A Análise de Purkinje Morfologia de células dendríticas em Culturas fatia organotípicas

Summary

Apresenta-se um protocolo que permite visualizar e para avaliar quantitativamente a morfologia da árvore dendrítico das células de Purkinje individuais crescidas em culturas organotípicas do cerebelo. Este protocolo destina-se a promover estudos sobre os mecanismos de Purkinje desenvolvimento de células dendríticas.

Abstract

As células de Purkinje são um sistema de modelo atractivo para estudar o desenvolvimento dendrítico, porque têm uma árvore dendrítica impressionante, que é estritamente orientadas no plano sagital e desenvolve principalmente no período pós-natal, em pequenos roedores ^3. Além disso, os anticorpos que estão disponíveis várias células de etiquetas selectiva e intensa de Purkinje, incluindo todos os processos, com anti-calbindina D28K sendo a mais amplamente utilizada. Para visualização dos dendritos em células vivas, os camundongos que expressam EGFP seletivamente nas células de Purkinje ¹¹ estão disponíveis através Jackson laboratórios. Organotípicas culturas de células cerebelares fatia permitir a manipulação experimental fácil de Purkinje desenvolvimento de células dendríticas, porque a maior parte da expansão da árvore dendrítica de células dendríticas Purkinje realmente está ocorrendo durante o período de cultivo ^4. Apresentamos aqui um protocolo curto, confiável e fácil de visualizar e analisar a morfologia dendrítica de células de Purkinje crescido em organotypic cerebelares culturas fatia. Para muitos fins, uma avaliação quantitativa da árvore dendrítica célula de Purkinje é desejável. Nós nos focamos em dois parâmetros, o tamanho da árvore dendrítica e números de ponto de desvio, que pode ser rápida e facilmente determinados a partir de anti-calbindina manchadas culturas fatia do cerebelo. Estes dois parâmetros produzir uma medida fiável e sensível de mudanças da árvore de Purkinje de células dendríticas. Utilizando o exemplo de tratamentos com a proteína-quinase C (PKC) e PMA activador do receptor de glutamato metabotrópicos 1 (mGluR1) é mostrado como as diferenças no desenvolvimento dendríticas são visualizadas e quantitativamente avaliados. A combinação de a presença de uma árvore dendrítica extensa, métodos selectivos e imunorreatividade intensa, as culturas organotípicas de fatias que cobrem o período de crescimento dendrítico e um modelo de rato com Purkinje expressão EGFP célula específica tornar as células de Purkinje de um sistema poderoso modelo para revelar os mecanismos de dendritic desenvolvimento.

Protocol

1. Criação de culturas organotípicas cerebelo

Cultura de lâminas cerebelares são preparadas a partir de 8 dias pós-natal filhotes P (8) do rato utilizando o método de incubação estática ^10. Em nosso laboratório, nós usamos B6CF1 ratos. Em algumas experiências ratinhos transgénicos também foram utilizadas as quais expressam EGFP selectivamente nas células de Purkinje. A preparação de culturas fatia demora cerca de 30 minutos por rato filhote, ou seja, 3 horas para uma ninhada de seis filhotes de rato. Todos os passos são realizados sob condições estéreis em uma bancada de fluxo laminar, com instrumentos cirúrgicos esterilizados.

1. O cerebelo do rato pups P8 é dissecado do cérebro em meio arrefecido com gelo preparação (MEM (Gibco catálogo No. 11012) com glutamax 1:100, pH 7,3), utilizando-se um estereomicroscópio.
2. O cerebelo é cortada em fatias grossas 350 mM na orientação sagital usando um cortador de tecidos McIlwain.
3. As fatias são colocadas em pastilhas de células de cultura (Millipore approx.6 fatias por pastilha, Millipore PICM03050) e são incubadas em placas de 6 poços com 0,75 ml por cavidade de meio de incubação (48,35 ml de MEM, 25 ml de Eagle Medium, 25 ml de soro de cavalo, 1 ml glutamax I, 0,65 ml de uma de glicose estéril a 10% pH da solução, 7,3), numa atmosfera humidificada com _5% de CO2 a 37 ° C. Todos os reagentes de cultura de tecidos foram da Gibco, Invitrogen.
4. Os tratamentos farmacológicos são tipicamente iniciado aos 3 dias in vitro (DIV3) pela adição do fármaco na concentração desejada ao meio de cultura. Forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) e ácido (RS) -3,5-di-hidroxifenilglicina (DHPG) eram de Tocris, RU. Uma vez que muitas drogas requer o uso de DMSO ou etanol para preparar uma solução-mãe (por exemplo, PMA), deve ser tomado cuidado de que a quantidade total de solvente adicionado ao meio de cultura não exceda 1% (7,5 uL por poço). As drogas são renovadas em conjunto com a mudança do meio de cultura a cada 2 ou 3 dias ^{nd rd.}

