Analysen av Purkinje Cell Dendritic Morfologi i Organotypiska slice kulturer

Summary

Vi presenterar ett protokoll som gör det möjligt att visa och för att kvantitativt bedöma morfologi av den dendritiska träd individuella Purkinje celler odlade i organotypiska cerebellära slice kulturer. Detta protokoll är avsett att främja studier av mekanismerna för Purkinje celler dendritiska utveckling.

Abstract

Purkinje celler är ett attraktivt modellsystem för att studera dendritiska utveckling, eftersom de har en imponerande dendritiska träd som är strikt orienterad i sagittalplanet och utvecklar främst i den postnatala perioden i små gnagare ^3. Dessutom flera antikroppar som selektivt och intensivt etikett Purkinje celler inklusive alla processer, med anti-kalbindin D28K är den mest använda. För visning av dendriter i levande celler, möss som uttrycker EGFP selektivt i Purkinje celler ¹¹ är tillgängliga via Jackson Labs. Organotypic cerebellära slice kulturer celler möjliggör enkel experimentell manipulation av Purkinje celler dendritiska utveckling eftersom de flesta av dendritiska expansion av Purkinje celler dendritiska träd faktiskt sker under odlingsperioden ^4. Vi presenterar här en kort, pålitlig och lätt protokoll för att visa och analysera den dendritiska morfologi Purkinje celler odlas i organotypic cerebellära slice kulturer. För många ändamål är en kvantitativ utvärdering av Purkinje celler dendritiska träd önskvärt. Vi fokuserar här på två parametrar, dendritiska träd storlek och filial nummer punkt, som kan snabbt och enkelt bestämmas från anti-kalbindin färgade cerebellära slice kulturer. Dessa två parametrar ger ett tillförlitligt och känsligt mått på förändringar av Purkinje cellens dendritisk träd. Använda exempel behandlingar med proteinkinas C (PKC) aktivator PMA och den metabotropiska glutamatreceptor 1 (mGluR1) visar vi hur skillnader i dendritiska utveckling visualiseras och kvantitativt utvärderas. Kombinationen av närvaron av en omfattande dendritiska träd, selektiva och intensiva metoder immunofärgning, organotypiska kulturer skiva som täcker perioden av dendritiska tillväxt och en musmodell med Purkinje cellspecifik EGFP uttryck gör Purkinje celler en kraftfull modellsystem för att avslöja mekanismerna för dendritiska utveckling.

Protocol

1. Ställa in Organotypiska cerebellär slice kulturer

Cerebellära slice kulturer framställs av postnatal dag 8 P (8) mus valpar med den statiska inkubationstiden metoden ^10. I vårt laboratorium använder vi B6CF1 möss. I vissa experiment också transgena möss användes som uttrycker EGFP selektivt i Purkinje-celler. Beredningen av slice kulturer tar cirka 30 minuter per mus valp, dvs 3 timmar för en kull på 6 mus ungar. Alla steg utförs under sterila förhållanden i ett laminärt flöde arbetsbänk med steriliserade kirurgiska instrument.

1. Lillhjärnan av P8 mus ungar dissekeras från hjärnan i iskall preparat medium (MEM (Gibco katalog nr 11.012) med glutamax 1:100, pH 7,3) med användning av ett stereomikroskop.
2. Lillhjärnan skärs i 350 nm tjocka skivor i sagittala riktningen med hjälp av en McIlwain vävnad helikopter.
3. Skivorna placeras på Millipore inlägg cellodling (approx.6 skivas per skär, Millipore PICM03050) och inkuberas i 6-brunnsplattor med 0,75 ml per brunn av inkubationsmedium (48,35 ml MEM, 25 ml Eagle-medium, 25 ml hästserum, 1 ml glutamax I 0,65 ml av en steril 10% glukos lösning, pH 7,3) i en fuktad atmosfär med 5% CO ₂ vid 37 ° C. Alla vävnadsodling reagenser var från Gibco, Invitrogen.
4. Farmakologiska behandlingar typiskt började vid 3 dagar in vitro (DIV3) genom att tillsätta läkemedlet i den önskade koncentrationen till odlingsmediet. Forbol 12-myristat 13-acetat (PMA) och (RS) -3,5-Dihydroxyphenylglycine (DHPG) var från Tocris, Storbritannien. Eftersom många läkemedel kräver användning av DMSO eller etanol för framställning av en stamlösning (t.ex. PMA) försiktighet bör iakttas att den totala mängden lösningsmedel tillsätts till odlingsmediet inte överskrider 1% (7,5 | il per brunn). Läkemedlen förnyas tillsammans med förändring av odlingsmediet varje ^{2: a} eller 3: ^e dag.

