världen. Undertrycka myggpopulationer med RIDL kommer att kräva att ett stort antal högkvalitativa manliga vuxna föds upp3,14.
För ett SIT-program anses det önskvärt att släppa endast män; kvinnliga myggor biter och överför sjukdom. Dessutom kan de frisläppta sterila männen "distraheras" av de frisläppta kvinnorna som minskar programeffektiviteten. Endast manlig frisättning visade sig vara 3-5 gånger effektivare än blandad sexfrisättning i stora fältexperiment med bestrålade Medelhavsfruktflugor21.
I ett RIDL-massuppfostringsprogram finns det flera steg för att producera hanarna för frisättning. Den första är att producera de ägg som krävs för frisättningsgenereringen (figur 1). Nästa steg är att föda upp äggen till puppar eller vuxna, separera larver från puppar och de manliga pupparna från den kvinnliga poppan. Storskalig separation av män från kvinnor kräver en skillnad mellan könen i ett visst livsstadium som lämpar sig för masssortering22. I Ae. aegypti (och andra myggarter) finns det en betydande storleksskillnad mellan han- och honpupparna som kan utnyttjas för könsseparationsteknik. De sorterade RIDL-männen släpps sedan i ett kontrollprogram som antingen puppar eller som vuxna11,12.
Nedan beskrivs metoderna för massuppfostring av OX513A, en RIDL-stam av Ae. Aegypti, för frigivning. De beskrivna metoderna omfattar de tekniker som krävs för framställning av ägg och RIDL-hanar för ett kontrollprogram.
Protocol
Insektskrav
1. Översikt
- Massuppfostring har flera faser, som var och en utförs i ett distinkt område av massuppfödningsenheten. Figur 1 visar uppfödningens huvudfas och var de förekommer i massuppfostringsanläggningen.
2. Biosäkerhetsöverväganden för insektsmedlet
- Projektet godkändes av kommittén för djuretik från universitetet i São Paulo - Brasilien och alla nödvändiga tillstånd och godkännanden erhölls.
- RIDL-systemet använder villkorlig dödlighet; Ett kosttillskott (tetracyklin) förhindrar att RIDL-systemet uttrycks så att insekterna kan massuppföddas. utan tetracyklin dör myggorna. Tetracyklin finns inte på avelsplatserna i Ae. aegypti i naturen så att alla avkommor som produceras från rymlingar inte kommer att överleva. Detta ger en extra säkerhetsnivå jämfört med användning av WT-insekter som steriliserats med andra metoder(dvs. strålning).
- Använd dubbeldörrsinmatning, "Endast auktoriserad personal" -skyltar och insektsskärmar i insektsmedlet. Alla fönster bör förseglas för att undvika förorening av kolonin med WT-insekter och hjälpa till att förhindra rymningar inifrån insektsmedlet.
- Lokala bestämmelser och myndigheter kan ha särskilda ytterligare eller alternativa krav. Kontakta berörda myndigheter för information/vägledning i ett tidigt skede och säkra alla nödvändiga tillstånd och godkännanden innan ridlstammen i ett insektslivsfågel upprättas.
- Massuppfödningsinsekten bör endast användas för RIDL-uppfödning. Inga andra stammar eller insekter bör vara närvarande. Detta för att undvika kontaminering av RIDL-stammen och kontaminering med patogener som kan påverka kondition och överlevnad, vilket minskar produktiviteten och effektiviteten hos frisläppta män.
3. Insektsdesign
- Figur 2 visar en plan för insektsmedlet som används på Biofábrica Moscamed i Brasil.
- Temperaturen i alla rum var 26 °C ± 2) med en relativ fuktighet cirka 70-80% och en 12:12 timmar ljus: mörk cykel med fluorescerande ljusremsor.
- Den här skissen kan ändras enligt specifika utrymmeskrav, t.ex. Äggproduktion, uppfödning och sortering, kvalitetskontroll (QC) och frisättning bör dock delas upp i fyra olika områden: Äggproduktionskoloni, Release Generation, QC och Adult Storage for Release.
