De Analyse van de Purkinje cel dendritische morfologie in organotypische slice culturen

Summary

We beschrijven een protocol dat toelaat om en kwantitatief beoordelen van de morfologie van de dendritische structuur van afzonderlijke Purkinje cellen gekweekt in organotypische cerebellum slice culturen. Dit protocol is bedoeld om studies te bevorderen over de mechanismen van Purkinje cel dendritische ontwikkeling.

Abstract

Purkinje-cellen zijn een aantrekkelijk modelsysteem voor het bestuderen van dendritische ontwikkeling, omdat ze een indrukwekkende dendritische boom die strikt gericht is in het sagittale vlak en ontwikkelt vooral in de postnatale periode bij kleine knaagdieren, ^3. Bovendien zijn verschillende antilichamen beschikbaar die selectief en intensief label Purkinje cellen inclusief alle processen met anti-Calbindin D28K wordt de meest algemeen gebruikt. Voor het bekijken van dendrieten in levende cellen, muizen die EGFP selectief in Purkinje cellen ¹¹ zijn verkrijgbaar via Jackson labs. Organotypische cerebellaire slice culturen cellen maken een eenvoudige experimentele manipulatie van Purkinje cell dendritische ontwikkeling, omdat de meeste van de dendritische uitbreiding van de Purkinje cel dendritische boom is eigenlijk die plaatsvinden tijdens de kweekperiode ^4. We presenteren hier een korte, betrouwbare en gemakkelijke protocol voor het bekijken en analyseren van de dendritische morfologie van Purkinje cellen gekweekt in organotypic cerebellaire slice culturen. Voor vele doeleinden, een kwantitatieve evaluatie van de Purkinje cel dendritische structuur gewenst. Wij richten ons hier op twee parameters, dendritische boom grootte en tak point getallen, die kan snel en eenvoudig worden bepaald op basis van anti-calbindin lood cerebellaire slice culturen. Deze twee parameters leveren een betrouwbare en gevoelige maat voor veranderingen van de Purkinje cel dendritische boom. Het voorbeeld van behandelingen met de proteïne kinase C (PKC) activator PMA en de metabotrope glutamaat receptor 1 (mGluR1) we zien hoe verschillen in dendritische ontwikkeling gevisualiseerd en kwantitatief beoordeeld. De combinatie van de aanwezigheid van een uitgebreide dendritische boom selectieve en intense immunokleuring methoden organotypische slice culturen die de periode van dendritische groei en een muismodel bedekken met Purkinje celspecifieke EGFP expressie maken Purkinjecellen een krachtig modelsysteem voor het onthullen van de mechanismen van dendritische ontwikkeling.

Protocol

1. Het opzetten van Organotypische Cerebellaire slice culturen

Cerebellaire slice culturen zijn bereid uit postnatale dag 8 P (8) muis pups met de statische incubatie methode ^10. In ons laboratorium gebruiken we B6CF1 muizen. In sommige experimenten eveneens transgene muizen gebruikt die selectief expressie EGFP in Purkinje cellen. De voorbereiding van slice culturen duurt ongeveer 30 minuten per muis pup, dat wil zeggen 3 uur voor een nest van 6 pups muis. Alle stappen worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden in een laminaire stroming werkbank met gesteriliseerde chirurgische instrumenten.

1. Het cerebellum van P8 muis pups ontleed uit de hersenen in ijskoude preparaat medium (MEM (Gibco Catalog No 11012) met glutamax 1:100, pH 7,3) met een stereomicroscoop.
2. De kleine hersenen wordt gesneden in 350 pm dikke plakken in het sagittale richting met behulp van een McIlwain tissue chopper.
3. De schijfjes worden geplaatst op Millipore celkweek inserts (approx.6 slices per insert, Millipore PICM03050) en worden geïncubeerd in 6-well platen met 0,75 ml per putje van incubatiemedium (48,35 ml MEM, 25 ml Eagle Medium, 25 ml paardenserum, 1 ml glutamax I, 0,65 ml van een steriele 10% glucose oplossing, pH 7,3) in een vochtige atmosfeer met _5% CO2 bij 37 ° C. Alle weefselkweek reagentia waren van Gibco, Invitrogen.
4. Farmacologische behandelingen meestal gestart na 3 dagen in vitro (DIV3) door toevoeging van het geneesmiddel in de gewenste concentratie aan het kweekmedium. Forbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) en (RS) -3,5-Dihydroxyphenylglycine (DHPG) waren van Tocris, UK. Omdat veel geneesmiddelen vereisen het gebruik van DMSO of ethanol bereiden van een voorraadoplossing (bijvoorbeeld PMA) moet worden gezorgd dat de totale hoeveelheid oplosmiddel toegevoegd aan het kweekmedium niet meer dan 1% (7,5 ul per putje). De drugs worden verlengd met de verandering van het kweekmedium elke ^2e of ^3e dag.

