Summary

成体マウスの卵形嚢とアデノウイルス媒介助演細胞感染の解剖

Published: March 28, 2012
doi:

Summary

機械刺激有毛細胞は、内耳の受容細胞である。最高の特徴<em> in vitroで</em成熟した哺乳類の有毛細胞の>モデルシステムでは、成体マウスからutriclesの器官培養を利用しています。我々は、成体マウスの卵形嚢の解剖を提示し、我々は培養utriclesで支持細胞のアデノウイルス媒介性感染症を示しています。

Abstract

聴力損失とのバランス障害は、しばしば内耳の受容細胞である機械刺激有毛細胞の死によって引き起こされます。満足哺乳類の有毛細胞を表すには細胞株が存在しないため、有毛細胞の研究は主要な器官培養に依存しています。成体マウス( 1)1-6からutriclesの器官培養を利用して成熟した哺乳類の有毛細胞 in vitroモデル系では最高を特徴とする。卵形嚢、前庭器官であり、卵形嚢の有毛細胞は、聴覚器官、コルチ器官の有毛細胞の構造と機能の両方に似ています。成体マウスの卵形嚢の準備は、生存、恒常性、およびこれらの細胞死を制御する分子シグナルの研究のための成熟した感覚上皮を表しています。

哺乳類の蝸牛有毛細胞は、分化され、それらが失われた場合、再生成されていません。非哺乳類の哺乳類、脊椎動物、聴覚または前庭有毛細胞の死は、聴覚やバランス機能7、8を復元する堅牢な再生が続いている。有毛細胞の再生は、感覚上皮9、10に有毛細胞の基底面を連絡グリア細胞のような支持細胞によって媒介される。支持細胞はまた、有毛細胞の生存および死亡11の重要なメディエーターである。我々は最近、アデノウイルスを用いて培養utricles内のセルをサポートしている感染の技術を開発した。 CMVプロモーターの制御下にGFPを含むトランスジーンを提供するためにアデノウイルス5型(dE1/E3)を使用して、我々は特にそのアデノウイルスを見つけ、効率的に支持細胞に感染します。支持細胞の感染効率は約25から50パーセントであり、有毛細胞は( 図2)感染していない。重要なのは、我々は、Ad-GFP infファイル内のセル数としてサポートしている細胞のアデノウイルス感染は、有毛細胞または支持細胞への毒性にはなりません見つけるected utriclesは、非感染utricles( 図3)と同等です。したがって、培養utriclesの支持細胞のアデノウイルス媒介遺伝子発現は、有毛細胞の生存、死亡、そして再生のメディエーターとして支持細胞の役割を研究する強力なツールを提供しています。

Protocol

1。卵形嚢解剖と文化承認されたプロトコルと首をはねるを用いた成体(4週齢以上)マウスを安楽死させる。 頭の両側に外耳道を切り取ると、鼻に向かって前方に肌を引き出します。後ろから前に頭を二分し、骨迷路を明らかにするために両側から脳を削除します。 離れて骨の蝸牛から頭蓋骨をトリミングして、解剖顕微鏡(注:アデノウイルス作業はクラスIIの生物?…

Discussion

感覚毛細胞が老化、騒音外傷、およびアミノグリコシド系抗生物質と抗がん剤のシスプラチンを含む耳毒性薬物への暴露を含むさまざまなストレスによって引き起こされる死への影響を受けています。永久的な聴力損失および/ ​​またはバランスの乱れの哺乳類の有毛細胞死の結果に表示されます。in vitroのモデル系では、細胞および分子メカニズムの根底にある有毛細胞の死…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、難聴やその他のコミュニケーション障害の国立研究所の学内研究部門によってサポートされていました。追加のサポートがNIDCD 5R01 DC007613によって提供されました。

Materials

Reagent Company Catalog number
Medium 199 Gibco/Invitrogen 12350
DMEM/F12 Gibco/Invitrogen 11320
Fine forceps (#55) Fine Science Tools 11255-20
Fine forceps (#5) Fine Science Tools 11252-30
Forceps (#3) Fine Science Tools 11231-30
Penicillin G Sigma P3032
Fetal bovine serum Invitrogen 10082-139
Nunc mini-tray Fisher 12-565-68
Adenovirus-GFP Vector Biolabs 1060*
Cal-Ex decalcifier Fisher CS510-1D
sodium borohydride Sigma 452882
Anti-Myosin 7a (polyclonal) Proteus Biosciences 25-6790
Anti-Myosin 7a (monoclonal) Developmental Studies Hybridoma Bank MYO7A 138-1
Anti-Calmodulin Sigma C 3545
Anti-Calbindin Chemicon AB1778
Fluoromount G Southern Biotechnology Associates 0100-01

Table 1. Reagents and tools used in utricle culture and adenovirus infection.

* Note: Ad-GFP is normally provided by Vector Biolabs at a stock titer of 1×1010 PFU/ml. We requested a custom amplification in order to provide the stock virus at a titer of 1.2×1011 PFU/ml.

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Brandon, C. S., Voelkel-Johnson, C., May, L. A., Cunningham, L. L. Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection. J. Vis. Exp. (61), e3734, doi:10.3791/3734 (2012).

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