Organotypic टुकड़ा संस्कृतियों में Purkinje सेल वृक्ष के समान आकृति विज्ञान के विश्लेषण

Summary

हम एक प्रोटोकॉल है कि देखने है और मात्रात्मक गधे के लिए व्यक्तिगत Purkinje organotypic अनुमस्तिष्क टुकड़ा संस्कृतियों में विकसित कोशिकाओं के वृक्ष के समान पेड़ की आकारिकी परमिट उपस्थित थे. यह प्रोटोकॉल का Purkinje सेल वृक्ष के समान विकास के तंत्र पर अध्ययन को बढ़ावा देने का इरादा है.

Abstract

Purkinje कोशिकाओं वृक्ष के समान विकास के अध्ययन के लिए एक आकर्षक मॉडल की व्यवस्था कर रहे हैं, क्योंकि वे एक प्रभावशाली वृक्ष के समान पेड़ है जो बाण के समान विमान में कड़ाई से उन्मुख है और ³ छोटे कृन्तकों में प्रसवोत्तर अवधि में ज्यादातर विकसित है. इसके अलावा, कई एंटीबॉडी उपलब्ध हैं जो चुनिंदा और अधिकता सभी प्रक्रियाओं सहित लेबल Purkinje विरोधी Calbindin D28K साथ कोशिकाओं सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जा रहा है. जीवित कोशिकाओं में dendrites के देखने के लिए, चुनिंदा EGFP Purkinje ¹¹ कोशिकाओं में व्यक्त चूहों जैक्सन प्रयोगशालाओं के माध्यम से उपलब्ध हैं. Organotypic अनुमस्तिष्क टुकड़ा संस्कृतियों कोशिकाओं Purkinje सेल वृक्ष के समान विकास के लिए आसान प्रयोगात्मक हेरफेर की अनुमति Purkinje सेल वृक्ष के समान पेड़ के वृक्ष के समान विस्तार की सबसे क्योंकि वास्तव में संस्कृति ⁴ अवधि के दौरान जगह ले जा रहा है. हम यहाँ Purkinje कोशिकाओं के वृक्ष के समान आकारिकी organotypi में हो देखने और विश्लेषण करने के लिए एक छोटी, विश्वसनीय और आसान प्रोटोकॉल उपस्थितग अनुमस्तिष्क टुकड़ा संस्कृतियों. कई प्रयोजनों के लिए, Purkinje सेल वृक्ष के समान पेड़ के एक मात्रात्मक मूल्यांकन वांछनीय है. हम यहाँ दो मापदंडों, वृक्ष के समान पेड़ के आकार और शाखा बिन्दु संख्या है, जो तेजी से और आसानी से विरोधी calbindin दाग अनुमस्तिष्क टुकड़ा संस्कृतियों से निर्धारित किया जा सकता है पर ध्यान केंद्रित. इन दो मापदंडों Purkinje सेल वृक्ष के समान पेड़ के परिवर्तन की एक विश्वसनीय और संवेदनशील उपाय उपज. प्रोटीन kinase सी (PKC) उत्प्रेरक PMA और metabotropic ग्लूटामेट 1 रिसेप्टर (mGluR1) हम दिखाना है कि वृक्ष के समान विकास में मतभेद visualized और मात्रात्मक मूल्यांकन कर रहे हैं के साथ उपचार के उदाहरण का उपयोग करना. एक व्यापक वृक्ष के समान पेड़, चयनात्मक और तीव्र immunostaining विधियों, organotypic टुकड़ा संस्कृतियों जो Purkinje सेल विशिष्ट EGFP अभिव्यक्ति के साथ वृक्ष के समान विकास और एक माउस मॉडल की अवधि को कवर Purkinje वृक्ष के समान के तंत्र का खुलासा करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल प्रणाली कोशिकाओं को बनाने की उपस्थिति के संयोजन विकास.