- Äggproduktionskolonirummet (ca 20 m2) används för att producera ägg för frisättningsgenereringen.
- Kvalitetskontrollområdet är där experiment utförs för att kontrollera procedurer och KONDITIONEN hos RIDL-linjen inklusive mätningar av kläckningshastighet, poppnummer, poppstorlek och mätning av effektiviteten av sortering och avlägsnande av kvinnor. Tester utförs också för WT-kontaminering genom att kontrollera förekomsten av fluorescensmarkör och fenotyp med hjälp av offsetanalyser som mäter dödlighet.
- Release Generation-rummet (ca 36 m2)kräver tillräckligt med utrymme för brickor och sortering av larver och puppar. Brickorna hålls i specialbyggda aluminiumställ. En stor arbetsyta och diskbänk krävs för uppfödning och sortering och en annan stor diskbänk krävs för tvätt av brickor och burar. En filterfångstfälla har inkluderats i avloppsutloppet från diskbänkarna för att mildra flykten av levande myggor genom avloppet.
- Allt vatten som används för brickorna kasseras genom ett avlopp, som har ett fack som innehåller ett nät som förhindrar insektsflykt i något utvecklingsstadium.
- Ett område krävs för förvaring av vuxna för frisättning (Vuxen förvaring för frisättning, figur 2) som innehåller racking för att hålla frigöringsanordningarna medan de vuxna mognar före lanseringen.
Produktionsmetoder för massuppfostring RIDL:
Äggproduktionskolonin producerar äggen som används i releasegenerationen (figur 1) för att producera vuxna. Det finns många likheter i de två uppfödningsmetoderna men också några distinkta skillnader. Uppfödningsprocesserna som är desamma för båda procedurerna beskrivs endast i avsnittet Äggproduktionskoloni.
Äggproduktion koloni
4. Larvproduktion
Äggproduktionskolonin genererar homozygous OX513A RIDL ägg8 för releasegenerationen. Högkvalitativ kontroll säkerställer livskraft, kondition och belastningsintegritet hos de levererade äggen.
- Stimulansen för kläckning är nedsänkning i vatten med låg nivå av upplöst syre. För att minska syrenivån i vattnet, värm vatten tills det kokar och placera omedelbart 400 ml i 500 ml glasburkar (74 mm öppningsomkrets), fäst locket ordentligt och lämna vid rumstemperatur i flera timmar för att svalna.
- Lägg 1 g ägg i en burk kokt vatten, återförsluta och vänta i en timme. Överför innehållet till en bricka med 2 L vatten och lämna över natten under insektsförhållanden.
- Placera de kläckta larverna i en känd volym vatten och rör om med en magnetisk omrörare och loppa tillräckligt med tid för att ta alikvoter; omrörning kraftigt eller för längre tid skadar larver och bör hållas till ett minimum. Standardvolymen som används för att kläcka larver är 1 L, men densiteter på mer än 300 larver / ml är svåra att räkna och kan vara skadliga. Kläck därför inte mer än ca 300 000 ägg/L vatten.
- Bestäm kläckhastigheten genom att ta tre 1 ml alikvoter och placera på ett ark absorberande papper, med ett galler på 1 cm rutor, ovanpå en absorberande svamp för att suga upp överflödigt vatten. Räkna antalet kläckta och icke-halmtakta ägg från tre rutor genom att leta efter den saknade locket på ett kläckt ägg. En lucka på cirka 80-90% förväntas.
- Ta fyra alikvoter på 1 ml vardera och placera i fyra svarta vägningsbåtar (larverna är vita och därför mer synliga mot en svart bakgrund) och räkna antalet levande larver som finns med ögat; användning av en räknare rekommenderas. Det genomsnittliga antalet larver per ml används sedan för att beräkna volymen vatten att lägga till på varje bricka för att få önskat antal larver per bricka.