2. Fixatie en Immunoste handhaven van Organotypische Cerebellaire slice culturen

Een belangrijk voordeel van de kleine hersenen is dat antilichamen beschikbaar zijn die specifiek en helder de belangrijkste cerebellaire neuronen, dwz Purkinje cellen en granule cellen vlek. De dendritische morfologie van Purkinje cellen kunnen worden onthuld door immunokleuring met anti-calbindin D28K.

1. Voor bevestiging van de culturen, wordt het kweekmedium verwijderd en 3 ml koude 4% paraformaldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer (pH 7,4) zorgvuldig toegevoegd per putje dat de Millicell insert met de cerebellaire plakken aan het membraan. Culturen overnacht gefixeerd, dan fixatief wordt verwijderd en de kweken gewassen met fosfaatbuffer.
2. Voor immunokleuring de volgende antilichamen gebruikt: rabbit anti-calbindin D-28K (Swant, Bellinzona, Zwitserland) bij 1:1000 voor het selectief visualiseren Purkinje cellen en monoklonaal anti-neun (Chemicon, Millipore) bij 1:500 voor het selectief visualiseren granulaatle cellen ^12. Konijn anti-GFP was van Abcam, UK. Fluorescerende secundaire Alexa antilichamen waren bij Molecular Probes, Invitrogen.
3. De kweken worden gepermeabiliseerd en geblokkeerd door toevoeging van 3% normaal geitenserum + 0,3% TritonX100 in 0,1 M fosfaatbuffer (blokkerende oplossing). Anti-calbindin D28K en anti-neun verdund in blokkeeroplossing en de kweken worden geïncubeerd met de blokkeeroplossing die de antilichamen overnacht bij 4 ° C onder licht schudden. Alle verdunningen worden aangeduid als% (v / v), wordt Triton X100 uit een 10% voorraadoplossing om pipetteren vergemakkelijken.
4. De kweken worden gespoeld 3x met 0,1 M fosfaatbuffer en vervolgens geïncubeerd met geschikte tweede antilichamen, bijv. geiten anti-konijn Alexa 568 en geit anti-muis Alexa 488 1:500 verdund in 0,1 M fosfaatbuffer + 0,1% TritonX100 2 uur bij kamertemperatuur. De kweken worden vervolgens gespoeld 3x met 0,1 M fosfaatbuffer.
5. De gekleurde plakjes worden verwijderd uit de kweekgoed met een penseel en zijn gemonteerd op Superfrost Plus objectglaasjes en afgedekt met een geschikt fixeermiddel, bijvoorbeeld Mowiol. De culturen kan nu worden bekeken op een gewone microscoop met epifluorescentie apparatuur of met een confocale microscoop.

3. Bekijken van Individuele Purkinje cellen in organotypische slice culturen

1. Na immunokleuring met Calbindin D28k de volledige cytoplasma van Purkinje cellen is licht gekleurd met inbegrip van de dendrieten en het axon. Vanwege de dichte aanpassing van Purkinje cellen in de Purkinje cellaag, de dendritische assen meeste Purkinje cellen overlappen waardoor het moeilijk om de complete as van een individuele cel te bestuderen. Vanwege celdood van een Purkinje cellen tijdens het bereidingsproces, in veel culturen sommige gebieden aanwezig zijn met een verminderde dichtheid van Purkinje cellen. In dergelijke gebieden is mogelijk om Purkinje cellen met een volledige dendritische as die niet overlappen met andere cel. In deze cellen kan de dendritische prieel worden bekeken en geanalyseerd in een kwaliteit die vergelijkbaar is met een Golgi kleuring. Omdat in het cerebellum Purkinje de cellen de enige celtype tot expressie Calbindin D28K de cellen worden geïdentificeerd als Purkinje cellen.
2. Een alternatieve methode is het gebruik van cultures afgeleid van B6, FVB-Tg (Pcp2-EGFP) 146.244Yuza / J muizen (hier Pcp2-EGFP muizen, verkrijgbaar bij Jackson Laboratories) die EGFP expressie onder de Purkinje celspecifieke promoter L7 ^11. In dergelijke slice culturen die Purkinje cellen kunnen worden gevisualiseerd door expressie van EGFP. Het is ook mogelijk om de dendritische morfologie van een cel tijd. Ook na fixatie kan EGFP tot expressie Purkinje cellen worden immunogekleurd met een anti-GFP antilichaam. Beide methodes zijn geschikt voor kleuring dendrieten, cellichamen en axonen van Purkinje cellen in organotypische kweken. Omdat de promoter in de L7-EGFP Pcp2 muizen niet tot expressie in alle Purkinje cel en zijn variations frequentie van expressie Purkinje cellen van muizen (Kapfhammer, gegevens niet getoond) snijden cultures afgeleid van deze muizen gemakkelijker te visualiseren en te meten Purkinje dendritische cellen die bomen die overlappen met andere Purkinjecel dendritische bomen. Dergelijke dendritische bomen kunnen afzonderlijk worden bekeken wanneer de naburige Purkinje cellen met overlappende dendritische bomen niet express GFP (Figuur 1A, B).