Protocol

1. Organotypic अनुमस्तिष्क टुकड़ा संस्कृतियों की स्थापना

अनुमस्तिष्क टुकड़ा संस्कृतियों प्रसवोत्तर दिन से 8 पी (8) माउस स्थिर ऊष्मायन ¹⁰ विधि का उपयोग पिल्ले को तैयार हैं. हमारी प्रयोगशाला में, हम B6CF1 चूहों का उपयोग करें. कुछ प्रयोगों में भी ट्रांसजेनिक चूहों का इस्तेमाल किया गया है जो EGFP चुनिंदा Purkinje कोशिकाओं में व्यक्त है. टुकड़ा संस्कृतियों की तैयारी के 6 माउस पिल्ले के एक कूड़े के लिए माउस पिल्ला, यानी 3 घंटे के अनुसार लगभग 30 मिनट लगते हैं. सभी चरणों को निष्फल सर्जिकल उपकरणों के साथ एक लामिना का प्रवाह कार्यक्षेत्र में बाँझ शर्तों के तहत किया जाता है.

1. P8 माउस पिल्ले के सेरिबैलम मस्तिष्क से ठंडा तैयारी मध्यम (1:100 glutamax, 7.3 पीएच के साथ सदस्य (Gibco कैटलॉग 11012 सं)) का उपयोग कर एक stereomicroscope में dissected है.
2. सेरिबैलम बाण के समान एक McIlwain ऊतक हेलिकॉप्टर का उपयोग अभिविन्यास में 350 सुक्ष्ममापी मोटी स्लाइस में काट रहा है.
3. स्लाइस Millipore सेल संस्कृति आवेषण (approx.6 टुकड़ा पर रखा जाता हैडालने, PICM03050 Millipore) के अनुसार है और 6 अच्छी तरह प्लेटें में 0.75 प्रति ऊष्मायन मध्यम (48.35 मिलीलीटर सदस्य, 25 मिलीलीटर ईगल मध्यम, 25 मिलीलीटर घोड़ा सीरम, 1ml glutamax मैं, एक बाँझ 10% ग्लूकोज के 0.65 मिलीलीटर मिलीलीटर के साथ incubated हैं समाधान, 7.3 5% सीओ _{2 के} साथ एक humidified वातावरण में) पीएच 37 डिग्री सेल्सियस सभी टिशू कल्चर अभिकर्मकों Gibco, Invitrogen से थे.
4. भेषज उपचार आमतौर पर वांछित एकाग्रता में संस्कृति के माध्यम से दवा जोड़कर में इन विट्रो (DIV3) 3 दिनों में शुरू कर रहे हैं. Phorbol 12-myristate (पीएमए) 13-एसीटेट और (राज्यसभा) -3,5 Dihydroxyphenylglycine (DHPG) Tocris, ब्रिटेन से थे. के बाद से कई दवाओं DMSO या इथेनॉल के एक शेयर समाधान (जैसे PMA) तैयार करने के लिए उपयोग की आवश्यकता ध्यान रखा जाना चाहिए कि विलायक की कुल राशि संस्कृति के माध्यम से अधिक (अच्छी तरह से प्रति 7.5 μl) 1%. दवाओं के साथ संस्कृति के माध्यम हर 2 ^{एन डी} या 3 ^{तीसरे} दिन के परिवर्तन के साथ नए सिरे से कर रहे हैं.

2. फिक्सेशन और Immunosorganotypic अनुमस्तिष्क टुकड़ा संस्कृतियों की taining

सेरिबैलम का एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि एंटीबॉडी उपलब्ध हैं कि विशेष रूप से और चमकीले प्रिंसिपल अनुमस्तिष्क न्यूरॉन्स, यानी Purkinje कोशिकाओं और ग्रेन्युल कोशिकाओं दाग. Purkinje कोशिकाओं के वृक्ष के समान morphology विरोधी calbindin D28K साथ immunostaining द्वारा प्रगट किया जा सकता है.

