Summary
For å oppnå befolkningsundertrykking av Aedes aegypti ved hjelp avRIDL-® (Frigjøring av insekter som bærer et dominerende dødelig) system, må et stort antall mannlige mygg frigjøres. Dette krever bruk av masseoppdrettsteknikker og teknologi for å gi pålitelige systemer for å oppnå maksimalt antall mannlige mygg av høy kvalitet.
Abstract
Nye teknikker og metoder blir forsøkt å prøve å vinne kampen mot mygg. Nylige fremskritt innen molekylære teknikker har ført til utvikling av nye og innovative metoder for myggkontroll basert rundt steril insektteknikk (SIT)1-3. En kontrollmetode kjent som RIDL (Release of Insects carrying a Dominant Lethal)4, er basert rundt SIT, men bruker genetiske metoder for å fjerne behovet for strålingsterilisering5-8. En RIDL-stamme av Ae. aegypti ble vellykket testet i feltet i Grand Cayman9,10; videre feltbruk planlegges eller pågår i andre land rundt om i verden.
Masseoppdrett av insekter er etablert i flere insektarter og til nivåer på milliarder i uken. Men i mygg har oppdrett generelt blitt utført i en mye mindre skala, med de fleste store oppdrett som utføres på 1970- og 80-tallet. For et RIDL-program er det ønskelig å frigjøre så få kvinner som mulig når de biter og overfører sykdom. I et masseoppdrettsprogram er det flere stadier for å produsere hannene som skal frigjøres: eggproduksjon, oppdrett av egg til pupering, og deretter sortere menn fra kvinner før utgivelse. Disse hannene brukes deretter til et RIDL-kontrollprogram, utgitt som enten pupper eller voksne11,12.
For å undertrykke en myggpopulasjon ved hjelp av RIDL må et stort antall mannlige voksne av høy kvalitet oppdras13,14. Følgende beskriver metodene for masseoppdrett av OX513A, en RIDL-stamme av Ae. aegypti 8, for frigjøring og dekker teknikkene som kreves for produksjon av egg og masseoppdrett av RIDL-menn for et kontrollprogram.
Introduction
Mygg overfører mange patogener som kan forårsake en rekke sykdommer hos mennesker og kontrollere disse myggene har vært en pågående kamp i århundrer. Strategier for å kontrollere insekter basert på kjemiske og biologiske metoder har hatt noen bemerkelsesverdige suksesser, men i mange tilfeller har kontrollen ikke vært bærekraftig på lang sikt. For eksempel oppnådde Brasil utryddelse av Ae. aegypti på 50-tallet, men mygga har reinvadert de siste 40-50 årene. Dette kan tilskrives mange årsaker, inkludert insektmiddelmotstand, miljøskade, dårlig kontrollprogramimplementering15-20, og rask reinvasjon uten tilstrekkelig overvåking eller respons.
Nye teknikker og metoder blir forsøkt å prøve å vinne denne kampen mot mygg. Nylige fremskritt innen molekylære teknikker har ført til utvikling av nye og innovative metoder for myggkontroll basert rundt steril insektteknikk (SIT)1-3. En kontrollmetode kjent som RIDL (Release of Insects carrying a Dominant Lethal)4 er basert rundt SIT, men bruker genetiske metoder for å fjerne behovet for strålingsterilisering. RIDL stammer har blitt konstruert for flere skadedyrsarter, inkludert Ae. aegypti 5-8, En RIDL-stamme av Ae. aegypti ble vellykket testet i feltet i Grand Cayman9,10; videre feltbruk planlegges eller pågår i andre land rundt om i verden. Undertrykke myggpopulasjoner ved hjelp av RIDL vil kreve et stort antall mannlige voksne av høy kvalitet som skal oppdras3,14.
For et SIT-program anses det som ønskelig å frigjøre bare menn; kvinnelige mygg biter og overfører sykdom. I tillegg kan de frigjorte sterile hannene bli "distrahert" av de frigjorte hunnene som reduserer programmets effektivitet. Kun mannlig frigjøring ble vist å være 3-5 ganger mer effektiv enn blandet sexutgivelse i store feltforsøk med bestrålede middelhavsfruktfluer21.
I et RIDL masseoppdrettsprogram er det flere stadier for å produsere hannene for frigjøring. Den første er å produsere eggene som kreves for frigjøringsgenereringen (Figur 1). Neste trinn er å bake eggene gjennom til pupper eller voksne, skille larver fra pupper og den mannlige puppene fra den kvinnelige puppene. Storskala separasjon av menn fra kvinner krever en forskjell mellom kjønnene på et bestemt livsstadium egnet for massesortering22. I Ae. aegypti (og andre myggarter) er det en betydelig størrelsesforskjell mellom mannlige og kvinnelige pupper som kan utnyttes til kjønnsseparasjonsteknikker. De sorterte RIDL-hannene frigjøres deretter i et kontrollprogram som enten pupper eller som voksne11,12.