2. Fixering och Immunoslande av Organotypiska cerebellar slice kulturer

En viktig fördel av lillhjärnan är att antikroppar finns tillgängliga som specifikt och starkt färga huvudsakliga cerebellära neuroner, dvs Purkinje-celler och celler granule. Den dendritiska morfologi Purkinje-celler kan avslöjas genom immunfärgning med anti-kalbindin D28K.

1. För fixering av kulturerna, är odlingsmediet avlägsnades och 3 ml kall 4% paraformaldehyd i 0,1 M fosfatbuffert (pH 7,4) tillsätts försiktigt per brunn innehållande Millicell insatsen med de cerebellära skivorna fästa till membranet. Odlingar fastställs över natten, varefter fixativet avlägsnas och kulturerna sköljs med fosfatbuffert.
2. För immunfärgning följande antikroppar användes: kanin-anti-kalbindin D-28K (Swant, Bellinzona, Schweiz) vid 1:1000 för att selektivt visualisera Purkinje-celler och monoklonal anti-Neun (Chemicon, Millipore) vid 1:500 för att selektivt visualisera granulatle celler ^12. Kanin anti-GFP var från Abcam, Storbritannien. Fluorescerande sekundära Alexa antikroppar var från Molecular Probes, Invitrogen.
3. Kulturerna permeabiliseras och blockeras genom tillsats av 3% normalt getserum + 0,3% TritonX100 i 0,1 M fosfatbuffert (blockerande lösning). Anti-kalbindin D28K och anti-NeuN späds i blockeringslösning och kulturerna inkuberas med den blockerande lösningen innehållande antikropparna över natten vid 4 ° C under lätt omröring. Alla spädningar anges som% (volym / volym), är Triton X100 tas från en 10% stamlösning för att underlätta pipettering.
4. Kulturerna sköljs 3x med 0,1 M fosfatbuffert och inkuberades sedan med lämpliga andra antikroppar, t ex get-anti-kanin-Alexa 568 och get-anti-mus-Alexa 488 utspädd 1:500 i 0,1 M fosfatbuffert + 0,1% TritonX100 under 2 timmar vid rumstemperatur. Kulturerna sköljdes sedan 3x med 0,1 M fosfatbuffert.
5. De färgade skivorna avlägsnas från kulturenväl med en pensel och är monterade på SuperFrost samt objektglas glas och täckglas med ett lämpligt monteringsmedel, t.ex. Mowiol. Kulturerna kan nu ses på en vanlig mikroskop med epifluorescens utrustning eller med en konfokalmikroskop.

3. Visning av individuella Purkinje celler i Organotypiska slice kulturer

1. Efter immunfärgning med kalbindin D28k hela cytoplasman i Purkinje celler ljust färgade inklusive dendriter och axon. På grund av den täta anpassningen av Purkinje celler i Purkinje cellskiktet, de dendritiska hållare flesta Purkinje-celler överlappande gör det svårt att studera hela spindeln av en individuell cell. Emellertid, på grund av celldöd av vissa Purkinje-celler under framställningsprocessen, i många kulturer vissa områden är närvarande med en reducerad densitet av Purkinje-celler. I sådana områden är det möjligt att hitta Purkinje celler med en komplett dendritisk berså som inte överlappar med andra calnar. I dessa celler kan den dendritiska berså ses och analyseras i en kvalitet som är jämförbar med en Golgi färgning. För i lillhjärnan de Purkinje celler är den enda celltyp som uttrycker kalbindin D28K cellerna också identifieras som Purkinje celler.
2. En alternativ metod är att använda kulturer härledda från B6, FVB-Tg (Pcp2-EGFP) 146.244Yuza / J-möss (här kallad Pcp2-EGFP möss, tillgänglig från Jackson Laboratories) som uttrycker EGFP under Purkinje cellspecifika promotor L7 ^11. I sådana slice kulturer levande Purkinje-celler kan visualiseras genom uttryck av EGFP. Det är också möjligt att följa den dendritiska morfologin hos en enda cell över tiden. Alternativt, efter fixering, kan EGFP-uttryckande Purkinje celler immunfärgades med en anti-GFP-antikropp. Båda metoderna är lämpliga för färgning dendriter, cellkroppar och axoner av Purkinje-celler i organotypiska kulturer. Eftersom L7-promotorn i Pcp2-EGFP möss inte uttrycks i varje Purkinje cell och det är variations i frekvensen av uttryckande Purkinje-celler mellan mus (Kapfhammer, data ej visade) skär kulturer härledda från dessa möss gör det lättare att visualisera och mäta Purkinje-celler, som har dendritiska träd som överlappar med andra Purkinje träd cell dendritiska. Sådana dendritiska träd kan ses individuellt när de angränsande Purkinje cellerna med överlappande dendritiska träd inte uttrycker GFP (figur 1A, B).