1. संस्कृतियों के निर्धारण के लिए, संस्कृति के माध्यम हटा दिया है और ठंड 0.1M फॉस्फेट बफर (7.4 पीएच) में 4% paraformaldehyde के 3 मिलीग्राम ध्यान से ही अनुमस्तिष्क झिल्ली को संलग्न स्लाइस साथ Millicell डालने युक्त प्रति जोड़ रहे हैं. संस्कृति रातोंरात तय कर रहे हैं, तो लगानेवाला हटा दिया जाता है और संस्कृतियों फॉस्फेट बफर के साथ rinsed हैं.
2. Immunostaining के लिए निम्नलिखित एंटीबॉडी का इस्तेमाल कर रहे हैं: 1:1000 में चुनिंदा 1:500 में चुनिंदा Granu visualizing के लिए Purkinje कोशिकाओं और मोनोक्लोनल विरोधी NeuN (Chemicon, Millipore) visualizing के लिए खरगोश विरोधी calbindin D-28K (Swant, Bellinzona, स्विट्जरलैंड)le ¹² कोशिकाओं. विरोधी GFP खरगोश Abcam, ब्रिटेन से था. प्रतिदीप्त माध्यमिक Alexa एंटीबॉडी आणविक जांच, Invitrogen से थे.
3. संस्कृतियों और permeabilized 0.1 एम फॉस्फेट बफर (समाधान अवरुद्ध) में 3% सामान्य बकरी सीरम + 0.3% TritonX100 जोड़कर अवरुद्ध कर रहे हैं. D28K विरोधी calbindin और विरोधी NeuN समाधान को रोकने में पतला कर रहे हैं और संस्कृतियों अवरुद्ध मामूली आंदोलन के तहत 4 में रात भर एंटीबॉडी ° सी युक्त समाधान के साथ incubated हैं. सभी dilutions% (v / v) के रूप में संकेत कर रहे हैं, Triton X100 एक 10% शेयर समाधान से लिया जाता है क्रम में करने के लिए pipetting की सुविधा.
4. संस्कृतियों 0.1 एम फॉस्फेट बफर के साथ 3x rinsed जाता है और फिर उपयुक्त 2 एंटीबॉडी, जैसे विरोधी खरगोश बकरी 568 Alexa और बकरी विरोधी माउस 488 Alexa के साथ incubated 0.1M फॉस्फेट बफर में से कम 2 घंटे के लिए 0.1 TritonX100% 1:500 पतला कमरे के तापमान. संस्कृतियों तो 0.1M फॉस्फेट बफर के साथ 3x rinsed कर रहे हैं.
5. दाग स्लाइस संस्कृति से हटा रहे हैंएक तूलिका के साथ अच्छी तरह से और Superfrost प्लस गिलास स्लाइड पर बढ़ रहे हैं और एक उपयुक्त बढ़ते मध्यम, Mowiol जैसे साथ coverslipped. संस्कृतियों अब epifluorescence उपकरणों के साथ एक नियमित माइक्रोस्कोप या एक confocal खुर्दबीन के साथ देखा जा सकता है.