Følgende beskriver metodene for masseoppdrett av OX513A, en RIDL-stamme av Ae. Aegypti, for løslatelse. Metodene som er beskrevet dekker teknikkene som kreves for produksjon av egg og RIDL menn for et kontrollprogram.
Protocol
Insektariske krav
1. Oversikt
- Masseoppdrett har flere faser, som hver utføres i et tydelig område av masseoppdrettsenheten. Figur 1 viser hovedfasen av oppdrett og hvor de forekommer i masseoppdrettsanlegget.
2. Biosikkerhetshensyn for insektet
- Prosjektet ble godkjent av komiteen for dyreetikk fra Universitetet i São Paulo - Brasil og alle nødvendige tillatelser og godkjenninger ble oppnådd.
- RIDL-systemet bruker betinget dødelighet; et kosttilskudd (tetracyklin) forhindrer uttrykket av RIDL-systemet slik at insekter kan masseoppdras; uten tetracyklin dør myggene. Tetracyklin finnes ikke i avlsstedene til Ae. aegypti i naturen, slik at noen avkom produsert fra rømninger ikke vil overleve. Dette gir et ekstra sikkerhetsnivå over bruk av ville (WT) insekter sterilisert ved andre metoder (dvs. stråling).
- Bruk dobbeltdørsinngang, "Kun autorisert personell" tegn og insektskjermer i insektet. Eventuelle vinduer bør forsegles for å unngå forurensning av kolonien med WT-insekter og bidra til å forhindre rømming fra innsiden av insektet.
- Lokale forskrifter og myndigheter kan ha konkrete tilleggskrav eller alternative krav. Ta tidlig kontakt med relevante myndigheter for informasjon/veiledning, og sikre alle nødvendige tillatelser og godkjenninger før du etablerer RIDL-stammen i en insekt.
- Masseoppdrett av insekt skal bare brukes til RIDL oppdrett. Ingen andre stammer eller insekter bør være til stede. Dette er for å unngå forurensning av RIDL-stammen og forurensning med patogener som kan påvirke kondisjon og overlevelse, noe som reduserer produktiviteten og effektiviteten til frigjorte menn.
3. Insektdesign
- Figur 2 viser en plan for insektet som brukes ved Biofábrica Moscamed i Brasil.
- Temperaturen på alle rommene var 26 °C ± 2) med en relativ fuktighet ca. 70-80% og en 12:12 timers lys:mørk syklus ved hjelp av fluorescerende lysstrimler.
- Denne tegningen kan endres i henhold til spesifikke plasskrav, for eksempel vil omfanget av utgivelsen bestemme den totale størrelsen. Imidlertid bør eggproduksjon, oppdrett og sortering, kvalitetskontroll (QC) og utgivelser deles inn i fire forskjellige områder: Egg Production Colony, Release Generation, QC og Adult Storage for Release.
- Egg Production Colony-rommet (ca. 20 m2) brukes til å produsere egg til frigjøringsgenerasjonen.
- Kvalitetskontrollområdet er der eksperimenter utføres for å sjekke prosedyrer og kondisjonen til RIDL-linjen, inkludert målinger av lukehastighet, pupper, puppestørrelse og måling av effektiviteten av sortering og fjerning av kvinner. Tester utføres også for WT-forurensning ved å se etter tilstedeværelse av fluorescensmarkør og fenotype ved hjelp av offsetanalyser som måler dødelighet.
- Release Generation-rommet (ca. 36 m2) krever tilstrekkelig plass til skuffer og sortering av larver og pupper. Skuffene holdes i spesialbygde aluminiumsstativer. Et stort arbeidsområde og vask er nødvendig for oppdrett og sortering, og en annen stor vask er nødvendig for vasking av skuffer og bur. En filterlåsfelle er inkludert i avløpsvannet fra vaskene for å redusere rømmingen av levende mygg gjennom kloakken.
- Alt vann som brukes til skuffene kastes gjennom et avløp, som har et rom som inneholder et nett som forhindrer rømming av insekter i et hvilket som helst utviklingsstadium.
- Det kreves et område for lagring av voksne for utgivelse (Adult Storage for Release, figur 2) som inneholder racking for å holde utløserenhetene mens de voksne modnes før de slippes ut.