4. Mätning av Purkinje Cell Dendritic Tree storlek och förgreningar

1. Dendritiska träd storlek. Med det fluorescerande märkning av Purkinje-celler storleken på den dendritiska träd av en given cell kan enkelt mätas om trädet inte överlappar med andra celler. Eftersom kalbindin immunfärgning etiketterna alla Purkinje-celler, kan det vara svårt att identifiera celler med icke-överlappande dendritiska träd. I detta fall användningen av Pcp2-EGFP rekommenderas att förenkla identifiering av tillräcklig Purkinje cellss med icke-överlappande dendritiska träd. När en Purkinje cell med en icke-överlappande dendritiska träd identifieras, visas den med 20x objektiv och en bild spelas in med en digital kamera. Denna bild kan sedan analyseras med ett bildanalysprogram. Vi använder Image Pro Plus, som gör det möjligt beskriver den dendritiska träd cellen med ett enda musklick med hjälp av trollstaven i mätläge (Figur 2A). Programmet beräknar därefter det område som omfattas av dendritiska träd och exporterar den till MS Excel. Statistisk analys av data görs med GraphPad Prism mjukvara (se nedan).
2. Antal förgreningspunkter. På grund av den grenade och fina morfologi Purkinje träd cell dendritiska förgreningspunkter måste räknas manuellt. Den 20x bildfil av Purkinje celler är inzoomad så att den täcker det mesta av skärmen med hjälp av Adobe Photoshop. Då varje gren punkten räknas och markeras med en ljus punkt (Figur 2B).

Övervaka utvecklingen av Purkinje cells dendritiska trädet under odlingsperioden
Organotypiska slice kulturer härledda från Pcp2-EGFP möss som uttrycker EGFP specifikt i Purkinje-celler gör det möjligt att studera morfologin hos individuella celler under flera dagar i odling. På så sätt tillväxten och utvecklingen av den dendritiska trädet under odlingsperioden kan fint dokumenteras. Living identifierade Purkinje celler fotograferade var 2: ^a eller 3: ^e dag under odlingsperioden med 10x målet. Denna låga effekt mål valdes för att undvika och minimera fototoxisk skada på cellerna på grund av belysningen med fluorescerande ljus. Visar två exempel på Purkinje-celler fotograferade i levande kulturer Figur 3. Den första cellen följdes från 2 dagar in vitro tills 7 dagar in vitro (figur 3, AC). Det är uppenbart att dendritic träd av denna cell under denna tidsperiod växer flera nya kontor och expanderar i storlek. I det andra exemplet har en Purkinje celler följt 4 till 11 dagar in vitro (Figur 3, DF). Den lilla dendritiska träd närvarande vid DIV4 expanderar kraftigt under denna tidsperiod. Båda exemplen visar att de flesta av den dendritiska träd Purkinje-celler närvarande vid slutet av odlingsperioden har faktiskt utvecklas i kulturen.

