マウス気管から基底細胞および粘膜下腺管細胞の単離
Summary
ここでは、マウスの気管から基礎および粘膜下腺管細胞を単離するための我々のプロトコルを示しています。また、作成するために背マウス脂肪パッドに幹細胞を注入する方法を実証<em生体内で></em粘膜下腺の再生>モデル。
Abstract
大気道が1と我々は息毒素や感染性病原体による損傷することが影響を受けやすい環境と直接接触しており、。大気道が故に、私たちの体を守るための効率的な修復機構を必要とします。この修復プロセスは、気道内の幹細胞から発生し、気道から、これらの幹細胞を単離する修復および再生のメカニズムを理解する上で重要である。これは、気道疾患2につながることができます異常な修理を理解するためにも重要である。この方法の目的は、マウス気管粘膜下腺管から新規幹細胞集団を単離するために、粘膜下腺の3修復および再生のメカニズムを識別するために、in vitroおよび in vivoモデル系において 、これらの細胞を配置することです。この生産は、大規模な気道3からダクトおよび基底幹細胞を分離し、アッセイするために使用できる方法を示していますこれは、私たちを許可します嚢胞性線維症、喘息および慢性閉塞性肺疾患などの気道の疾患を研究する。現在、粘膜下腺管細胞を単離するためのメソッドはありませんし、粘膜下腺の再生を研究するin vivoモデルでは存在しています。
Protocol
Discussion
気道からダクトおよび基底細胞を単離するために、この手法は、気道の修復及び再生及び気道疾患の我々の理解を向上させるために重要である。ここで説明する手法は、いくつかの重要なステップがあります。第一は、最適化された酵素消化期間です。第二は、細胞の毛刈りを防止するだけでなく、細胞塊を分割するために徐々に高くゲージ針で継シリアルを介して単一細胞懸濁液を作成す?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、ブロード幹細胞研究センターのFACSを認識し、特に細胞選別を持つ彼らの助けのためにジェシカ·スコールズとフェリシアCodreaに感謝したいと思います。仕事がCIRM RN2-00904-1、K08 HL074229、米国胸部学会/ COPD財団ATS-06から065、懸念財団、UCLAのジョンソン総合がんセンター胸部腫瘍学プログラム/肺がんの胞子、カリフォルニア大学がんによって資金を供給された研究調整委員会とグウィンハーゼンチェリーメモリアル研究所（BG）。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number |
| Complete medium 10: DMEM-F-12 , 50/50, 1X) |
Mediatech | 15-090-CV |
| Hepes (15 mM) | Invitrogen | 15630 |
| Sodium bicarbonate (3.6mM or 0.03%) | Invitrogen | 25080 |
| L-glutamine (4 mM) | Mediatech | 25-005-Cl |
| Penicillin (100 U/ml) | Mediatech | 30-001-CI |
| Streptomycin (100 μg/m) | Mediatech | 30-001-CI |
| Amphotericin B (0.25 μg/ ml) | Lonza | 17-836R |
| Insulin (10 μg/ml) | Sigma | I6634 |
| Transferrin (5 μg/ml) | Sigma | T1147 |
| Cholera toxin (0.1 μg/ml) | Sigma | C8052 |
| Epidermal Growth Factor (25 ng/ml) | BD | 354001 |
| Bovine Pituitary Extract (30 μg/ml) | Invitrogen | 13028-014 |
| Fetal Bovine Serum (5%) | Fisher | SH3008803HI |
| Retinoic acid (0.05 μM) | Sigma | R2625 |
| Growth Factor Reduced Matrigel | BD | 354230 |
Table 1. Complete media components.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Pronase | Roche | 10165921001 | Used at 0.15%: -o/n at 4 °C digestion to isolate total tracheal cells (for ALI culture) -4 hr digestion 4 °C to isolate SMG |
| Dispase | BD Biosciences | 354235 | Used at 16 Units: 30 min at RT |
| DNase I | Sigma | DN25 | Used at 0.5 mg/ml: 20-30 min at RT |
Table 2. Enzymes used for enzymatic digestion of the trachea.
References
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