2. Fixação e Immunoscontendo de culturas organotípicas cerebelo

Uma vantagem importante do cerebelo é que os anticorpos que especificamente são disponíveis e brilhantemente a mancha os neurónios cerebelares principais, ou seja, células de Purkinje e as células granulares. A morfologia dendrítica de células de Purkinje pode ser revelado por imunocoloração com anti-calbindina D28K.

1. Para a fixação das culturas, o meio de cultura é removido e 3 ml de paraformaldeído a 4% frio, em tampão fosfato 0,1 M (pH 7,4) são adicionados cuidadosamente por poço contendo o inserto Millicell com as fatias cerebelares ligadas à membrana. Culturas são fixadas durante a noite, em seguida, o fixador é removido e as culturas são lavadas com tampão de fosfato.
2. Para imunocoloração os anticorpos seguintes são usadas: de coelho anti-calbindina D-28K (Swant, Bellinzona, Suíça) a 1:1000 para visualizar selectivamente células de Purkinje e monoclonal anti-NeuN (Chemicon, Millipore) a 1:500 para visualizar selectivamente granucélulas le ^12. Coelho anti-GFP foi de Abcam, UK. Anticorpos secundários fluorescentes Alexa eram de Molecular Probes, Invitrogen.
3. As culturas são permeabilizadas e bloqueada pela adição de soro de cabra normal, 3% + 0,3% de TritonX100 em tampão fosfato 0,1 M (solução bloqueadora). Anti-calbindina D28K e anti-NeuN são diluídas em solução de bloqueio e as culturas são incubadas com a solução de bloqueio contendo os anticorpos durante a noite a 4 ° C sob agitação ligeira. Todas as diluições são indicadas em% (v / v), Triton X-100 é tomada a partir de uma solução mãe a 10%, a fim de facilitar a pipetagem.
4. As culturas são lavadas 3x com tampão de fosfato 0,1 M e são, então, incubadas com anticorpos secundários apropriados, por exemplo, anticorpo de cabra anti-coelho Alexa 568 e de cabra anti-rato Alexa 488 diluído a 1:500 em tampão fosfato 0,1 M + 0,1% de TritonX100 durante 2 horas a temperatura ambiente. As culturas são então lavadas 3x com tampão de fosfato 0,1 M.
5. As fatias coradas são removidas a partir da culturabem com um pincel e são montadas em lâminas de vidro, mais Superfrost e lamela com um meio de montagem adequado, como por exemplo Mowiol. As culturas podem agora ser vistos em um microscópio comum com equipamentos de epifluorescência ou com um microscópio confocal.

3. Vendo de Células de Purkinje individuais em culturas fatia organotípicas

1. Depois de imunocoloração com calbindina D28k citoplasma completa das células de Purkinje é brilhantemente manchadas incluindo os dendritos e axônio. Devido ao alinhamento denso de células de Purkinje na camada de células de Purkinje, os mandris dendríticas da maioria das células de Purkinje são sobrepostas tornando-o difícil de estudar o mandril completa de uma célula individual. No entanto, devido a morte celular de algumas células de Purkinje, durante o processo de preparação, em muitas culturas algumas áreas estão presentes com uma densidade reduzida das células de Purkinje. Em tais áreas, é possível encontrar as células de Purkinje com um mandril dendrítica completo, que não se sobrepõem a outros cells. Nestas células, o mandril dendríticas podem ser visualizados e analisados ​​com uma qualidade comparável a uma coloração de Golgi. Porque no cerebelo as células de Purkinje são o tipo de célula que expressa apenas calbindina D28K as células são também identificadas como células de Purkinje.
2. Um método alternativo é a utilização de culturas derivadas de B6; FVB-Tg (Pcp2-EGFP) 146.244Yuza / J mice (aqui chamado Pcp2-EGFP ratos, disponível a partir de Jackson Laboratories) que expressam EGFP sob a célula de Purkinje promotor L7 específico ^11. Em cultura de lâminas tais células vivas de Purkinje podem ser visualizadas por expressão de EGFP. É também possível seguir a morfologia dendrítica de uma única célula ao longo do tempo. Alternativamente, após a fixação, as células que expressam EGFP-Purkinje podem ser imunocoradas com um anticorpo anti-GFP. Ambos os métodos são adequados para a coloração de dendritos, corpos celulares e axónios de células de Purkinje em culturas organotípicas. Porque o promotor L7 nos ratos Pcp2-EGFP não é expresso em todas as células de Purkinje e existem variations na frequência de células que expressam de Purkinje no ratinho (Kapfhammer, dados não mostrados) cortar as culturas derivadas destes ratinhos tornar mais fácil visualizar e medir células de Purkinje, que têm árvores dendriticas que se sobrepõem com outras árvores dendriticas das células de Purkinje. Árvores dendriticas possam ser vistas individualmente, quando as células de Purkinje adjacentes com sobreposição de árvores dendriticas não expressam GFP (Figura 1A, B).