- Det kan finnas stora skillnader i densiteten vid vilken larver kan födas upp mellan stammar och arter. Det är också önskvärt att jämföra RIDL vuxna manliga storlek med vilda typ män; helst vill du ha liknande större RIDL-män som kan konkurrera framgångsrikt med vilda män. Därför för varje RIDL-stam måste larvernas idealtäthet bestämmas och är en kompromiss mot utrymmesbegränsningar för uppfödning och produktionsskala. Densiteter från 0,1-2,5 larva/ml har vi funnit vara en bra kombination av produktionsproduktion och kvalitet; diskuteras också av Medici23.
- Tillsätt larverna i brickor. På vår anläggning använder vi brickor som mäter ca 53 cm x 37 cm x 8 cm (L x W x H) och den önskade mängden vatten för att uppnå larvernas densitet för produktion.
- Tillsätt en stamlösning av tetracyklin (3 mg/ml i vatten) i brickorna vid en utspädning på 1:100 för att erhålla den slutliga koncentration på 30 μg/ml som krävs.
- Mata larver med flagfiskmat ( www.sera.de) dagligen, som har krossats till ett fint pulver. Tabell 1 visar den typiska utfodringsregimen i mg mat per larver och dag. Mata larver fram till lämplig sorteringsdag under de insektsförhållanden som beskrivs ovan.
5. Sortering av larver från puppar och hanar/puppar
- Sortera larver från puppar 8 dagar efter kläckning genom att separera larverna från popparna. Sen sexsorterar du pupparna för män. En enhet som kallas en plattavskiljare24,25 kan sortera larver från manliga puppar och från kvinnliga puppar. Figur 3 illustrerar användningen av denna plåtavskiljare för att separera larver från hane och från kvinnliga puppar.
- Använd en mätsked med ett nät på botten, kalibrera den med 500 puppar eller mer och använd den för att ställa in burar och uppskatta den totala mängden män och honor som poppar som produceras.
- På den första dagen av sortering (dag 8) är de flesta pupparna män, så placera de sorterade larverna tillbaka i en bricka och bakåt till nästa dag när de flesta pupporna är kvinnor (Figur 4).
- Upprepa sorteringsprocessen varje dag enligt beskrivningen i steg 2.1-2.3 tills alla larver har poppat eller till slutet av en arbetsvecka.
- Placera 1 000 manliga puppor (med måttskeden) i en bur och på dag 9 tillsätt 3 000 kvinnliga puppar i samma bur (vi använder 30 cm höga och 30 cm diameter PVC-rör anpassade med meshtopp och ett nätat åtkomsthål, men 30 cm x 30 cm x 30 cm plastburar finns också tillgängliga från BugDorm).
- Låt vuxna para sig i minst 2 dagar och ge dem sackaroslösning (10%) på våt bomull ad libitum före blodmatning. Samla ägg i två veckor (~ två gonotrofa cykler) med två blodfoder i veckan. Detta ger i genomsnitt 143 000 ägg från en bur på 3 000 honor (i genomsnitt 48 ägg /hona). För produktion av 4 miljoner ägg i veckan måste cirka 28 burar sättas upp varje vecka.
6. Blodmatning
- Ett aluminiumplåtmatningssystem förser burar med blod två gånger i veckan. En ficka av blod skapas på sidan av en aluminiumplatta (10 cm x 10 cm x 3 mm) med Parafilm (Figur 5). För att uppmuntra utfodring värms blod genom att placera en uppvärmd bönpåse ovanpå tallriksmataren. Bönpåsen bestod av cirka 250 g vetekorn i en tygpåse, som värms upp ca 10 sekunder i mikrovågsugn. Blodet vi använder för utfodring kommer från ett lokalt slakteri; Eftersom dessa djur (främst getter och får) är 10000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000
- Tre dagar efter blodmatning tillhandahålls en ovipositionsplats för kvinnorna att lägga sina ägg. Ovipositionsplatsen är en rund plastbehållare fylld till ca 1/4 med vatten och filterpapper som täcker insidan. Två dagar senare tas ovipositionsplatsen bort. För maximal äggproduktion, se till att filterpapperet täcker hela den tillgängliga ytan inuti behållaren och förblir vått.