4. Meting van de Purkinje cel Dendritische Boom Grootte en Branch Points

1. Dendritische boom grootte. De fluorescente labeling van Purkinje cellen de grootte van de dendritische boom van een bepaalde cel kan gemakkelijk worden gemeten indien de boom niet overlappen met andere cellen. Omdat de labels Calbindin immunokleuring alle Purkinje cellen, kan het moeilijk zijn om cellen te identificeren met niet-overlappende dendritische bomen. In dit geval het gebruik van Pcp2-EGFP wordt aanbevolen om de identificatie voldoende Purkinjecel vereenvoudigens met niet-overlappende dendritische bomen. Zodra een Purkinje cel met een niet-overlappende dendritische boom wordt geconstateerd, wordt deze bekeken met de 20x lens en een beeld wordt opgenomen met een digitale camera. Deze afbeelding kan vervolgens worden geanalyseerd met een beeldanalyseprogramma. We maken gebruik van Image Pro plus, die het mogelijk maakt een overzicht van de dendritische boom van de cel met een enkele muisklik met behulp van de toverstaf in het meten van de modus (Figuur 2A). Het programma berekent vervolgens het gebied dat onder de dendritische boom en exporteert het naar MS Excel. Statistische analyse van de gegevens gebeurt met GraphPad Prism software (zie hieronder).
2. Aantal tak punten. Als gevolg van de sterk vertakte en fijne morfologie van de Purkinje cel dendritische boomtak punten moeten met de hand worden geteld. De 20x beeldbestand van de Purkinje cellen wordt ingezoomd zodanig dat het grootste deel van het scherm met behulp van Adobe Photoshop dekt. Dan elke tak punt wordt geteld en gemarkeerd met een heldere stip (Figuur 2B).

Toezicht op de ontwikkeling van dendritische cellen Purkinje boom tijdens de kweekperiode
Organotypische slice cultures afgeleid van Pcp2-EGFP muizen die EGFP expressie specifiek in Purkinje cellen mogelijk om de morfologie van de individuele cellen te bestuderen gedurende meerdere dagen in cultuur. Op deze manier de groei en ontwikkeling van de dendritische boom tijdens de kweekperiode kan mooi worden gedocumenteerd. Living geïdentificeerd Purkinje cellen werden gefotografeerd om de 2 ^e of 3 ^e dag tijdens de kweekperiode met de 10x doelstelling. Deze laag vermogen doelstelling is gekozen om te voorkomen en fototoxische schade aan de cellen door de belichting met kunstlicht. Figuur 3 toont twee voorbeelden van Purkinje cellen gefotografeerd in levende culturen. De eerste cel werd gevolgd 2 dagen in vitro tot 7 dagen in vitro (figuur 3, AC). Het is duidelijk dat de dendritic boom van deze cel in deze periode groeit een aantal nieuwe vestigingen en breidt uit in grootte. In het tweede voorbeeld werd een Purkinje cel gevolgd 4 tot 11 dagen in vitro (figuur 3, DF). De kleine dendritische boom aanwezig op DIV4 breidt aanzienlijk in deze periode. Beide voorbeelden laten zien dat de meeste dendritische boom van Purkinje cellen aanwezig aan het einde van de kweekperiode inderdaad ontwikkeld in de cultuur.