4. Medição de Purkinje tamanho da árvore de células dendríticas e pontos de ramificação

1. Tamanho da árvore dendrítica. Com a marcação fluorescente de células de Purkinje do tamanho da árvore dendrítica de uma dada célula pode ser facilmente medido se a árvore não se sobrepõe com outras células. Uma vez que as etiquetas calbindina imunorreatividade todas as células de Purkinje, que pode ser difícil de identificar células com não-sobreposição árvores dendriticas. Neste caso, a utilização do Pcp2-EGFP é recomendado para simplificar a identificação das células de Purkinje suficientes com que não se sobrepõem árvores dendríticas. Uma vez que uma célula de Purkinje com uma árvore sem sobreposição dendríticas é identificado, ele é visto com a lente de 20x e uma imagem é gravada com uma câmera digital. Essa imagem pode ser analisada com um programa de análise de imagem. Usamos Image Pro Plus, que permite traçar a árvore dendrítica da célula com um único clique do mouse usando a ferramenta varinha mágica no modo de medição (Figura 2A). O programa então calcula a área coberta pela árvore dendrítica e exporta para o MS Excel. A análise estatística dos dados é feita com o software GraphPad Prism (ver abaixo).
2. Número de pontos de ramificação. Devido à morfologia altamente ramificada e fina das células dendriticas Purkinje pontos de ramificação da árvore precisam ser contado manualmente. O arquivo de imagem de 20x das células de Purkinje é ampliada tal que cobre a maior parte da tela usando o Adobe Photoshop. Em seguida, cada ponto de ramificação é contado e marcado com um ponto brilhante (Figura 2B).

Monitorização do desenvolvimento da árvore de células dendríticas durante o período de Purkinje cultura
Culturas organotípicas de fatias derivados Pcp2-EGFP ratinhos que expressam EGFP especificamente em células de Purkinje permitem estudar a morfologia das células individuais durante vários dias em cultura. Deste modo, o crescimento e desenvolvimento da árvore dendrítica durante o período de cultura pode ser muito bem documentada. Vivendo células identificadas Purkinje foram fotografados todos os dias ^rd 2 ^ª ou 3 durante o período de cultura, com o objetivo de 10x. Este objectivo poder baixa foi escolhida para evitar e minimizar os danos para as células de fototoxicidade devido à iluminação com luz fluorescente. Figura 3 mostra dois exemplos de células de Purkinje fotografadas em culturas vivas. A primeira célula foi seguido de 2 dias in vitro até 7 dias in vitro (Figura 3, AC). É evidente que o dendritic árvore da célula durante este período de tempo se vários novos ramos e se expande em tamanho. No segundo exemplo, uma célula de Purkinje foi seguido 4-11 dias in vitro (Figura 3, DF). A árvore dendrítica pequeno presente em DIV4 expande substancialmente durante este período de tempo. Ambos os exemplos demonstram que a maior parte da árvore dendrítico das células de Purkinje apresentam no final do período de cultura, de fato, desenvolver-se na cultura.