Produksjonsmetoder for masseopprustning RIDL:
Eggproduksjonskolonien produserer eggene som brukes i frigjøringsgenerasjonen (figur 1) for å produsere voksne. Det er mange likheter i de to oppdrettsmetodene, men også noen tydelige forskjeller. Oppdrettsprosessene som er de samme for begge prosedyrene er bare beskrevet i Egg Production Colony-delen.
Egg produksjon koloni
4. Larval Produksjon
Eggproduksjonskolonien genererer homozygote OX513A RIDL-egg8 for frigjøringsgenerasjonen. Høy kvalitetskontroll sikrer levedyktighet, kondisjon og belastningsintegritet til eggene som leveres.
- Stimulansen for klekking er nedsenking i vann med lavt nivå av oppløst oksygen. For å redusere oksygennivået i vannet, varme vann til det kokes og umiddelbart plassere 400 ml i 500 ml glassglass (74 mm åpningsomkrets), fest lokket sikkert og la det stå ved romtemperatur i flere timer for å avkjøle.
- Legg 1 g egg i en krukke med kokt vann, reseal og vent i en time. Overfør innholdet til et brett med 2 L vann og la det stå over natten under insektforhold.
- Plasser de klekkede larver i et kjent volum vann og rør ved hjelp av en magnetisk rører og loppe for tilstrekkelig tid til å ta aliquots; røre kraftig eller i lengre tid skader larver og bør holdes på et minimum. Standardvolumet som brukes til å klekke larver er 1 L, men tettheter på mer enn 300 larver / ml er vanskelige å telle og kan være skadelige. Lukk derfor ikke mer enn ca. 300 000 egg/l vann.
- Bestem lukehastigheten ved å ta tre 1 ml aliquots og plassere på et ark med absorberende papir, med et rutenett på 1 cm firkanter, på toppen av en absorberende svamp for å suge opp overflødig vann. Tell antall klekkede og ikke-hakkede egg fra tre firkanter ved å lete etter den manglende hetten på et klekket egg. En lukehastighet på rundt 80-90% forventes.
- Ta fire aliquots på 1 ml hver og legg i fire svarte veiebåter (larver er hvite og derfor lettere synlige mot en svart bakgrunn) og tell antall levende larver tilstede for øye; Bruk av en teller anbefales. Gjennomsnittlig antall larver per ml brukes deretter til å beregne volumet av vann for å legge på hver skuff for å få ønsket antall larver per skuff.
- Det kan være store forskjeller i tettheten der larver kan oppdras mellom stammer og arter. Det er også ønskelig å sammenligne RIDL voksen mannlig størrelse med vill type menn; ideelt sett vil du ha lik større STØRRELSE RIDL menn som kan konkurrere vellykket med ville menn. Derfor for hver RIDL-stamme må larvens ideelle tetthet bestemmes og er en avveining mot plassbegrensninger for oppdrett og produksjonsskalaen. Tettheter fra 0,1-2,5 larve/ ml har vi funnet å være en god kombinasjon av produksjonsproduksjon og kvalitet; også diskutert av Medici23.
- Legg larvene til skuffer. På vårt anlegg bruker vi skuffer som måler ca 53 cm x 37 cm x 8 cm (L x B x H) og den nødvendige mengden vann for å oppnå tettheten av larver til produksjon.
- Tilsett en lagerløsning av tetracyklin (3 mg/ml i vann) i skuffene ved en 1:100 fortynning for å oppnå den nødvendige endelige konsentrasjonen på 30 μg/ml.
- Fôr larver med flak fiskemat (www.sera.de) daglig, som har blitt knust til et fint pulver. Tabell 1 viser det typiske fôringsregimet i mg mat per larver per dag. Fôr larver til riktig sorteringsdag under de insektære forholdene beskrevet ovenfor.
5. Sortering av larver fra pupper og mannlige / kvinnelige pupper
- Sorter larver fra pupper 8 dager etter klekking ved å skille larver fra puppene. Så sex-sortere puppene for menn. En enhet kjent som en plateseparator24,25 kan sortere larver fra mannlige pupper og fra kvinnelige pupper. Figur 3 illustrerer bruken av denne plateseparatoren for å skille larver fra mannlige og fra kvinnelige pupper.
- Bruk en måleskje med et nett på bunnen, kalibrer den med 500 pupper eller mer og bruk den til å sette opp bur og estimere den totale mengden menn og kvinner pupper produsert.
- På den første sorteringsdagen (dag 8) er de fleste puppene menn, så legg de sorterte larver tilbake i et brett og bak til neste dag når de fleste puppene er kvinner (Figur 4).