Ontwikkeling van de Purkinje cel dendritische boom wordt geremd door PKC of mGluR1 stimulatie
Organotypische cerebellaire slice culturen werden gedurende 11 dagen. Vanaf ^de 2e dag in vitro, sommige culturen werden behandeld met PMA (50 nM), een forbolester stimuleren PKC of DHPG (10 uM), een mGluR1 agonist tot de kweken werden vastgesteld. Beide verbindingen zijn eerder aangetoond dat remmen en beperken Purkinjecel dendritische groei ^{7, 8, 9, 5.}In de onbehandelde plakken Purkinje cellen ontwikkelden een typisch groot en sterk vertakte dendritische boom die ofwel gevisualiseerd door anti-Calbindin immunokleuring (Figuur 4A) of in culturen met EGFP tot expressie Purkinje cellen door immunokleuring met anti-GFP (Figuur 4D). In cultures behandeld met PMA de morfologie van de dendritische boom ingrijpend veranderd. De dendrieten verscheen verdikt en had slechts enkele korte zijtakken. Veel Purkinje-cellen, in tegenstelling tot controlekweken, niet meer unipolaire, met een primaire dendriet afkomstig van het cellichaam, maar ontwikkelde twee of meer primaire dendrieten (figuur 4B E). Het grondgebied waarop de dendritische boom werd duidelijk verlaagd (zie hieronder). Een vergelijkbare situatie is aanwezig in DHPG behandelde kweken. De dendritische boom van de Purkinje-cellen werd sterk verkleind en de vertakking werd duidelijk verlaagd (Figuur 4C, F). Er waren echter ook enkele Qualitätive verschillen ten opzichte van PMA behandelde culturen. Er was geen verdikking van de dendritische takken, en de primaire dendrieten uitgevoerd vele zeer korte secundaire dendrieten (Figuur 4C, F) suggereert dat de signalering evenementen in PMA en DHPG behandelde Purkinje cellen gelijkaardig, maar niet identiek.

Kwantitatieve evaluatie van Purkinje cell dendritische Boommaat en vertakkingspunten voor kwantitatieve beoordeling, wordt de grootte van de Purkinje cel dendritische boom en het aantal vertakkingspunten per Purkinje cel gemeten zoals hierboven beschreven. In ten minste drie onafhankelijke experimenten samen gebundeld, minimaal 20 cellen moeten worden geanalyseerd. Het gemiddelde van het gebied waarop de dendritische bomen de controle-experimenten bepaald en ingesteld als 100% en de waarden voor de overige experimenten zijn uitgedrukt als percentage waarde toe. Statistische analyse van de gegevens gebeurt met GraphPad Prism software. Omdat we dat niet doenaannemen dat alle waarden bepaald deel van een Gauss-verdeling, gebruiken we statistische tests die niet uitgaan dergelijke verdeling van de gemeten waarden. Voor het vergelijken van meerdere en beproeving voor statistische significantie gebruiken we Kruskal-Wallis test gevolgd door een geschikte procedure voor post hoc tests rank statistiek gebaseerde, zoals bijvoorbeeld toegepast in plaats van de Dunn's test in GraphPad Prism. De resultaten worden meestal gepresenteerd als staafdiagrammen. Een voorbeeld van een dergelijk statistisch onderzoek wordt gegeven in figuur 5. De analyse van de dendritische Boommaat (Figuur 5A) en het aantal vertakkingspunten per Purkinje cel (Figuur 5B) duidelijke verschillen tussen de controlegroep en DHPG of PMA behandeling. Beide parameters verschilden met een statistische significantie van p <0,001 volgens de Kruskal-Wallis test.

FiguAd 1. EGFP-gelabelde Purkinje cel. In Pcp2-EGFP muizen niet alle Purkinje cellen express EGFP. Daarom kan dendritische bomen van een Purkinje cellen individueel bekeken wanneer express EGFP (EGFP kanaal A) en de naburige Purkinje cellen met overlappende dendritische bomen niet (negatief EGFP kanaal getoond in A, in de getoonde positieve anti-Calbindin kleuring in het rode kanaal in B). Scale bar = 50 pm.

Figuur 2. Meting van dendritische cellen parameters van Purkinje. (A). De grootte van de dendritische boom kan gemakkelijk gemeten worden door het traceren van de omtrek van het Purkinje cel met een enkele muisklik in de software voor beeldanalyse Image Pro plus met behulp van het gereedschap Toverstaf. De toverstaf wordt gebruikt, zodat de gehele dendritische boom waaronder de cel soma en alle dendritische takken volledig omringd door de lijn. (B). Het aantal tak punten is couhandmatig nted in beelden van Purkinje cellen. Elke tak punt wordt gemarkeerd met een gele stip. Scale bar = 50 pm.