Desenvolvimento da árvore Purkinje célula dendrítica é inibida por PKC ou mGluR1 estimulação
Culturas organotípicas do cerebelo foram cultivadas durante 11 dias. Começando no dia 2 ^ª in vitro, algumas das culturas foram tratadas com PMA (50 nM), um éster de forbol estimulante PKC ou DHPG (10 uM), um agonista do mGluR1, até que as culturas foram fixadas. Ambos os compostos foram mostrados anteriormente para inibir e limitar o crescimento de células dendríticas Purkinje ^{7, 8, 9, 5.}No controlo não tratado de células de Purkinje fatias desenvolvido uma grande árvore e altamente ramificado dendrítica típica que foi visualizada quer por anti-calbindina imunomarcação (Figura 4A), ou em culturas com células expressando EGFP Purkinje, por imunocoloração com anti-GFP (Figura 4D). Em culturas tratadas com PMA a morfologia da árvore dendrítica alterou-se profundamente. Os dendritos apareceu espessada e tinha apenas poucos ramos laterais curtos. Muitas células de Purkinje, ao contrário das culturas de controlo, não eram mais unipolar, com um dendrito primário que emana do corpo da célula, mas desenvolveu dois ou mesmo mais dendrites primárias (Figura 4B, E). O território abrangido pela árvore dendrítica foi marcadamente reduzida (ver abaixo). Uma situação semelhante estava presente em culturas tratadas com DHPG. A árvore dendrítico das células de Purkinje foi grandemente reduzida em tamanho e a ramificação foi marcadamente reduzida (Figura 4C, F). No entanto, houve também alguns qualitative diferenças em comparação com culturas tratadas com PMA. Não houve aumento da espessura das ramificações dendríticas, e as dendrites primárias realizadas muitas dendrites secundários muito curtos (Figura 4C, F), sugerindo que os eventos de sinalização acontecendo em PMA e células de Purkinje DHPG-tratados podem ser similares, mas não idênticas.

A avaliação quantitativa de Purkinje tamanho da árvore de células dendríticas e os pontos de ramificação para avaliação quantitativa, o tamanho da célula de Purkinje árvore dendrítica e o número de pontos de ramificação por célula de Purkinje é medido como descrito acima. Os resultados de pelo menos três experiências independentes são agrupados juntos, e um mínimo de 20 células necessitam de ser analisados. A média da área coberta pelas árvores dendríticas para as experiências de controlo, é determinada e estabelecida como 100%, e os valores para as outras experiências são expressos como valores de percentagem em conformidade. A análise estatística dos dados é feita com o software GraphPad Prism. Porque não fazerassumir que todos os valores determinados são parte de uma distribuição de Gauss, usamos testes estatísticos que não assumem tal distribuição dos valores medidos. Para comparar as condições de múltiplas e teste de significância estatística, usamos Kruskal-Wallis seguido de um procedimento adequado para testes post hoc para classificação baseados em estatísticas, como, por exemplo, implementado em teste de Dunn post no GraphPad Prism. Os resultados são normalmente apresentados como gráficos de barras. Um exemplo deste tipo de avaliação uma estatística é dada na Figura 5. Tanto a análise do tamanho da árvore dendrítica (Figura 5A) e o número de pontos de ramificação por célula de Purkinje (Figura 5B) mostram diferenças evidentes entre a condição de controle e tratamento DHPG ou PMA. Ambos os parâmetros foram diferentes, com uma significância estatística de p <0,001 de acordo com o teste de Kruskal-Wallis.

Figure 1. EGFP-rotulados células de Purkinje. Em Pcp2-EGFP ratos não todas as células de Purkinje expressa EGFP. Portanto, as árvores dendriticas das células de Purkinje algumas podem ser vistas individualmente, quando eles expressam EGFP (EGFP canal em A) e as células de Purkinje adjacentes com sobreposição de árvores dendriticas não (negativa no canal de EGFP mostrado em A, positivo na coloração anti-calbindina mostrado no canal de vermelho em B). Barra de escala = 50 um.

A Figura 2. Medição dos parâmetros dendríticos de células de Purkinje. (A). O tamanho da árvore dendrítica pode ser facilmente medida, traçando o contorno da célula de Purkinje com um único clique do mouse na imagem Image Pro software de análise mais usando a ferramenta varinha mágica. A ferramenta varinha mágica é usada de tal forma que a árvore dendrítica inteiro, incluindo a soma das células e todos os ramos dendríticas são completamente cercada pela linha. (B). O número de pontos de ramificação é counted manualmente em imagens de células de Purkinje. Cada ponto de ramificação é marcado com um ponto amarelo. Barra de escala = 50 um.