- Gjenta sorteringsprosessen hver dag som beskrevet i trinn 2.1-2.3 til alle larvene har pupert eller til slutten av en arbeidsuke.
- Plasser 1000 mannlige pupper (ved hjelp av måleskjeen) i et bur og på dag 9 tilsett 3000 kvinnelige pupper til samme bur (vi bruker 30 cm høye og 30 cm diameter PVC-rør tilpasset med mesh-topp og et nettet tilgangshull, men 30 cm x 30 cm x 30 cm plastbur er også tilgjengelige fra BugDorm).
- La voksne parre seg i minst 2 dager og gi dem sukroseoppløsning (10%) på våt bomull ad libitum før blodfôring. Samle egg i to uker (~ to gonotrofiske sykluser) med to blodfôr i uken. Dette gir gjennomsnittlig 143 000 egg fra et bur på 3000 kvinner (i gjennomsnitt 48 egg / kvinner). For produksjon av 4 millioner egg i uken må det settes opp ca 28 merder hver uke.
6. Blodfôring
- Et aluminiumsplatefôringssystem leverer bur med blod to ganger i uken. En blodlomme opprettes på siden av en aluminiumsplate (10 cm x 10 cm x 3 mm) med Parafilm (Figur 5). For å oppmuntre til fôring varmes blodet ved å plassere en oppvarmet bønnepose på toppen av tallerkenmateren. Bønneposen besto av ca 250 g hvetekorn i en klutpose, som oppvarmes i ca 10 sek i en mikrobølgeovn. Blodet vi bruker til fôring er fra en lokal abattoir; da disse dyrene (hovedsakelig geiter og sauer) er til konsum, blir de testet for å unngå tilstedeværelse av patogener.
- Tre dager etter blodfôring er det gitt et oviposisjonssted for hunnene å legge eggene sine. Oviposisjonsstedet er en rund plastbeholder fylt til ca. 1/4 med vann og filterpapir som dekker innsiden. To dager senere fjernes oviposisjonsstedet. For maksimal eggproduksjon må du sørge for at filterpapiret dekker hele den tilgjengelige overflaten inne i beholderen og forblir våt.
- Fjern eggpapiret og legg det på absorberende papir for å tørke under insektforhold; egg krever en periode med kondisjonering ved høy luftfuktighet (over 70%) minst 48 timer etter å ha blitt lagt. Egg kan stå i insektet i opptil 3 måneder med minimal reduksjon i lukehastigheten, så lenge fuktigheten holdes høy25.
- Eggproduksjonskolonien må være av tilstrekkelig størrelse for å gi antall egg som kreves på ukentlig basis for utgivelsesprogrammet. Anlegget beskrevet ovenfor kan produsere ca 4 millioner egg med 28 merder satt opp ukentlig. Det anbefales å holde nok egg lagret for å garantere minst 4 uker med egg for Release Generation og Egg Production Colony.
Utgivelsesgenerering
7. Larval Produksjon
Klekkings-, oppdretts- og sorteringsprosessene for frigjøringsgenerasjonen er identiske med den tidligere beskrevne metoden for Egg Production-kolonien. Produksjonsskalaen er imidlertid mye større, og dette krever flere skuffer og mer innsats.
8. Sortering av larver, mannlige pupper og kvinnelige pupper
- Sorteringen av larver, mannlige pupper og kvinnelige pupper er identisk med metoden beskrevet for Egg Production.
- Etter sortering av den mannlige puppen er det viktig å sjekke for kvinnelig forurensning før frigjøring; det bør ikke være mer enn 1% kvinner til stede. Ta tre aliquots av 500 pupper (tre tilfeldige pupper måleskjeer) og telle antall kvinnelige pupper til stede. Hunnene kan identifiseres da de generelt er større enn menn og fra forskjeller i kjønnslobeformen (Figur 6)27. Hvis det er mer enn 1% kvinner, bør de ty til og kontrolleres igjen.
- Bruk bare hannene fra dag 8 og 9 for frigjøring; autoklavere eventuelle gjenværende larver og pupper. I Brasil må dette avfallet behandles på samme måte som medisinsk avfall, men regelverket kan variere i andre land. Ikke bruk kvinnelige pupper og larver fra frigjøringsgenerasjonen for eggproduksjonskolonien på grunn av forskjeller i kvalitetskontroll, oppdrett og forurensningsrisiko fra større antall, og lavere kvalitetskontroll.