- Ta bort äggpapperet och placera på absorberande papper för att torka under insektsförhållanden; ägg kräver en konditioneringsperiod vid hög luftfuktighet (över 70%) minst 48 timmar efter att ha lagts. Ägg kan lämnas i insektsmedlet i upp till 3 månader med minimal minskning av kläckhastigheten, så länge luftfuktigheten hålls hög25.
- Äggproduktionskolonin måste vara tillräckligt stor för att ge det antal ägg som krävs varje vecka för frisättningsprogrammet. Anläggningen som beskrivs ovan kan producera cirka 4 miljoner ägg med 28 burar som sätts upp varje vecka. Det rekommenderas att hålla tillräckligt med ägg lagrade för att garantera minst 4 veckors ägg för release generation och äggproduktionskoloni.
Släpp generation
7. Larvproduktion
Kläcknings-, uppfödnings- och sorteringsprocesserna för frisättningsgenereringen är identiska med den tidigare beskrivna metoden för äggproduktionskolonin. Produktionsskalan är dock mycket större och detta kräver fler brickor och mer ansträngning.
8. Sortering av larver, manliga puppar och kvinnliga puppar
- Sortering av larver, manliga puppar och kvinnliga puppar är identisk med den metod som beskrivs för äggproduktion.
- Efter sortering av hanpupparna är det viktigt att kontrollera om honen är kontaminering före frisättning; Det bör inte finnas mer än 1% kvinnor närvarande. Ta tre alikvoter på 500 puppar (tre slumpmässiga puppar som mäter skedar) och räkna antalet kvinnliga puppar närvarande. Kvinnor kan identifieras eftersom de i allmänhet är större än män och från skillnader i genital lobform (Figur 6)27. Om det finns mer än 1% kvinnor bör de tillgripas och kontrolleras igen.
- Använd endast hanarna från dag 8 och 9 för frisättning; autoklav eventuella återstående larver och puppar. I Brasilien måste detta avfall behandlas på samma sätt som medicinskt avfall, men bestämmelserna kan skilja sig åt i andra länder. Använd inte kvinnliga puppar och larver från releasegenerationen för äggproduktionskolonin på grund av skillnader i kvalitetskontroll, uppfödning och föroreningsrisker från större antal och lägre kvalitetskontroll.
Vuxen lagring för release: Placera män i release enheter för att dyka upp och mogna innan de släpps. Detaljerna om release-enheterna omfattas inte av den här metoden. Men kapaciteten hos de releaseenheter vi använder är cirka 1 000 män. Information om utgivningsmetoden (release device och release system) omfattas inte av den här metoden.
Representative Results
De förväntade resultaten av poppningen för produktionen visas i figur 4. Hanarna poppar först, toppar på dag 8 och honorna toppar dag 9 efter kläckning. Det är viktigt att mäta denna valpkurva för att veta den bästa tiden att sortera män från kvinnor.
Resultat från över 6 månaders sortering av manliga och kvinnliga puppor visar att kvinnlig kontaminering i genomsnitt är 0,02% (Figur 5; SEM = 0,004 %). Denna föroreningsgrad representerar endast 400 honor som släppts ut under en månads utsläpp (ca två miljoner män). Nuvarande äggproduktion per vecka är 4 miljoner. Av dessa kläcks 3,5 miljoner för äggkoloni och produktion med resten lagrade för säkerhetskopiering. Cirka 11% av äggen används för äggproduktionskoloni och resten för frisättningsgenerering. Äggluckans hastighet är i genomsnitt 87,3% (SEM = 0,5%) och utbyte av manliga puppar från L1 larver i genomsnitt 29,5% (SEM = 1,2). Två miljoner larver föds upp varje vecka för Release Generation-kolonin som producerar cirka 571 000 manliga puppar (SEM = 14 000). Poppa och vuxen dödlighet under uppkomst och frisättning i genomsnitt 5%, vilket resulterar i cirka 543 000 (SEM = 13 000) utsläppta vuxna manliga myggor per vecka. Den nuvarande produktionen på 4 miljoner ägg/vecka förväntas minskas till ~3 miljoner/vecka med ytterligare optimering för att minska förlusten från slöseri och lagring. Totalt behövs 6 anställda för den beskrivna produktionen. fyra arbetar med frisättningsgenerering och de återstående två på äggkolonin.
kvalitetskontroll
Kvalitetskontroll är avgörande för att upprätthålla kvaliteten på de vuxna, effektiviteten i uppfödning, arbetskraft och kostnader.
