Analysen av Purkinje Cell Dendritic Morfologi i Organotypiska slice kulturer
Summary
Vi presenterar ett protokoll som gör det möjligt att visa och för att kvantitativt bedöma morfologi av den dendritiska träd individuella Purkinje celler odlade i organotypiska cerebellära slice kulturer. Detta protokoll är avsett att främja studier av mekanismerna för Purkinje celler dendritiska utveckling.
Abstract
Purkinje celler är ett attraktivt modellsystem för att studera dendritiska utveckling, eftersom de har en imponerande dendritiska träd som är strikt orienterad i sagittalplanet och utvecklar främst i den postnatala perioden i små gnagare 3. Dessutom flera antikroppar som selektivt och intensivt etikett Purkinje celler inklusive alla processer, med anti-kalbindin D28K är den mest använda. För visning av dendriter i levande celler, möss som uttrycker EGFP selektivt i Purkinje celler 11 är tillgängliga via Jackson Labs. Organotypic cerebellära slice kulturer celler möjliggör enkel experimentell manipulation av Purkinje celler dendritiska utveckling eftersom de flesta av dendritiska expansion av Purkinje celler dendritiska träd faktiskt sker under odlingsperioden 4. Vi presenterar här en kort, pålitlig och lätt protokoll för att visa och analysera den dendritiska morfologi Purkinje celler odlas i organotypic cerebellära slice kulturer. För många ändamål är en kvantitativ utvärdering av Purkinje celler dendritiska träd önskvärt. Vi fokuserar här på två parametrar, dendritiska träd storlek och filial nummer punkt, som kan snabbt och enkelt bestämmas från anti-kalbindin färgade cerebellära slice kulturer. Dessa två parametrar ger ett tillförlitligt och känsligt mått på förändringar av Purkinje cellens dendritisk träd. Använda exempel behandlingar med proteinkinas C (PKC) aktivator PMA och den metabotropiska glutamatreceptor 1 (mGluR1) visar vi hur skillnader i dendritiska utveckling visualiseras och kvantitativt utvärderas. Kombinationen av närvaron av en omfattande dendritiska träd, selektiva och intensiva metoder immunofärgning, organotypiska kulturer skiva som täcker perioden av dendritiska tillväxt och en musmodell med Purkinje cellspecifik EGFP uttryck gör Purkinje celler en kraftfull modellsystem för att avslöja mekanismerna för dendritiska utveckling.
Protocol
Discussion
De metoder som presenteras här möjligt att studera utvecklingen Purkinje cell dendritisk i organotypiska cerebellära slice kulturer och att kvantitativt utvärdera Purkinje expansionen celler dendritisk genom mätning dendritisk träd storlek och antalet dendritiska förgreningspunkter. Naturligtvis är en mer omfattande och sofistikerad kvantitativ analys av Purkinje cell dendriter möjligt, t.ex. genom att bestämma den totala dendritiska längd, utför en Sholl analys eller bestämning av fraktala dimensionen av d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av University of Basel, Institutionen för biomedicin och Swiss National Science Foundation (31003A-116.624).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Tissue culture Inserts | Millipore | PICM 03050 PICM ORG50 | The PICMORG50 inserts have a low rim and allow viewing of live cultures at a microscope |
| MEM | Gibco, Invitrogen | 11012044 | |
| Glutamax 1 | Gibco, Invitrogen | 35050038 | |
| Basal Medum Eagle | Gibco, Invitrogen | 41010026 | |
| Horse serum | Gibco, Invitrogen | 26050070 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Tocris | 1201 | |
| (RS)-3,5-Dihydroxy-phenylglycine (DHPG) | Tocris | 0342 | |
| Rabbit anti-calbindin D-28K | Swant | CB38 | |
| Anti NeuN, clone A60 | Chemicon, Millipore | MAB377 | |
| Rabbit anti-GFP | Abcam | Ab290 |
References
- Bosman, L. W., Hartmann, J., Barski, J. J., Lepier, A., Noll-Hussong, M., Reichardt, L. F., Konnerth, A. Requirement of TrkB for synapse elimination in developing cerebellar Purkinje cells. Brain Cell Biol. 35, 87-101 (2006).
- Boukhtouche, F., Janmaat, S., Vodjdani, G., Gautheron, V., Mallet, J., Dusart, I., Mariani, J. Retinoid-related orphan receptor alpha controls the early steps of Purkinje cell dendritic differentiation. J. Neurosci. 26, 1531-1538 (2006).
- Kapfhammer, J. P. Cellular and molecular control of dendritic growth and development of cerebellar Purkinje cells. Prog. Histochem. Cytochem. 39, 131-182 (2004).
- Kapfhammer, L. C., Doering, J. P. Cerebellar slice cultures. Protocols for Neural cell culture. , 285-298 (2010).
- Gugger, O. S., Kapfhammer, J. P. Reduced size of the dendritic tree does not protect Purkinje cells from excitotoxic death. J. Neurosci. Res. 88, 774-783 (2010).
- Li, J., Gu, X., Ma, Y., Calicchio, M. L., Kong, D., Teng, Y. D., Yu, L., Crain, A. M., Vartanian, T. K., Pasqualini, R., Arap, W., Libermann, T. A., Snyder, E. Y., Sidman, R. L. mediates Purkinje cell dendritic development via lysyl oxidase propeptide and NF-κB signaling. Neuron. 68, 45-60 (2010).
- Metzger, F., Kapfhammer, J. P. Protein kinase C activity modulates dendritic differentiation of rat Purkinje cells in cerebellar slice cultures. Eur. J. Neurosci. 12, 1993-2005 (2000).
- Schrenk, K., Kapfhammer, J. P., Metzger, F. Altered dendritic development of cerebellar Purkinje cells in slice cultures from protein kinase C?-deficient mice. Neuroscience. 110, 675-689 (2002).
- Sirzen-Zelenskaya, A., Zeyse, J., Kapfhammer, J. P. Activation of class I metabotropic glutamate receptors limits dendritic growth of Purkinje cells in organotypic slice cultures. Eur. J. Neurosci. 24, 2978-2986 (2006).
- Stoppini, L., Buchs, P. -. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).
- Tomomura, M., Rice, D. S., Morgan, J. I., Yuzaki, M. Purification of Purkinje cells by fluorescence-activated cell sorting from transgenic mice that express green fluorescent protein. Eur. J. Neurosci. 14, 57-63 (2001).
- Weyer, A., Schilling, K. Developmental and cell type-specific expression of the neuronal marker NeuN in the murine cerebellum. J. Neurosci. Res. 73, 400-409 (2003).