Lagring for voksne for frigjøring: Plasser menn i utløserenheter for å dukke opp og modnes før de slippes ut. Detaljene for utgivelsesenhetene dekkes ikke i denne metoden. Imidlertid er kapasiteten til utgivelsesanordningene vi bruker rundt 1000 menn. Utgivelsesmetodedetaljene (utgivelsesenhet og utgivelsessystem) dekkes ikke i denne metoden.
Representative Results
De forventede puperingsresultatene for produksjonen er vist i figur 4. Hannene popper først, topper på dag 8 og hunnene topper på dag 9 etter klekking. Det er viktig å måle denne puperingskurven for å vite den beste tiden å sortere menn fra kvinner.
Resultater fra over 6 måneder med sortering av mannlige og kvinnelige pupper viser at kvinnelig forurensning i gjennomsnitt er 0,02% (Figur 5; SEM = 0,004%). Denne forurensningsraten representerer bare 400 kvinner som slippes ut over en måned med utgivelser (ca. to millioner menn). Nåværende eggproduksjon per uke er 4 millioner. Av disse klekkes 3,5 millioner ut for eggkoloni og produksjon med resten lagret for sikkerhetskopiering. Omtrent 11% av eggene brukes til eggproduksjonskoloni og rester for frigjøringsgenerering. Eggluke rate gjennomsnitt 87,3% (SEM = 0,5%) og utbytte av mannlige pupper fra L1 larver er i gjennomsnitt 29,5% (SEM = 1,2). To millioner larver blir oppdrettet hver uke for frigjøringsgenerasjonskolonien som produserer rundt 571 000 mannlige pupper (SEM = 14 000). Pupae og voksen dødelighet under fremveksten og frigjøringen er i gjennomsnitt 5%, noe som resulterer i ca 543,000 (SEM = 13,000) utgitt voksen mannlige mygg per uke. Det forventes at dagens produksjon på 4 millioner egg/uke kan reduseres til ~ 3 millioner / uke med ytterligere optimalisering for å redusere tap fra svet og lagring. Totalt er det behov for 6 ansatte for den beskrevne produksjonen; fire arbeider med frigjøringsgenerering og de resterende to på eggkolonien.
Kvalitetskontroll
Kvalitetskontroll er viktig for å opprettholde kvaliteten på de voksne, effektiviteten av oppdrett, arbeidskraft og kostnader.
Transgen fenotype kontroll
For å verifisere RIDL genuttrykk utføres to kontroller, for det første for å sjekke uttrykk for fluorescensmarkør og for det andre for å sjekke uttrykk for RIDL-dødelighetstrekk i fravær av tetracyklin. Alle larver skal uttrykke fluorescerende markør. For å sjekke om fluorescerende markør uttrykkes som forventet, kontrolleres 2000 første instar larver under et Leica MZFLIII stereomikroskop med DsRed2-filter (Texas Red) for å avgjøre om noen ikke-påvirkende individer er til stede. Uten tetracyklin er RIDL-genet uttrykt, og vi forventer 3-4% overlevelse til voksne8. For å sjekke dette, er det satt opp en ekstra skuff for hver utløserparti uten tetracyklin. Den eneste forskjellen til normal oppdrett er at maten reduseres med 2/3 fra dag 6 fordi opphopning av overflødig mat på grunn av døde larver kan føre til overflødig bakterievekst.
Oppdrettskontroll
Fire skuffer fra utgivelsesgenerasjonen velges tilfeldig for å sorteres og telles separat. Antall mannlige og kvinnelige pupper registreres fra hver skuff hver dag (Figur 4). Eventuelle avvik fra forventet antall menn og kvinner indikerer et potensielt problem som kan påvirke produksjon og / eller kondisjon og kan sammenlignes med eggkolonien for å bidra til å bestemme kilden til problemer.
Pupae målinger
Pupae størrelse har vist seg å være korrelert med voksen størrelse28. Som en kvalitetskontroll for voksen størrelse måles cephalothoraxbredden på minst 30 mannlige pupper for hver sorteringsdag fra utgivelsesgenerasjonen; for eggproduksjonskolonien måles også kvinnelige pupper. Gjennomsnittlig cephalothoraxbredde var 1,05 mm (SEM 0,005) for frigjorte hanner og 1,04 mm (SEM = 0,006) og 1,29 mm (SEM = 0,006) for henholdsvis menn og kvinner Egg Production, Colony; lignende resultater ble oppnådd for Ae. albopictus masse oppdrett24.