Figura 3. Acompanhamento do desenvolvimento da árvore Purkinje célula dendrítica. Células de Purkinje foram fotografados Identificados repetidamente para monitorizar o crescimento da árvore dendrítica. (AC): árvore dendrítica de uma célula de Purkinje crescimento e desenvolvimento desde o primeiro dia in vitro (DIV) 2 até DIV7. Há um crescimento contínuo e ramificação dos dendritos durante este período de cultura. (DF): árvore dendrítica de uma célula Purkinje crescimento e desenvolvimento de DIV4 até DIV11. A árvore dendrítica expande substancialmente durante o período de cultura. Barra de escala = 50 um.

Figura 4. Desenvolvimento da árvore Purkinje célula dendrítica é inibida por PKC ou stimulati mGluR1em (A), (D):. células de controlo não tratadas com uma árvore dendrítica bem desenvolvida. (B), (E): Depois de 9 dias de tratamento com PMA dendrites aparecer espessada e a árvore dendrítica é fortemente reduzido em tamanho. Células muitas vezes perdem a sua polarização e tornar-se bipolar (E). (C), (F): Depois de 9 dias de tratamento DHPG a árvore dendrítica é grandemente reduzida em tamanho. Ao contrário do tratamento PMA, muitos ramos laterais muito finas e curtas estão presentes nas dendrites primárias e secundárias. Células muitas vezes perdem a sua polarização e tornar-se bipolar (F). As células de Purkinje foram visualizadas por imunocoloração anti-calbindina em (A - C) e por EGFP-expressão em culturas derivadas de Pcp2-EGFP em ratos (D - F). Barra de escala = 50 um.

Figura 5. Avaliação quantitativa de Purkinje tamanho da árvore de células dendríticas e ramificação. Medições quantitativas mostram que tanto o tamanho da árvore dendrítica (gráfico barra superior) e do number de pontos de ramificação (gráfico inferior bar) são muito reduzidos após o tratamento de PMA ou DHPG. As diferenças entre as árvores de controlo dendríticas e árvores dendriticas das células de Purkinje de culturas tratadas foram significativas com p <0,001.

Discussion

Os métodos aqui apresentados permitem estudar Purkinje desenvolvimento de células dendríticas em culturas organotípicas do cerebelo e avaliar quantitativamente a expansão de células dendríticas Purkinje, medindo o tamanho da árvore dendrítica e o número de pontos de ramificação dendríticas. Naturalmente, uma análise mais completa e quantitativas sofisticadas de dendrites de células de Purkinje é possível, por exemplo, através da determinação comprimento dendrítico total, realizando uma análise de Sholl ou determinação da dimensão fractal da árvore dendrítica. Para este tipo de análise é geralmente necessária para rastrear manualmente a totalidade Purkinje árvore de células dendríticas em um programa de análise, como por exemplo Neuro-Lucida. Embora estes métodos mais refinados certamente produzir um nível superior de análise (por exemplo, ver ^{1, 6),} que são mais demorado e requer equipamento mais especializado e software de análise em comparação com os métodos aqui apresentados. Para a maioria das aplicações, particularmente em situações em que as alteraçõesnos dendritos das células de Purkinje são consideráveis ​​e qualitativamente visível, os métodos simples foram apresentadas serão suficientes. Deve notar-se que as culturas organotípicas cerebelares derivadas de ratinhos P8 vai cobrir apenas a fase posterior de desenvolvimento de células dendríticas Purkinje caracterizada pela expansão rápida dendrítica. Para o estudo das fases anteriores, o método de cultura fatia necessita de ser adaptado para as fatias de animais recém-nascidos ou embrionárias que então irá abranger as fases iniciais do desenvolvimento dendrítico (por exemplo ^2).

Para a visualização de células de Purkinje em culturas organotípicas do cerebelo, temos focado apenas em dois métodos de rotina: a imunorreatividade anti-calbindina e a utilização de ratinhos com células expressando EGFP Purkinje. É claro que os métodos mais estão disponíveis, por transfecção ou biolística viral específica com as proteínas fluorescentes de rotulagem diolistic com corantes fluorescentes e intracelulares injecções de corantes em células isoladas de Purkinje. Dependendo dos requisitos do estudo e do equipamento disponível no laboratório destes métodos pode melhorar significativamente o nível de análise de Purkinje morfologia dendrítica de células, por exemplo através da análise de espinhas dendríticas usando microscopia confocal ou dois fotões.