浦肯野细胞树突形态的器官切片培养分析
Summary
我们提出了一个协议，允许查看和定量驴个别浦肯野细胞的树突树的生长在器官小脑切片文化形态。该协议的目的是促进研究的浦肯野细胞树突发育的机制。
Abstract
浦肯野细胞是一个有吸引力的模型系统，研究树突状发展，因为他们有一个令人印象深刻的树突状树是严格面向在矢状面和发展主要是在产后期在小型啮齿动物3。此外，几种抗体可用选择性和集中标签包括所有进程的浦肯野细胞，用抗钙结合蛋白Calbindin D28K被最广泛使用的。活细胞的树突观看，都可以通过杰克逊实验室小鼠表达绿色荧光蛋白选择性地在浦肯野细胞11。器官小脑片培养细胞可以轻松的浦肯野细胞树突发育的实验操作，因为大多数的浦肯野细胞树突树的树突状扩张过程中实际发生的培养周期4。我们在座的短，可靠和简单的协议，用于观察和分析浦肯野细胞的树突状形态，生长在organotypiÇ小脑切片文化。出于多种目的，定量评价的浦肯野细胞树突状树是可取的。我们关注两个参数，树突树的大小和分支点的电话号码，可以快速，轻松地确定反小脑钙结合蛋白染色切片文化。这两个参数产生变化的浦肯野细胞树突状树一个可靠的和敏感的措施。使用的例子，治疗与蛋白激酶C（PKC）激活剂PMA和代谢型谷氨酸受体1（mGluR1的），我们演示了如何在树突发育的差异可视化和定量评估。的存在下的结合，一个广泛的树突状树，选择性和强烈的免疫染色的方法，覆盖的枝晶生长期间和小鼠模型的浦肯野细胞的特定的EGFP表达，使树突状揭示的机制的浦肯野细胞的强大的模型系统的器官型切片培养发展。
Protocol
1。建立器官小脑切片培养出生后小脑切片文化准备从8 P（8）鼠标幼崽使用静态培养方法10。在我们的实验室中，我们使用B6CF1小鼠。在一些实验中也转基因小鼠，用于表达EGFP的浦肯野细胞的选择性。编制片文化需要大约30分钟，每鼠标的小狗，也就是3个小时的一窝6小鼠的幼崽。所有步骤都是在无菌条件下在层流工作台与消毒的外科手术器械进行。 P8鼠标幼?…
Discussion
这里介绍的方法允许研究器官小脑切片培养和浦肯野细胞的树突状发展，定量地评价测定树突状树的尺寸和数目的树突状分支点的浦肯野细胞的树突状扩展。当然，一个更广泛，更复杂的定量分析，浦肯野细胞树突是可能的，例如，通过测定总树突长度，执行一个Sholl的分析，确定分形维数的树突状树。对于这种类型的分析，它通常需要手动跟踪整个树的分析程序，例如神经龙力浦肯野细胞树突?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了巴塞尔大学生物医学系和瑞士国家科学基金会（31003A-116624）。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Tissue culture Inserts | Millipore | PICM 03050 PICM ORG50 | The PICMORG50 inserts have a low rim and allow viewing of live cultures at a microscope |
| MEM | Gibco, Invitrogen | 11012044 | |
| Glutamax 1 | Gibco, Invitrogen | 35050038 | |
| Basal Medum Eagle | Gibco, Invitrogen | 41010026 | |
| Horse serum | Gibco, Invitrogen | 26050070 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Tocris | 1201 | |
| (RS)-3,5-Dihydroxy-phenylglycine (DHPG) | Tocris | 0342 | |
| Rabbit anti-calbindin D-28K | Swant | CB38 | |
| Anti NeuN, clone A60 | Chemicon, Millipore | MAB377 | |
| Rabbit anti-GFP | Abcam | Ab290 |
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Purkinje CellDendritic MorphologyOrganotypic Slice CulturesSagittal PlanePostnatal PeriodAnti-Calbindin D28KEGFPJackson LabsCerebellar Slice CulturesDendritic DevelopmentDendritic ExpansionQuantitative EvaluationDendritic Tree SizeBranch Point NumbersAnti-calbindin StainedProtein Kinase C (PKC) Acti
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Kapfhammer, J. P., Gugger, O. S. The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures. J. Vis. Exp. (61), e3637, doi:10.3791/3637 (2012).