3. Organotypic टुकड़ा संस्कृतियों में व्यक्तिगत Purkinje कोशिकाओं के देखना

1. Purkinje कोशिकाओं के Calbindin D28k साथ immunostaining के बाद पूरा cytoplasm चमकते dendrites और अक्षतंतु सहित दाग है. Purkinje सेल परत में Purkinje कोशिकाओं के घने संरेखण के कारण, यह मुश्किल का अध्ययन करने के लिए एक व्यक्ति के सेल के पूरा कुंज सबसे Purkinje कोशिकाओं के वृक्ष के समान arbors अतिव्यापी हैं. हालांकि, तैयारी की प्रक्रिया के दौरान कुछ Purkinje कोशिकाओं की कोशिका मृत्यु के कारण, कई संस्कृतियों में कुछ क्षेत्रों Purkinje कोशिकाओं के एक कम घनत्व के साथ मौजूद हैं. ऐसे क्षेत्रों में यह संभव है कि एक पूरा वृक्ष के समान कुंज के साथ Purkinje कोशिकाओं जो अन्य ग के साथ ओवरलैप नहीं करताElls. इन कोशिकाओं में, वृक्ष के समान कुंज और देखा जा सकता है एक Golgi धुंधला तुलनीय गुणवत्ता में विश्लेषण किया. क्योंकि सेरिबैलम में Purkinje कोशिकाओं केवल सेल प्रकार Calbindin D28K व्यक्त कोशिकाओं को भी Purkinje कोशिकाओं के रूप में पहचाने जाते हैं.
2. एक वैकल्पिक तरीका B6 संस्कृतियों से व्युत्पन्न का उपयोग करने के लिए है, जो FVB टीजी (Pcp2 EGFP) / 146.244Yuza जम्मू चूहों (यहाँ बुलाया चूहों Pcp2 EGFP, जैक्सन प्रयोगशालाओं से उपलब्ध) Purkinje सेल विशिष्ट L7 ¹¹ प्रमोटर तहत EGFP व्यक्त करते हैं. ऐसे टुकड़ा संस्कृतियों में रहने वाले Purkinje कोशिकाओं EGFP की अभिव्यक्ति द्वारा देखे जा सकते हैं. यह भी संभव है करने के लिए समय के साथ एक एकल कोशिका के वृक्ष के समान morphology का पालन. वैकल्पिक रूप से निर्धारण के बाद, EGFP व्यक्त Purkinje कोशिकाओं एक एंटीबॉडी विरोधी GFP immunostained किया जा सकता है. दोनों तरीकों धुंधला हो dendrites, सेल निकायों और organotypic संस्कृतियों में Purkinje कोशिकाओं के axons के लिए उपयुक्त हैं. क्योंकि Pcp2-EGFP चूहों में L7 प्रमोटर हर Purkinje सेल में व्यक्त नहीं है और वहाँ v रहे हैंचूहों (Kapfhammer, नहीं दिखाया डेटा) के बीच Purkinje कोशिकाओं व्यक्त की आवृत्ति में ariations टुकड़ा संस्कृतियों इन चूहों से प्राप्त यह आसान करने के लिए कल्पना और Purkinje कोशिकाओं जो वृक्ष के समान पेड़ जो अन्य Purkinje सेल वृक्ष के समान पेड़ों के साथ ओवरलैप उपाय. इस तरह के वृक्ष के समान पेड़ों व्यक्तिगत रूप से देखा जा सकता है जब वृक्ष के समान के पेड़ अतिव्यापी के साथ पड़ोसी Purkinje कोशिकाओं व्यक्त GFP (चित्रा 1 ए, बी) नहीं करते.

4. Purkinje सेल वृक्ष के समान पेड़ के आकार और शाखा अंक के मापन

1. वृक्ष के समान पेड़ आकार. Purkinje कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट लेबलिंग के साथ एक दिया सेल के वृक्ष के समान पेड़ के आकार को आसानी से अगर पेड़ अन्य कोशिकाओं के साथ अतिव्यापी नहीं मापा जा सकता है. Calbindin immunostaining लेबल Purkinje कोशिकाओं के कारण, यह गैर अतिव्यापी वृक्ष के समान के पेड़ के साथ कोशिकाओं की पहचान करने के लिए मुश्किल हो सकता है. Pcp2-EGFP का उपयोग करने के लिए इस मामले में पर्याप्त Purkinje सेल की पहचान को सरल करने के लिए सिफारिश की हैगैर अतिव्यापी वृक्ष के समान पेड़ों के साथ है. एक बार एक गैर अतिव्यापी वृक्ष के समान पेड़ के साथ एक Purkinje सेल की पहचान की है, यह 20x लेंस के साथ देखा जाता है और एक छवि एक डिजिटल कैमरा के साथ दर्ज की गई है. इस छवि को तो एक छवि विश्लेषण कार्यक्रम के साथ विश्लेषण किया जा सकता है. हम छवि प्रो प्लस, जो मोड (2A चित्रा) को मापने में जादू की छड़ी उपकरण का उपयोग एक माउस क्लिक के साथ सेल के वृक्ष के समान वृक्ष रूपरेखा की अनुमति देता है. कार्यक्रम तो वृक्ष के समान पेड़ से कवर किया है और यह एमएस एक्सेल के लिए निर्यात क्षेत्र की गणना करता है. डेटा के सांख्यिकीय विश्लेषण GraphPad चश्मे सॉफ्टवेयर (देखें नीचे) के साथ किया जाता है.
2. शाखा अंक की संख्या. Purkinje सेल वृक्ष के समान पेड़ की टहनी अंक की अत्यधिक branched और ठीक आकृति विज्ञान के कारण मैन्युअल गिना जा जरूरत है. Purkinje कोशिकाओं के 20x छवि ऐसी है कि यह Adobe Photoshop का उपयोग कर स्क्रीन के सबसे शामिल फ़ाइल में तेजी से बढ़ी है. फिर हर शाखा बिंदु गिना है और एक उज्ज्वल डॉट (चित्रा 2B) के साथ चिह्नित.