Transgene fenotyp kontroll
För att verifiera RIDL genuttryck utförs två kontroller, för det första för att kontrollera uttryck av fluorescens markör och för det andra för att kontrollera uttrycket av RIDL lethality drag i avsaknad av tetracyklin. Alla larver bör uttrycka fluorescerande markören. För att kontrollera om fluorescerande markören uttrycks som förväntat kontrolleras 2 000 första instar larver under ett Leica MZFLIII stereomikroskop med DsRed2-filter (Texas Red) för att avgöra om några icke-fluorescerande individer finns. Utan tetracyklin uttrycks RIDL genen och vi förväntar oss 3-4% överlevnad till vuxna8. För att kontrollera detta ställs ett extra fack in för varje frisättningssats utan tetracyklin. Den enda skillnaden mot normal uppfödning är att maten reduceras med 2/3 från dag 6 eftersom ackumulering av överskott av mat på grund av döda larver kan resultera i överskott av bakterietillväxt.
Uppfödningskontroll
Fyra fack från frisättningsgenereringen väljs slumpmässigt för att sorteras och räknas separat. Antalet manliga och kvinnliga puppar registreras från varje bricka varje dag (figur 4). Varje avvikelse från det förväntade antalet män och kvinnor indikerar ett potentiellt problem som kan påverka produktionen och/ eller konditionen och kan jämföras med äggkolonin för att hjälpa till att bestämma källan till problem.
Puppmätningar
Pupastorlek har visat sig vara korrelerad med vuxenstorlek28. Som en kvalitetskontroll för vuxenstorlek mäts cefalothoraxbredden av minst 30 manliga puppar för varje sorteringsdag från frisättningsgenereringen; för äggproduktionskolonin mäts också kvinnliga puppar. Den genomsnittliga cefalothoraxbredden var 1,05 mm (SEM 0, 005) för frisläppta hanar och 1, 04 mm (SEM = 0, 006) respektive 1, 29 mm (SEM = 0, 006) för män respektive kvinnor Äggproduktion, Koloni; liknande resultat erhölls för Ae. albopictus massa uppfödning24.
Figur 1. Stadier av massuppfödning myggor för användning i ett RIDL / SIT-program. Äggproduktionskolonin har en hög nivå av kvalitetskontroll för att säkerställa kvaliteten på de ägg som levereras till frisättningsgenerationen. Ägg föds upp till puppar i frisättningskolonin, där männen sorteras från kvinnorna. De manliga vuxna används sedan för RIDL-kontrollprogrammet.
Figur 2. Schematiskt av uppfödningsanläggningen för produktion av RIDL-hanar för ett frigörareprogram. Högkvalitativa ägg produceras kontinuerligt i äggproduktionskolonirummet och föds sedan upp till puppar i Release Generation-rummet. Larverna och popparna separeras sedan och popparna könssorteras för män. Hanarna placeras sedan i releaseenheter och får mogna till vuxna för frigivning i vuxenförrådet och frigöringsrummet.
Figur 3. Separera larver, manliga puppar och kvinnliga puppar med en tallriksavskiljare26. Plattavskiljaren använder storleksskillnaden mellan larver, manliga puppar och kvinnliga puppar för att sortera dessa tre olika livsstadier; larver tenderar att vara mindre än manliga puppar som i sin tur är mindre än kvinnliga puppar. Instrumentet består av två glasplattor; den ena är fastsatt på en sned metallram och den andra sitter ovanpå den första plattan och kan flyttas i förhållande till den första med fyra justeringsskruvar (A). De fyra justeringsskruvarna gör att ytterplattan kan ställas in i vinkel mot bakplattan så att ett kilformat utrymme bildas mellan plattorna och avsmalnar nedåt. Larver och puppor hälls mellan glasplattorna(B)och tvättas försiktigt med en vattenslang(C). Genom att justera plattans vinkel kan larver, manliga puppar och kvinnliga puppar separeras (D). Med kontinuerlig spolning och ökning av plattvinkeln kan larverna spolas igenom först (i en sikt), följt av den manliga poppan och slutligen den kvinnliga poppen.