Utveckling av Purkinje cellen dendritiska träd hämmas av PKC eller mGluR1 stimulering
Organotypiska cerebellära slice kulturer odlades under 11 dagar. Börjar på 2: ^a dag in vitro vissa kulturer behandlades med antingen PMA (50 nM), en forbolester stimulerande PKC eller DHPG (10 pM), en mGluR1 agonist, tills kulturerna fixerades. Båda föreningarna har visats tidigare att hämma och begränsa Purkinje tillväxt celler dendritisk ^{7, 8, 9, 5.}I den obehandlade kontrollen skivor Purkinje-celler utvecklade en typisk stor och mycket grenade dendritiska träd som visualiserades antingen med anti-kalbindin immunfärgning (Figur 4A) eller i kulturer med EGFP-uttryckande Purkinje celler genom immunfärgning med anti-GFP (Figur 4D). I odlingar behandlade med PMA morfologin hos den dendritiska trädet djupet ändrat. Dendriterna verkade tjockare och hade bara några korta sidogrenar. Många Purkinje-celler, till skillnad från i kontrollkulturer, inte längre unipolär, med en primär dendrit härrör från cellkroppen, men utvecklade två eller flera primära dendriter (Figur 4B, E). Det område som omfattas av dendritiska trädet markant minskas (se nedan). En liknande situation var närvarande i DHPG-behandlade kulturer. Den dendritiska träd av Purkinje-celler var starkt reducerad i storlek och förgreningen reducerades markant (figur 4C, F). Men det fanns också några Qualitätive skillnader jämfört med PMA-behandlade kulturer. Det fanns ingen förtjockning av de dendritiska grenarna, och de primära dendriter som många mycket korta sekundära dendriter (Figur 4C, F) vilket antyder att de signaleringshändelser pågår i PMA och DHPG-behandlade Purkinje-celler kan vara liknande, men inte identiska.

Kvantitativ utvärdering av Purkinje celler dendritiska träd storlek och pekar gren för kvantitativ utvärdering är storleken på Purkinje celler dendritiska träd och antalet förgreningspunkter per Purkinje celler mätt som beskrivs ovan. Resultat från minst tre oberoende experiment poolas samman, och ett minimum av 20 celler behöver analyseras. Medelvärdet av området som täcks av de dendritiska träd för kontrollexperimenten bestämmes och anges som 100%, och värdena för de andra försöken uttrycks som procentvärden därefter. Statistisk analys av data görs med GraphPad Prism mjukvara. Eftersom vi inteanta att alla bestämda värden är en del av en Gauss-fördelning, använder vi statistiska test som inte antar en sådan fördelning av de uppmätta värdena. För att jämföra flera villkor och provning för statistisk signifikans, använder vi Kruskal-Wallis test följt av ett lämpligt förfarande för post hoc test för rang-statistiken, som t.ex. genomförts i Dunns efter provet i GraphPad Prism. Resultaten oftast presenteras som stapeldiagram. Ett exempel på en sådan statistisk utvärdering ges i figur 5. Både analysen av den dendritiska trädet storlek (figur 5A) och antalet förgreningspunkter per Purkinje cell (figur 5B) visar tydliga skillnader mellan kontroll tillstånd och DHPG eller PMA-behandling. Båda parametrarna var annorlunda med en statistisk signifikans av p <0,001 enligt Kruskal-Wallis test.

Figure 1. EGFP-märkt Purkinje cell. I Pcp2-EGFP möss inte alla Purkinje-celler uttrycker EGFP. Därför kan dendritiska träd av vissa Purkinje-celler ses individuellt när de uttrycker EGFP (EGFP kanal i A) och de angränsande cellerna Purkinje med överlappande dendritiska träd inte (negativ i EGFP visade kanalen i A, positiv i anti-kalbindin visas färgning i den röda kanalen i B). Skala bar = 50 | im.

Figur 2. Mätning av dendritiska parametrar Purkinje celler. (A). Storleken på den dendritiska träd kan lätt mätas genom att följa konturen av Purkinje cellen med ett enda musklick i Bildanalys Image Pro plus med Trollstaven. Den trollstaven används så att hela dendritiska trädet inklusive cell soma och alla dendritiska grenar helt omges av linjen. (B). Antalet förgreningspunkter är koppnted manuellt i bilder av Purkinje celler. Varje förgreningspunkt är markerad med en gul prick. Skala bar = 50 | im.