संस्कृति अवधि के दौरान Purkinje सेल वृक्ष के समान पेड़ के विकास की निगरानी
Organotypic टुकड़ा Pcp2 EGFP चूहों जो EGFP Purkinje कोशिकाओं में विशेष रूप से व्यक्त से व्युत्पन्न संस्कृतियों संस्कृति में कई दिनों के दौरान व्यक्ति की कोशिकाओं की आकारिकी का अध्ययन करने की अनुमति देते हैं. इस तरह अच्छी तरह से विकास और संस्कृति की अवधि के दौरान विकास के वृक्ष के समान पेड़ के दस्तावेज भी तैयार किया जा सकता है. जहाँ रहते हैं की पहचान Purkinje कोशिकाओं हर ^{एन डी} 2 या 3 ^{तीसरे} दिन 10x उद्देश्य के साथ संस्कृति की अवधि के दौरान फोटो खींच रहे थे. यह कम शक्ति के उद्देश्य से बचने के लिए और phototoxic फ्लोरोसेंट रोशनी के साथ रोशनी के कारण कोशिकाओं को नुकसान को कम करने के लिए चुना गया था चित्रा 3. Purkinje कोशिकाओं जीवित संस्कृतियों में फोटो खिंचवाने के दो उदाहरण से पता चलता है. 1 सेल इन विट्रो में 2 दिनों से इन विट्रो (चित्रा 3, एसी) में 7 दिनों तक पीछा किया गया था. यह स्पष्ट है कि dendritiग पेड़ इस सेल के इस समय अवधि के दौरान कई नई शाखाएं बढ़ता है और आकार में फैलता है. दूसरे उदाहरण में, एक Purkinje सेल इन विट्रो (3 चित्रा, लोमो) में 4 से 11 दिन से पीछा किया गया था. DIV4 में छोटे वृक्ष के समान वर्तमान पेड़ इस समय अवधि के दौरान काफी फैलता है. दोनों उदाहरणों से पता चलता है कि Purkinje कोशिकाओं के वृक्ष के समान पेड़ की सबसे संस्कृति की अवधि के अंत में मौजूद था वास्तव में संस्कृति में विकसित.