Figuur 3. Bewaking van de ontwikkeling van de Purkinje cel dendritische structuur. Aangewezen Purkinje cellen werden herhaaldelijk gefotografeerd om de groei van de dendritische structuur volgen. (AC): Dendritische boom van een Purkinje cel groei en ontwikkeling vanaf de eerste dag in vitro (DIV) 2 tot DIV7. Er continue groei en vertakking van de dendrieten gedurende deze kweekperiode. (DF): Dendritische boom van een Purkinje cel groeien en ontwikkelen van DIV4 tot DIV11. De dendritische boom breidt hoofdzaak gedurende deze kweekperiode. Scale bar = 50 pm.

Figuur 4. Ontwikkeling van de Purkinje cel dendritische boom wordt geremd door PKC of mGluR1 stimulation (A), (D). Onbehandelde controle cellen met een goed ontwikkelde dendritische boom. (B), (E): Na 9 dagen van behandeling PMA dendrieten weergegeven verdikt en dendritische boom sterk gereduceerd in grootte. Cellen verliezen vaak hun polarisatie en worden bipolaire (E). (C), (F): Na 9 dagen behandeling DHPG de dendritische boom sterk verkleind. In tegenstelling tot de PMA behandeling vele zeer fijne en korte zijtakjes aanwezig zijn op de primaire en secundaire dendrieten. Cellen vaak hun polarisatie en worden bipolaire (F). Purkinje-cellen werden gevisualiseerd door anti-Calbindin immunokleuring in (A - C) en EGFP-expressie in cultures afgeleid van Pcp2-EGFP muizen (D - F). Scale bar = 50 pm.

Figuur 5. Kwantitatieve evaluatie van Purkinje cell dendritische boom grootte en vertakking. Kwantitatieve metingen tonen aan dat zowel dendritische boom grootte (bovenste grafiek) en de number van tak punten (onderste grafiek) worden sterk gereduceerd na PMA of DHPG behandeling. Verschillen tussen controle dendritische bomen en dendritische bomen van Purkinje cellen van behandelde culturen waren significant met p <0,001.

Discussion

De methoden die hier staat te stellen Purkinje cel dendritische ontwikkeling te bestuderen in organotypische cerebellum slice culturen en Purkinje cel dendritische groei kwantitatief te evalueren door het meten van dendritische boom grootte en het aantal van dendritische tak punten. Natuurlijk een uitgebreide en verfijnde kwantitatieve analyse van Purkinje cell dendrieten mogelijk, bijv. door bepaling van totale dendritische lengte uitvoeren van een analyse Sholl of bepalen van de fractale afmeting van de dendritische boom. Voor dit type van analyse is vaak noodzakelijk om de gehele Purkinjecel dendritische boom handmatig sporen in een analyseprogramma bijvoorbeeld Neuro-Lucida. Hoewel deze meer verfijnde methoden zeker geven een superieur niveau van analyse (zie bijvoorbeeld ^{1, 6),} zijn ze tijdrovend en vereisen gespecialiseerde apparatuur en analyse software vergeleken met de methoden die hier gepresenteerd. Voor de meeste toepassingen, met name in situaties waarin veranderingenin de Purkinje cel dendrieten aanzienlijk en kwalitatief zichtbaar werden de eenvoudige methoden voorgesteld voldoende. Opgemerkt dat de organotypische cerebellaire slice cultures afgeleid van P8 muizen alleen de latere fase van ontwikkeling dendritische cellen Purkinje gekenmerkt door snelle expansie dendritische dekken. Voor de studie van vroegere stadia, de slice cultuur methode moet worden aangepast aan de segmenten van neonatale of embryonale dieren die vervolgens zal betrekking hebben op de eerdere fasen van dendritische ontwikkeling (bijvoorbeeld ^2).

Voor de visualisatie van Purkinje cellen in organotypische cerebellum slice culturen hebben we alleen gericht op twee routine methoden: de anti-Calbindin immunokleuring en het gebruik van muizen met EGFP expressie Purkinje cellen. Natuurlijk meer methoden beschikbaar, met name biolistische of virale transfectie met fluorescerende eiwitten, diolistic etikettering met fluorescente kleurstoffen en intracellulaire kleurstof injecties in enkele Purkinjecellen. Afhankelijk van de vereisten van de studie en het materiaal beschikbaar in het laboratorium deze methoden kunnen een belangrijke verbetering van het niveau van analyse van Purkinje cell dendritische morfologie, bijvoorbeeld door het analyseren van dendritische uitsteeksels met confocale microscopie of twee foton.