Figur 3. Övervakning utvecklingen av Purkinje cellens dendritiska träd. Fotograferades upprepade gånger för att övervaka tillväxten av den dendritiska trädet Identifierade Purkinje-celler. (AC): Dendritic träd en Purkinje celler växer och utvecklas från dag in vitro (DIV) 2 till DIV7. Det är kontinuerlig tillväxt och förgrening av dendriterna under denna odlingsperiod. (DF): Dendritic träd en Purkinje celler växer och utvecklas från DIV4 till DIV11. Den dendritiska Tree expanderar kraftigt under denna odlingsperiod. Skala bar = 50 | im.

Figur 4. Utveckling av Purkinje cellen dendritiska träd hämmas av PKC eller mGluR1 stimulatipå (A), (D):. Obehandlade kontrollceller med en väl utvecklad dendritisk träd. (B), (E): Efter 9 dagars PMA-behandling dendriter verkar förtjockas och den dendritiska trädet starkt reduceras storlek. Celler förlorar ofta sin polarisation och bli bipolär (E). (C), (F): Efter 9 dagars behandling DHPG den dendritiska trädet är kraftigt reducerad i storlek. Till skillnad från i PMA-behandling, många mycket fina och korta sidogrenar som finns på de primära och sekundära dendriter. Celler förlorar ofta sin polarisation och bli bipolär (F). Purkinje-celler visualiserades med anti-kalbindin immunfärgning i (A - C) och genom EGFP-expression i kulturer härledda från Pcp2-EGFP möss i (D - F). Skala bar = 50 | im.

Figur 5. Kvantitativ utvärdering av Purkinje celler dendritiska träd storlek och förgrening. Kvantitativa mätningar visar att både dendritiska träd storlek (övre stapeldiagram) och number av förgreningspunkter (lägre stapeldiagram) är kraftigt reducerad efter PMA eller DHPG behandling. Skillnader mellan träden kontroll dendritiska och dendritiska träd i Purkinje celler från behandlade kulturer var signifikanta med p <0,001.

Discussion

De metoder som presenteras här möjligt att studera utvecklingen Purkinje cell dendritisk i organotypiska cerebellära slice kulturer och att kvantitativt utvärdera Purkinje expansionen celler dendritisk genom mätning dendritisk träd storlek och antalet dendritiska förgreningspunkter. Naturligtvis är en mer omfattande och sofistikerad kvantitativ analys av Purkinje cell dendriter möjligt, t.ex. genom att bestämma den totala dendritiska längd, utför en Sholl analys eller bestämning av fraktala dimensionen av den dendritiska trädet. För denna typ av analys är det vanligtvis krävs för att manuellt spåra hela Purkinje trädet cell dendritiska till ett analysprogram som t.ex. Neuro-Lucida. Även dessa mer förfinade metoder verkligen ge en överlägsen nivå av analys (se t.ex. ^{1, 6),} de är mer tidskrävande och kräver mer specialiserad utrustning och analys jämfört med de metoder som presenteras här. För de flesta tillämpningar, särskilt i situationer där förändringarnai Purkinje cell dendriter är betydande och kvalitativt synlig, var de enkla metoder som presenteras kommer att vara tillräckliga. Det bör noteras att de organotypiska cerebellära slice kulturer härledda från P8 möss kommer endast att omfatta den senare fasen av Purkinje celler dendritiska utveckling kännetecknas av snabb dendritiska expansion. För studien av tidigare steg, behöver skivan odlingsmetoden anpassas till skivor från neonatala eller embryonala djur som därefter kommer att täcka de tidigare faserna av dendritiska utveckling (t.ex. ^2).

För visualisering av Purkinje celler i organotypiska cerebellära slice kulturer har vi fokuserat enbart på två rutinmetoder: anti-kalbindin-immunfärgning och användning av möss med EGFP uttrycker Purkinje celler. Naturligtvis mer metoder finns tillgängliga, i synnerhet biolistiska eller viral transfektion med fluorescerande proteiner, diolistic märkning med fluorescerande färgämnen och intracellulära preparat injektioner i enskilda Purkinje celler. Beroende på de krav som studien och den utrustning som finns i laboratoriet dessa metoder kan väsentligt höja analysen av Purkinje celler dendritiska morfologi, till exempel genom att analysera Dendritutskotten med konfokal eller två foton mikroskopi.