Purkinje सेल वृक्ष के समान पेड़ के विकास PKC या mGluR1 उत्तेजना से हिचकते
Organotypic अनुमस्तिष्क टुकड़ा संस्कृतियों में 11 दिनों के लिए सुसंस्कृत थे. इन विट्रो में ^{एन डी} 2 दिन में शुरू, संस्कृतियों के कुछ थे या तो (50 एनएम) PMA, एक phorbol PKC या DHPG (10 सुक्ष्ममापी), एक mGluR1 agonist उत्तेजक एस्टर, के साथ इलाज किया जब तक संस्कृतियों तय किया गया. दोनों यौगिकों पहले दिखाया गया है को रोकना और Purkinje सेल ⁷ वृक्ष के समान विकास, ^{8, 9, 5} सीमा.अनुपचारित नियंत्रण में स्लाइस Purkinje कोशिकाओं एक ठेठ बड़े और अत्यधिक branched वृक्ष के समान पेड़ है जो या तो विरोधी Calbindin immunostaining (4A चित्रा) या EGFP व्यक्त Purkinje कोशिकाओं के साथ संस्कृतियों में visualized विरोधी GFP (चित्रा 4D) के साथ immunostaining विकसित की है. PMA साथ इलाज संस्कृतियों में वृक्ष के समान पेड़ की आकारिकी गहराई से बदल दिया गया था. dendrites thickened दिखाई दिया और केवल कुछ ही पक्ष शाखाओं था. कई Purkinje कोशिकाओं, नियंत्रण संस्कृतियों में विपरीत, नहीं रह रहे थे एकध्रुवीय, एक प्राथमिक dendrite सेल शरीर से निकलती है, लेकिन दो या दो से भी अधिक प्राथमिक dendrites (4B चित्रा, ई) का विकास किया है. वृक्ष के समान पेड़ के द्वारा कवर क्षेत्र स्पष्ट रूप से (देखें नीचे) कम हो गया था. एक ऐसी ही स्थिति DHPG का इलाज संस्कृतियों में मौजूद था. Purkinje कोशिकाओं के वृक्ष के समान पेड़ आकार में काफी कम हो गया था और स्पष्ट रूप से शाखाओं में बंटी (चित्रा 4C, एफ) कम हो गया था. हालांकि, वहाँ भी कुछ qualitat थेive मतभेद PMA-इलाज संस्कृतियों की तुलना में. वृक्ष के समान शाखाओं का कोई और अधिक मोटा होना था, और प्राथमिक dendrites कई बहुत ही कम माध्यमिक dendrites किया (चित्रा 4C, एफ) सुझाव है कि संकेत घटनाओं PMA और DHPG का इलाज Purkinje कोशिकाओं में जाने के समान है, लेकिन समान नहीं हो सकता है.

Purkinje सेल वृक्ष के समान पेड़ के आकार और मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए शाखा अंक के मात्रात्मक मूल्यांकन, Purkinje सेल वृक्ष के समान पेड़ और Purkinje सेल प्रति शाखा अंक की संख्या के आकार के ऊपर वर्णित के रूप में मापा जाता है. कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों से परिणाम के साथ जमा कर रहे हैं, और 20 कोशिकाओं की एक न्यूनतम जा विश्लेषण करने की जरूरत है. नियंत्रण प्रयोगों के लिए वृक्ष के समान पेड़ों से कवर क्षेत्र का मतलब निर्धारित की है और 100% के रूप में सेट, और अन्य प्रयोगों के लिए मूल्यों प्रतिशत तदनुसार मूल्यों के रूप में व्यक्त कर रहे हैं. डेटा के सांख्यिकीय विश्लेषण GraphPad चश्मे सॉफ्टवेयर के साथ किया जाता है. क्योंकि हम नहीं करतेमान लेते हैं कि सभी निर्धारित मूल्यों एक गाऊसी वितरण का हिस्सा हैं, हम सांख्यिकीय परीक्षण है कि मापा मूल्यों के इस तरह के एक वितरण मान नहीं है का उपयोग करें. सांख्यिकीय महत्व के लिए कई शर्तों और परीक्षण की तुलना करने के लिए, हम Kruskal वालिस पोस्ट रैंक आधारित आँकड़े के लिए अस्थायी परीक्षण के लिए एक उचित प्रक्रिया के बाद परीक्षण के रूप में, उदाहरण के लिए, Dunn GraphPad चश्मे में पोस्ट परीक्षण में लागू है, का उपयोग करें. परिणाम आम तौर पर बार रेखांकन के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं. चित्रा 5 में इस तरह के एक सांख्यिकीय मूल्यांकन का एक उदाहरण दिया जाता है. दोनों वृक्ष के समान पेड़ के आकार का विश्लेषण (चित्रा 5A) और Purkinje सेल प्रति शाखा अंक (चित्रा 5 ब) की संख्या, नियंत्रण हालत और DHPG या PMA उपचार के बीच स्पष्ट मतभेद दिखा. दोनों मापदंडों परीक्षण Kruskal वालिस अनुसार पी <0.001 के एक सांख्यिकीय महत्व के साथ अलग थे.