Figur 4. Pupationskurvor för massuppfödda RIDL Ae. aegypti. Detta diagram visar den genomsnittliga procentuella poppningen för massuppfödda RIDL manliga och kvinnliga puppar under 23 veckor observation med ~ 135,000 poppa återhämtade sig per vecka. Felstaplar = standardfel av medelvärde, n = 23. På den första samlingen (dag 8) återhämtade vi oss i genomsnitt 59% manliga och 30% kvinnliga puppar från totala popp som återvunnits från brickor under 5 dagar.
Figur 5. Genomsnittlig kvinnlig förorening av sorterade manliga puppar. Detta diagram visar den månatliga genomsnittliga procentuella kvinnliga föroreningen under manlig sortering dag 8 efter kläckning under en sexmånadersperiod.
Figur 6. Aluminiumplatta blodmatare system. Plattan (B) är täckt med Parafilm (A) och blod rör i en ficka och förseglas sedan (D). Plattan placeras på en bur och värms upp genom att placera en uppvärmd bönpåse(C)ovanpå (E).
Figur 7. Särskiljande manliga och kvinnliga Ae. aegypti puppar. Ae. aegypti puppar kan vara tillförlitligt könsbestämda av skillnaderna i genital lobform (i slutet av pupal buksegment strax under paddlarna). Dessutom tenderar män också att vara mindre än kvinnor.
Tabell 1. Allmän utfodring regim för Ae. aegypti RIDL larver (mg mat per larva per dag). För att beräkna den faktiska mängden mat som krävs multipliceras med det totala antalet larver per bricka.
Discussion
RIDL är en effektiv och miljösäker metod för att kontrollera myggor3,29-31. Tekniken är tillämplig på ett integrerat skadedjursbekämpningsprogram och de flesta nuvarande bekämpningsmetoder, inklusive larvicider, minskning av avelsplatser och adulticider är kompatibla med denna teknik. Denna metod beskriver hur man producerar upp till 570 000 RIDL manliga puppar per vecka för användning vid kontroll av Ae. Aegypti och vår kunskap är detta den första beskrivningen av produktionen av transgena myggor i denna skala. Vissa jämförbara produktionssystem utvecklades för vilda typ Ae. aegypti på 1960- och 70-talet25, men det har inte funnits någon jämförbar produktion i denna skala sedan dess. I Brasilien har omkring 11 miljoner män släppts från februari 2011 till februari 2012. Antalet män som krävs för att ett visst område ska kontrolleras beror på ett antal faktorer, inklusive storleken på den vilda populationen, spridningen av frisläppta hanar, mäns överlevnad och parningskonkurrenskraft efter utsläppet och miljöförhållandena. Tidigare studier har visat att RIDL kan minska en myggpopulation med minst 80%9.