Figur 1. Stadier av masseoppdrett mygg for bruk i et RIDL / SIT-program. Eggproduksjonskolonien har et høyt kvalitetskontroll for å sikre kvaliteten på eggene som leveres til utgivelsesgenerasjonen. Egg blir oppdrettet gjennom til pupper i frigjøringskolonien, hvor hannene sorteres fra hunnene. De mannlige voksne brukes deretter til RIDL-kontrollprogrammet.
Figur 2. Skjematisk for oppdrettsanlegget for produksjon av RIDL-hanner for et utgivelsesprogram. Egg av høy kvalitet produseres kontinuerlig i Egg Production Colony-rommet og blir deretter oppdrettet gjennom til pupper i Release Generation-rommet. Larvene og puppene blir deretter skilt og puppene kjønnssortert for menn. Hannene blir deretter plassert i utløserenheter og får lov til å modnes til voksne for frigjøring i voksenoppbevarings- og frigjøringsrommet.
Figur 3. Separere larver, mannlige pupper og kvinnelige pupper ved hjelp av en plateseparator26. Plateskilleren bruker størrelsesforskjellen mellom larver, mannlige pupper og kvinnelige pupper for å sortere disse tre forskjellige livsstadiene; larver har en tendens til å være mindre enn mannlige pupper som igjen er mindre enn kvinnelige pupper. Instrumentet består av to glassplater; den ene er festet til en skrå metallramme og den andre sitter på toppen av den første platen og kan flyttes i forhold til den første ved hjelp av fire justeringsskruer (A). De fire justeringsskruene gjør at den ytre platen kan stilles inn i en vinkel mot bakplaten, slik at det dannes et kileformet rom mellom platene, som avsmalner nedover. Larver og pupper helles mellom glassplatene (B) og vaskes forsiktig med en vannslange (C). Ved å justere vinkelen på platen, kan larver, mannlige pupper og kvinnelige pupper skilles (D). Med kontinuerlig spyling og økning av platevinkelen kan larvene skylles gjennom først (inn i en sikt), etterfulgt av den mannlige puppene og til slutt den kvinnelige puppene.
Figur 4. Pupering kurver for masse oppdrettet RIDL Ae. aegypti. Denne grafen viser den gjennomsnittlige prosentandelen av pupering for masseoppdrettet RIDL mannlig og kvinnelig pupper i løpet av 23 uker observasjon med ~ 135,000 puppene gjenvunnet per uke. Feilfelt = standardfeil av gjennomsnitt, n = 23. På den første samlingen (dag 8) gjenopprettet vi i gjennomsnitt 59% mannlige og 30% kvinnelige pupper fra total pupper gjenvunnet fra skuffer over 5 dager.
Figur 5. Gjennomsnittlig kvinnelig forurensning av sortert mannlig pupper. Denne grafen viser den månedlige gjennomsnittlige prosentandelen kvinnelig forurensning under mannlig sortering på dag 8 etter klekking over en seks måneders periode.
Figur 6. Aluminium plate blodmater system. Platen (B) er dekket med Parafilm (A) og blod pipettert i en lomme og deretter forseglet (D). Platen er plassert på et bur og oppvarmet ved å plassere en oppvarmet bønnepose (C) på toppen (E).
Figur 7. Distinguishing mann og kvinne Ae. aegypti pupper. Ae. aegypti pupper kan på en pålitelig måte kjønnes av forskjellene i kjønnslobeformen (på slutten av pupal abdominal segmenter like under padlene). I tillegg har menn også en tendens til å være mindre enn kvinner.
Tabell 1. Generelt fôringsregime for Ae. aegypti RIDL larver (mg mat per larve per dag). For å beregne faktisk mengde mat som kreves, multipliser med totalt antall larver per brett.
Discussion
RIDL er en effektiv og miljøsikker metode for å kontrollere mygg3,29-31. Teknikken gjelder for et integrert skadedyrshåndteringsprogram og de fleste nåværende kontrollmetoder, inkludert larvicider, reduksjon av avlssted og adulticider er kompatible med denne teknologien. Denne metoden beskriver hvordan du produserer opptil 570 000 RIDL mannlige pupper per uke for bruk i kontrollen av Ae. Aegypti og til vår kunnskap er dette den første beskrivelsen av produksjonen av transgene mygg på denne skalaen. Noen sammenlignbare produksjonssystemer ble utviklet for vill type Ae. aegypti på 1960- og 70-tallet25, men det har ikke vært noen sammenlignbar produksjon på denne skalaen siden den gang. I Brasil har rundt 11 millioner menn blitt løslatt fra februar 2011 til februar 2012. Antall menn som kreves for at et gitt område skal kontrolleres, avhenger av en rekke faktorer, inkludert størrelsen på vill befolkning, spredning av frigjorte menn, overlevelse og parring av menns konkurranseevne etter frigjøring og miljøforhold. Tidligere studier har vist at RIDL kan redusere en populasjon av mygg med minst 80%9.