Figu1 रहे हैं. EGFP Purkinje सेल लेबल. Pcp2 EGFP चूहों में सभी Purkinje कोशिकाओं व्यक्त EGFP नहीं. इसलिए, कुछ Purkinje कोशिकाओं के वृक्ष के समान पेड़ों को व्यक्तिगत रूप से देखा जा सकता है जब वे नहीं करते EGFP एक्सप्रेस (एक में EGFP चैनल) और अतिव्यापी वृक्ष के समान के पेड़ के साथ पड़ोसी Purkinje कोशिकाओं (EGFP चैनल में नकारात्मक एक में दिखाया गया है, सकारात्मक विरोधी Calbindin दिखाया धुंधला हो जाना बी में लाल चैनल में). पैमाने बार = 50 सुक्ष्ममापी.

चित्रा 2. Purkinje कोशिकाओं के वृक्ष के समान मानकों के मापन (A). वृक्ष के समान पेड़ के आकार Purkinje सेल की रूपरेखा अनुरेखण छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर छवि प्रो में एक माउस क्लिक के साथ प्लस जादू की छड़ी उपकरण का उपयोग करके आसानी से मापा जा सकता है. जादू की छड़ी उपकरण ऐसी है कि पूरे वृक्ष के समान सेल सोमा और सभी वृक्ष के समान शाखाओं सहित पेड़ पूरी तरह से लाइन से घेर लिया जाता है प्रयोग किया जाता है. (बी). शाखा अंक की संख्या cou हैPurkinje कोशिकाओं की छवियों में मैन्युअल nted. एक पीले रंग की बिंदी के साथ प्रत्येक शाखा बिंदु के रूप में चिह्नित है. पैमाने बार = 50 सुक्ष्ममापी.

चित्रा 3. Purkinje सेल वृक्ष के समान पेड़ के विकास की निगरानी ूकार पता लगाए गए Purkinje कोशिकाओं. बार - बार फोटो खिंचवाने गया वृक्ष के समान पेड़ के विकास पर नजर रखने के. (एसी): एक Purkinje सेल के वृक्ष के समान पेड़ से बढ़ रहा है और विकास से दिन DIV7 तक में इन विट्रो (DIV) 2. सतत विकास और इस संस्कृति की अवधि के दौरान dendrites के शाखाओं में बंटी है. (लोमो): एक Purkinje सेल के वृक्ष के समान पेड़ से बढ़ रहा है और विकास DIV11 तक DIV4 से. वृक्ष के समान पेड़ इस संस्कृति की अवधि के दौरान काफी हद तक फैलता है. पैमाने बार = 50 सुक्ष्ममापी.

चित्रा 4. Purkinje सेल वृक्ष के समान पेड़ के विकास PKC या mGluR1 stimulati से हिचकते(ए), (डी): एक अच्छी तरह से विकसित वृक्ष के समान पेड़ के साथ इलाज नियंत्रण कक्ष. (बी) (ई): PMA उपचार dendrites के 9 दिनों के बाद thickened दिखाई देते हैं और वृक्ष के समान पेड़ दृढ़ता से आकार में कम हो जाता है. कोशिकाओं को अक्सर उनके ध्रुवीकरण खो और द्विध्रुवी (ई) हो. (सी), (एफ): DHPG उपचार के 9 दिनों के बाद वृक्ष के समान पेड़ आकार में काफी कम है. PMA उपचार में विपरीत, कई बहुत ठीक है और कम पक्ष शाखाओं प्राथमिक और माध्यमिक dendrites पर मौजूद हैं. कोशिकाओं को अक्सर उनके ध्रुवीकरण खो और द्विध्रुवी (एफ) हो. EGFP अभिव्यक्ति (सी ए) और (डी - एफ) में Pcp2 EGFP चूहों से व्युत्पन्न संस्कृतियों में Purkinje कोशिकाओं विरोधी Calbindin immunostaining द्वारा में visualized थे. पैमाने बार = 50 सुक्ष्ममापी.