Det behövs en balans mellan att optimera massuppfostring för produktionsskala och kostnad kontra kvalitet på män. Till exempel kan ökad larvtäthet öka produktionskapaciteten genom att minska det utrymme som krävs, arbete och tid till poppning32. Men för höga densiteter av larver kan resultera i mindre och kortare levda män med minskadparningskapacitet 32,33. Kvaliteten på män i förhållande till ett SIT-program kommer i slutändan att bedömas av förmågan hos frisläppta män att para sig med kvinnor inom området. Det krävs omfattande fältutvärdering för att bedöma parnings konkurrenskraften i förhållande till vildamotsvarigheter 9,10. Detta gör det ofta opraktiskt att utvärdera exakt vilka faktorer som gör en "högkvalitativ" manlig mygga. Att upprätthålla en konsekvent produktion och kvalitet (i den utsträckning som rutinmässigt kan utvärderas) vid storskalig massuppfödning är dock av största vikt. Detta kräver en hög grad av vaksamhet och standardisering av alla processer med små fluktuationer som potentiellt har en betydande inverkan. Aliquoting av L1 larver är ett kritiskt steg och illustrerar denna punkt. Att alicitera rätt antal larver i brickor är viktigt för produktion av god kvalitet. Utfodringsregimen är exakt skräddarsydd för specifikt antal larver. För få/många larver kommer att resultera i över/ under utfodring, vilket påverkar larvöverlevnad, poppstorlek och tid till poppning. Om det finns en hemlighet för massuppfostringskonsten är det att se till att de många små stegen i produktionscykeln genomförs konsekvent, exakt och med en hög nivå av kvalitetskontroll, som beskrivs i detta dokument.
Disclosures
Författare anslutna till Oxitec har sysselsättning och/eller eget kapital i Oxitec Ltd. Oxitec Ltd och Oxford University innehar immateriella rättigheter relaterade till ämnet för detta dokument.
Acknowledgments
Vi vill tacka Biofábrica Moscamed Brasil, Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) och Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnologia (CNPq) för ekonomiskt stöd. Vi vill också tacka följande personer för deras hjälp. Miriam dos Santos, Gildeane Silva, Gessilane dos Santos, Fabio Gonçalves, John Paul Oliveira, Luiza Garziera, José Carlos Valença.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vipan Premium |
Sera GmbH | 190 |
http://www.sera.de/uk/pages/products/product/sera-vipan-3.html |
| Tetracycline |
Sigma Aldrich | T7660 |
|
| Plate separator |
J.W. Hock | 5412 |
http://www.johnwhock.com/download/manuals/instr_5412_separator.pdf |
| Parafilm M |
Pechiney Plastic packing | PM-996 |
|
| Rearing pans for Release generation (53 cm x 38 cm x 8 cm) |
Pleion | 0757 |
|
| Fluorescent scope |
Leica Microsystems | MZ FLIII |
http://www.leica-microsystems.com/fileadmin/downloads/Leica%20MZ%20FLIII/Brochures/M1-160-0de.pdf |
| Adult cages |
BugDorm | DP1000 |
http://bugdorm.megaview.com.tw/bugdorm-1-insect-rearing-cage-30x30x30-cm-pack-of-one-p-29.html |
| Filter paper |
CELAB |
References
- Dyck, V., et al. Sterilizing Insects with Ionizing Radiation. Sterile Insect Technique. , Springer. Netherlands. 233-268 (2005).
- Dyck, V., Hendrichs, J., Robinson, A. S., Klassen, W., Curtis, C. History of the Sterile Insect Technique.. Sterile Insect Technique. , Springer. Netherlands. 3-36 (2005).
- Alphey, L., et al. Sterile-insect methods for control of mosquito-borne diseases – an analysis. Vector Borne Zoonotic Dis. 10, 295-311 (2010).
- Thomas, D. D., Donnelly, C. A., Wood, R. J., Alphey, L. S. Insect population control using a dominant, repressible, lethal genetic system. Science. 287, 2474-2476 (2000).
- Fu, G., et al. Female-specific insect lethality engineered using alternative splicing. Nat. Biotechnol. 25, 353-357 (2007).
- Fu, G., et al. Female-specific flightless phenotype for mosquito control. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4550-4554 (2010).
- Gong, P., et al. A dominant lethal genetic system for autocidal control of the Mediterranean fruitfly. Nat. Biotechnol. 23, 453-456 (2005).
- Phuc, H. K., et al. Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control. BMC Biol. 5 (11), (2007).
- Harris, A. F., et al. Successful suppression of a field mosquito population by sustained release of engineered male mosquitoes. Nat. Biotechnol. 30, 828-830 (2012).
- Harris, A. F., et al. Field performance of engineered male mosquitoes. Nat. Biotechnol. 29, 1034-1037 (2011).