En balanse er nødvendig mellom optimalisering av masseoppdrett for produksjonsskala og kostnad vs. kvalitet på menn. For eksempel kan økende larvtetthet øke produksjonskapasiteten ved å redusere plassen som kreves, arbeidskraft og tid til pupering32. For høye tettheter av larver kan imidlertid resultere i mindre og kortere levde menn med redusert parringskapasitet32,33. Kvalitet på menn i forhold til et SIT-program vil til slutt bli vurdert av evnen til frigjorte menn til å parre seg med kvinner i felt. Det kreves omfattende feltevaluering for å vurdere parring av konkurranseevnen i forhold til ville kolleger9,10. Dette gjør det ofte upraktisk å vurdere nøyaktig hvilke faktorer som gjør en "høy kvalitet" mannlig mygg. Det er imidlertid viktig å opprettholde konsistent produksjon og kvalitet (i den grad det rutinemessig kan evalueres) i storskala masseoppdrett. Dette krever et høyt nivå av årvåkenhet og standardisering av alle prosesser med små svingninger som potensielt har en betydelig innvirkning. Aliquoting av L1 larver er et kritisk skritt og illustrerer dette punktet. Aliquoting riktig antall larver i skuffer er avgjørende for god kvalitet produksjon. Fôringsregimet er nøyaktig skreddersydd for et bestemt antall larver. For få/mange larver vil resultere i over/under fôring, noe som påvirker larvaloverlevelse, størrelse på pupper og tid til pupering. Hvis det er en hemmelighet for kunsten masseoppdrett, er det å sikre at de mange små trinnene i produksjonssyklusen utføres konsekvent, presist og med et høyt nivå av kvalitetskontroll, som beskrevet i dette papiret.
Disclosures
Forfattere tilknyttet Oxitec har ansettelses- og/eller aksjeandel i Oxitec Ltd. Oxitec Ltd og Oxford University har immaterielle rettigheter knyttet til temaet i denne artikkelen.
Acknowledgments
Vi vil takke Biofábrica Moscamed Brasil, Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) og Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnologia (CNPq) for økonomisk støtte. Vi vil også takke følgende personer for deres hjelp; Miriam dos Santos, Gildeane Silva, Gessilane dos Santos, Fabio Gonçalves, John Paul Oliveira, Luiza Garziera, José Carlos Valença.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vipan Premium |
Sera GmbH | 190 |
http://www.sera.de/uk/pages/products/product/sera-vipan-3.html |
| Tetracycline |
Sigma Aldrich | T7660 |
|
| Plate separator |
J.W. Hock | 5412 |
http://www.johnwhock.com/download/manuals/instr_5412_separator.pdf |
| Parafilm M |
Pechiney Plastic packing | PM-996 |
|
| Rearing pans for Release generation (53 cm x 38 cm x 8 cm) |
Pleion | 0757 |
|
| Fluorescent scope |
Leica Microsystems | MZ FLIII |
http://www.leica-microsystems.com/fileadmin/downloads/Leica%20MZ%20FLIII/Brochures/M1-160-0de.pdf |
| Adult cages |
BugDorm | DP1000 |
http://bugdorm.megaview.com.tw/bugdorm-1-insect-rearing-cage-30x30x30-cm-pack-of-one-p-29.html |
| Filter paper |
CELAB |
References
- Dyck, V., et al. Sterilizing Insects with Ionizing Radiation. Sterile Insect Technique. , Springer. Netherlands. 233-268 (2005).
- Dyck, V., Hendrichs, J., Robinson, A. S., Klassen, W., Curtis, C. History of the Sterile Insect Technique.. Sterile Insect Technique. , Springer. Netherlands. 3-36 (2005).
- Alphey, L., et al. Sterile-insect methods for control of mosquito-borne diseases – an analysis. Vector Borne Zoonotic Dis. 10, 295-311 (2010).
- Thomas, D. D., Donnelly, C. A., Wood, R. J., Alphey, L. S. Insect population control using a dominant, repressible, lethal genetic system. Science. 287, 2474-2476 (2000).
- Fu, G., et al. Female-specific insect lethality engineered using alternative splicing. Nat. Biotechnol. 25, 353-357 (2007).
- Fu, G., et al. Female-specific flightless phenotype for mosquito control. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4550-4554 (2010).