चित्रा 5. Purkinje सेल वृक्ष के समान पेड़ के आकार और शाखाओं में बंटी मात्रात्मक माप के मात्रात्मक मूल्यांकन बताते हैं कि दोनों वृक्ष के पेड़ (ऊपरी बार ग्राफ) आकार और numbeशाखा अंक (निचला बार ग्राफ) के आर PMA या DHPG उपचार के बाद बहुत कम कर रहे हैं. नियंत्रण वृक्ष के समान पेड़ों और संस्कृतियों से इलाज Purkinje कोशिकाओं के वृक्ष के समान के पेड़ के बीच अंतर पी के साथ महत्वपूर्ण <0.001 थे.

Discussion

तरीके यहाँ प्रस्तुत organotypic अनुमस्तिष्क टुकड़ा संस्कृतियों में Purkinje सेल वृक्ष के समान विकास का अध्ययन और मात्रात्मक वृक्ष के समान पेड़ आकार और वृक्ष के समान शाखा अंक की संख्या को मापने के द्वारा Purkinje सेल वृक्ष के समान विस्तार का मूल्यांकन करने की अनुमति है. बेशक, एक अधिक व्यापक और परिष्कृत Purkinje सेल dendrites के मात्रात्मक विश्लेषण संभव है, उदाहरण के लिए कुल वृक्ष के समान लंबाई निर्धारित करने, एक Sholl विश्लेषण प्रदर्शन या वृक्ष के समान पेड़ के भग्न आयाम निर्धारित है. विश्लेषण के इस प्रकार के लिए यह आम तौर पर करने के लिए स्वयं एक विश्लेषण कार्यक्रम में न्यूरो ल्युसिडा उदाहरण के लिए पूरे Purkinje सेल वृक्ष के समान पेड़ का पता लगाने की आवश्यकता है. जबकि इन अधिक परिष्कृत तरीके निश्चित रूप से विश्लेषण (जैसे ^{6 1,} देखें) के एक वरिष्ठ स्तर उपज, वे और अधिक समय लगता है और अधिक विशेष उपकरणों और है यहाँ प्रस्तुत तरीकों की तुलना में विश्लेषण सॉफ्टवेयर की आवश्यकता होती है. सबसे अनुप्रयोगों के लिए, विशेष रूप से स्थितियों में जहां परिवर्तनPurkinje सेल dendrites में काफी और गुणात्मक दिखाई हैं, सरल प्रस्तुत तरीकों लिए पर्याप्त होना होगा थे. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि organotypic अनुमस्तिष्क टुकड़ा संस्कृतियों P8 चूहों से प्राप्त केवल Purkinje सेल वृक्ष के समान विकास के बाद के चरण के वृक्ष के समान तेजी से विस्तार से विशेषता को कवर किया जाएगा चाहिए. पहले चरण के अध्ययन के लिए, टुकड़ा संस्कृति विधि नवजात या भ्रूण जो जानवरों तो वृक्ष के समान विकास के पहले चरण ⁽² उदाहरण के लिए) को कवर किया जाएगा से स्लाइस के लिए अनुकूलित किया जा जरूरत है.

विरोधी Calbindin immunostaining और EGFP Purkinje कोशिकाओं को व्यक्त करने के साथ चूहों के उपयोग: organotypic अनुमस्तिष्क टुकड़ा संस्कृतियों में Purkinje कोशिकाओं के दृश्य के लिए, हम केवल दो नियमित तरीकों पर ध्यान केंद्रित किया है. बेशक अधिक तरीके उपलब्ध हैं, फ्लोरोसेंट प्रोटीन, एकल Purkinje कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट रंजक और intracellular डाई इंजेक्शन के साथ diolistic लेबलिंग के साथ विशेष biolistic या वायरल अभिकर्मक में. अध्ययन और इन तरीकों में काफी Purkinje सेल वृक्ष के समान आकारिकी के विश्लेषण के स्तर में वृद्धि कर सकते हैं, उदाहरण के लिए वृक्ष के समान spines confocal या दो photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग का विश्लेषण करके प्रयोगशाला में उपलब्ध उपकरणों की आवश्यकताओं पर निर्भर करता है.