- Bailey, D. L., Lowe, R. E., Dame, D. A., Seawright, J. A. Mass rearing the genetically altered MACHO strain of Anopheles albimanus Wiedemann. Am. J. Trop. Med. Hyg. 29, 141-149 (1980).
- Benedict, M. Q., et al. Colonisation and mass rearing: learning from others. Malar. J.. 8 Suppl 2 (S4), (2009).
- Alphey, L. Re-engineering the sterile insect technique. Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1243-1247 (2002).
- Wise de Valdez,, R, M., et al. Genetic elimination of dengue vector mosquitoes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4772-4775 (2011).
- Macoris Mde,, L,, et al. Resistance of Aedes aegypti from the state of Sao Paulo, Brazil, to organophosphates insecticides. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 98, 703-708 (2003).
- Campos, J., Andrade, C. F. Larval susceptibility of Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus populations to chemical insecticides. Rev. Saude Publica. 37, 523-527 (2003).
- Gubler, D. J. Resurgent vector-borne diseases as a global health problem. Emerg. Infect. Dis. 4, 442-450 (1998).
- Harris, A. F., Rajatileka, S., Ranson, H. Pyrethroid resistance in Aedes aegypti from Grand Cayman. Am. J. Trop. Med. Hyg. 83, 277-284 (2010).
- Lima, J. B., et al. Resistance of Aedes aegypti to organophosphates in several municipalities in the State of Rio de Janeiro and Espirito Santo. Am. J. Trop. Med. Hyg. 68, Brazil. 329-333 (2003).
- Paris, M., et al. Persistence of Bacillus thuringiensis israelensis (Bti) in the environment induces resistance to multiple Bti toxins in mosquitoes. Pest Manag. Sci. 67, 122-128 (2010).
- Rendon, P., McInnis, D., Lance, D., Stewart, J. Medfly (Diptera: Tephritidae) genetic sexing: large-scale field comparison of males-only and bisexual sterile fly releases in Guatemala. J. Econ. Entomol. 97, 1547-1553 (2004).
- Papathanos, P. A., et al. Sex separation strategies: past experience and new approaches. Malar. J.. 8 Suppl 2 (S5), (2009).
- Medici, A., et al. Studies on Aedes albopictus larval mass-rearing optimization. J. Econ. Entomol. 104, 266-273 (2011).
- Focks, D. A. An improved separator for the developmental stages, sexes and species of mosquito (Diptera Culicidae). J. Med. Entomol. 17, 567-568 (1980).
- Fay, R. W., McCray, E. M., Kilpatrick, J. W. Mass production of sterilized male Aedes aegypti. Mosquito News. 23, 210-214 (1963).
- Christophers, S. R. Aedes aegypti the yellow fever mosquito: Its life history, Bionomics and Structure. , Cambridge University Press. (2009).
- Jones, J. C. A simple method for sexing living Anopheles Larvae (diptera, culicidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 50, 104-106 (1957).
- Koenraadt, C. J. M. Pupal Dimensions as Predictors of Adult Size in Fitness Studies of Aedes aegypti (Diptera Culicidae). J. Med. Entomol. 45, 331-336 (2008).
- Alphey, L., Nimmo, D., O'Connell, S., Alphey, N. Insect population suppression using engineered insects. Adv. Exp. Med. Biol. 627, 93-103 (2008).
- Alphey, N., Bonsall, M. B., Alphey, L. Modeling resistance to genetic control of insects. J. Theor. Biol. 270, 42-55 (2011).
- Atkinson, M. P., et al. Analyzing the control of mosquito-borne diseases by a dominant lethal genetic system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 9540-9545 (2007).
- Bargielowski, I., Nimmo, D., Alphey, L., Koella, J. C. Comparison of life history characteristics of the genetically modified OX513A line and a wild type strain of Aedes aegypti. PLoS One. 6 (e20699), (2011).
- Bargielowski, I., Alphey, L., Koella, J. C. Cost of mating and insemination capacity of a genetically modified mosquito Aedes aegypti OX513A compared to its wild type counterpart. PLoS One. 6 (26086), (2011).