- Gong, P., et al. A dominant lethal genetic system for autocidal control of the Mediterranean fruitfly. Nat. Biotechnol. 23, 453-456 (2005).
- Phuc, H. K., et al. Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control. BMC Biol. 5 (11), (2007).
- Harris, A. F., et al. Successful suppression of a field mosquito population by sustained release of engineered male mosquitoes. Nat. Biotechnol. 30, 828-830 (2012).
- Harris, A. F., et al. Field performance of engineered male mosquitoes. Nat. Biotechnol. 29, 1034-1037 (2011).
- Bailey, D. L., Lowe, R. E., Dame, D. A., Seawright, J. A. Mass rearing the genetically altered MACHO strain of Anopheles albimanus Wiedemann. Am. J. Trop. Med. Hyg. 29, 141-149 (1980).
- Benedict, M. Q., et al. Colonisation and mass rearing: learning from others. Malar. J.. 8 Suppl 2 (S4), (2009).
- Alphey, L. Re-engineering the sterile insect technique. Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1243-1247 (2002).
- Wise de Valdez,, R, M., et al. Genetic elimination of dengue vector mosquitoes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4772-4775 (2011).
- Macoris Mde,, L,, et al. Resistance of Aedes aegypti from the state of Sao Paulo, Brazil, to organophosphates insecticides. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 98, 703-708 (2003).
- Campos, J., Andrade, C. F. Larval susceptibility of Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus populations to chemical insecticides. Rev. Saude Publica. 37, 523-527 (2003).
- Gubler, D. J. Resurgent vector-borne diseases as a global health problem. Emerg. Infect. Dis. 4, 442-450 (1998).
- Harris, A. F., Rajatileka, S., Ranson, H. Pyrethroid resistance in Aedes aegypti from Grand Cayman. Am. J. Trop. Med. Hyg. 83, 277-284 (2010).
- Lima, J. B., et al. Resistance of Aedes aegypti to organophosphates in several municipalities in the State of Rio de Janeiro and Espirito Santo. Am. J. Trop. Med. Hyg. 68, Brazil. 329-333 (2003).
- Paris, M., et al. Persistence of Bacillus thuringiensis israelensis (Bti) in the environment induces resistance to multiple Bti toxins in mosquitoes. Pest Manag. Sci. 67, 122-128 (2010).
- Rendon, P., McInnis, D., Lance, D., Stewart, J. Medfly (Diptera: Tephritidae) genetic sexing: large-scale field comparison of males-only and bisexual sterile fly releases in Guatemala. J. Econ. Entomol. 97, 1547-1553 (2004).
- Papathanos, P. A., et al. Sex separation strategies: past experience and new approaches. Malar. J.. 8 Suppl 2 (S5), (2009).
- Medici, A., et al. Studies on Aedes albopictus larval mass-rearing optimization. J. Econ. Entomol. 104, 266-273 (2011).
- Focks, D. A. An improved separator for the developmental stages, sexes and species of mosquito (Diptera Culicidae). J. Med. Entomol. 17, 567-568 (1980).
- Fay, R. W., McCray, E. M., Kilpatrick, J. W. Mass production of sterilized male Aedes aegypti. Mosquito News. 23, 210-214 (1963).
- Christophers, S. R. Aedes aegypti the yellow fever mosquito: Its life history, Bionomics and Structure. , Cambridge University Press. (2009).
- Jones, J. C. A simple method for sexing living Anopheles Larvae (diptera, culicidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 50, 104-106 (1957).
- Koenraadt, C. J. M. Pupal Dimensions as Predictors of Adult Size in Fitness Studies of Aedes aegypti (Diptera Culicidae). J. Med. Entomol. 45, 331-336 (2008).
- Alphey, L., Nimmo, D., O'Connell, S., Alphey, N. Insect population suppression using engineered insects. Adv. Exp. Med. Biol. 627, 93-103 (2008).
- Alphey, N., Bonsall, M. B., Alphey, L. Modeling resistance to genetic control of insects. J. Theor. Biol. 270, 42-55 (2011).
- Atkinson, M. P., et al. Analyzing the control of mosquito-borne diseases by a dominant lethal genetic system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 9540-9545 (2007).
- Bargielowski, I., Nimmo, D., Alphey, L., Koella, J. C. Comparison of life history characteristics of the genetically modified OX513A line and a wild type strain of Aedes aegypti. PLoS One. 6 (e20699), (2011).
- Bargielowski, I., Alphey, L., Koella, J. C. Cost of mating and insemination capacity of a genetically modified mosquito Aedes aegypti OX513A compared to its wild type counterpart. PLoS One. 6 (26086), (2011).
