Анализ Пуркинье морфологии дендритных клеток в органотипической культур Slice
Summary
Мы представляем протокол, который позволяет просматривать и количественно ослов морфологии дендритных деревьев отдельных клеток Пуркинье, выращенных в культурах мозжечка органотипических срез. Этот протокол предназначен для поощрения исследований о механизмах развития Пуркинье дендритные клетки.
Abstract
Клетки Пуркинье являются привлекательной модельной системой для изучения дендритных развития, потому что они имеют впечатляющие дендритных дерева, строго ориентированы в сагиттальной плоскости и развивается в основном в послеродовой период в мелких грызунов 3. Кроме того, некоторые антитела, которые избирательно и интенсивно этикетке клеток Пуркинье, включая все процессы, с анти-кальбиндин D28K настоящее время наиболее широко используется. Для просмотра дендритов в живых клетках мышей, экспрессирующих EGFP выборочно в клетках Пуркинье 11 доступны через Джексона лабораторий. Органотипической мозжечка срез культуры клеток позволяет легко экспериментальные манипуляции Пуркинье развития дендритных клеток, потому что большинство из дендритных расширения дендритных клеток Пуркинье дерево на самом деле происходит в культуре периода 4. Мы приведем здесь краткий, надежный и простой протокол для просмотра и анализа морфологии дендритных клеток Пуркинье, выращенных в organotypiС мозжечка культур срез. Для многих целей количественной оценки дендритных клеток Пуркинье дерево является желательным. Мы сосредоточимся на двух параметров: размер дендритных деревьев и номера точки ветвления, которые могут быть быстро и легко определяется из анти-кальбиндин окрашенных мозжечка культур срез. Эти два параметра дают надежной и чувствительной мерой изменения Пуркинье дерево дендритные клетки. На примере процедуры с протеинкиназы С (ПКС) активатор PMA и метаботропных рецептора глутамата 1 (mGluR1) мы покажем, как различия в дендритных развития визуализировать и количественно оценить. Сочетание наличия обширного дерева дендритные, селективный и интенсивный методы иммуноокрашивания, органотипических культур срез которой охватывают период рост дендритов и мышь модели с клеток Пуркинье конкретное выражение EGFP сделать клетки Пуркинье мощная модель системы для выявления механизмов дендритные развития.
Protocol
Discussion
Методы, представленные здесь, позволяют изучать Пуркинье дендритных клеток в развитии мозжечка органотипических культур срез и количественно оценить Пуркинье расширения дендритных клеток путем измерения размеров дендритных дерева и количество дендритных точки ветвления. Конечно, ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Базельский университет, кафедра биомедицине, и Швейцарский национальный научный фонд (31003A-116624).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Tissue culture Inserts | Millipore | PICM 03050 PICM ORG50 | The PICMORG50 inserts have a low rim and allow viewing of live cultures at a microscope |
| MEM | Gibco, Invitrogen | 11012044 | |
| Glutamax 1 | Gibco, Invitrogen | 35050038 | |
| Basal Medum Eagle | Gibco, Invitrogen | 41010026 | |
| Horse serum | Gibco, Invitrogen | 26050070 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Tocris | 1201 | |
| (RS)-3,5-Dihydroxy-phenylglycine (DHPG) | Tocris | 0342 | |
| Rabbit anti-calbindin D-28K | Swant | CB38 | |
| Anti NeuN, clone A60 | Chemicon, Millipore | MAB377 | |
| Rabbit anti-GFP | Abcam | Ab290 |
References
- Bosman, L. W., Hartmann, J., Barski, J. J., Lepier, A., Noll-Hussong, M., Reichardt, L. F., Konnerth, A. Requirement of TrkB for synapse elimination in developing cerebellar Purkinje cells. Brain Cell Biol. 35, 87-101 (2006).
- Boukhtouche, F., Janmaat, S., Vodjdani, G., Gautheron, V., Mallet, J., Dusart, I., Mariani, J. Retinoid-related orphan receptor alpha controls the early steps of Purkinje cell dendritic differentiation. J. Neurosci. 26, 1531-1538 (2006).
- Kapfhammer, J. P. Cellular and molecular control of dendritic growth and development of cerebellar Purkinje cells. Prog. Histochem. Cytochem. 39, 131-182 (2004).
- Kapfhammer, L. C., Doering, J. P. Cerebellar slice cultures. Protocols for Neural cell culture. , 285-298 (2010).
- Gugger, O. S., Kapfhammer, J. P. Reduced size of the dendritic tree does not protect Purkinje cells from excitotoxic death. J. Neurosci. Res. 88, 774-783 (2010).
- Li, J., Gu, X., Ma, Y., Calicchio, M. L., Kong, D., Teng, Y. D., Yu, L., Crain, A. M., Vartanian, T. K., Pasqualini, R., Arap, W., Libermann, T. A., Snyder, E. Y., Sidman, R. L. mediates Purkinje cell dendritic development via lysyl oxidase propeptide and NF-κB signaling. Neuron. 68, 45-60 (2010).
- Metzger, F., Kapfhammer, J. P. Protein kinase C activity modulates dendritic differentiation of rat Purkinje cells in cerebellar slice cultures. Eur. J. Neurosci. 12, 1993-2005 (2000).
- Schrenk, K., Kapfhammer, J. P., Metzger, F. Altered dendritic development of cerebellar Purkinje cells in slice cultures from protein kinase C?-deficient mice. Neuroscience. 110, 675-689 (2002).
- Sirzen-Zelenskaya, A., Zeyse, J., Kapfhammer, J. P. Activation of class I metabotropic glutamate receptors limits dendritic growth of Purkinje cells in organotypic slice cultures. Eur. J. Neurosci. 24, 2978-2986 (2006).
- Stoppini, L., Buchs, P. -. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).
- Tomomura, M., Rice, D. S., Morgan, J. I., Yuzaki, M. Purification of Purkinje cells by fluorescence-activated cell sorting from transgenic mice that express green fluorescent protein. Eur. J. Neurosci. 14, 57-63 (2001).
- Weyer, A., Schilling, K. Developmental and cell type-specific expression of the neuronal marker NeuN in the murine cerebellum. J. Neurosci. Res. 73, 400-409 (2003).
