Mechanosensory волосковых клеток рецепторных клеток внутреннего уха. Наиболее характерны В пробирке Модель системы зрелые клетки млекопитающих волосы использует орган культур Мешочки из взрослых мышей. Мы представляем вскрытии взрослого маточки мыши, и мы демонстрируем аденовирус-опосредованной инфекции опорных клеток в культуре Мешочки.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Препарирование взрослых маточки мыши и аденовирус-опосредованный опорно-клетки инфекции
В этой статье
Уведомление об исправлении
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Краткое содержание
Аннотация
Потеря слуха и равновесия нарушения часто бывают вызваны смертью mechanosensory волосковых клеток, которые являются рецепторных клеток внутреннего уха. Поскольку не существует клеточная линия, удовлетворительно представляет клетках млекопитающих волосы, исследование волосковых клеток основывается на первичных культурах органа. Наиболее характерны в пробирке модель системы зрелые клетки млекопитающих волосы использует орган культур Мешочки из взрослых мышей (рис. 1) 1-6. Мешочке находится вестибулярный орган и волосковых клеток утрикулюса схожи по структуре и функции волосковых клеток слухового органа, органа Корти. Маточки взрослой мыши Препарат представляет собой зрелый сенсорного эпителия для изучения молекулярных сигналов, которые регулируют выживание, гомеостаз, и смерти этих клеток.
Млекопитающих кохлеарные волосковые клетки терминально дифференцированные и не восстанавливаются в случае их утраты. В не-маммалийских позвоночными, слуховой и вестибулярной гибели клеток волос сопровождается надежной регенерации, восстанавливает слуха и равновесия функций 7, 8. Регенерации волосковых клеток опосредуется глии, как поддерживающие клетки, которые контактируют с базальной поверхности волосковых клеток чувствительного эпителия 9, 10. Поддержка клетки также являются важными посредниками волос выживания и гибели клеток 11. Недавно мы разработали методику инфекции опорных клеток в культуре Мешочки использованием аденовируса. Использование аденовируса типа 5 (dE1/E3) для доставки трансгена содержащие GFP под контролем промотора CMV, мы обнаружили, что аденовирус конкретно и эффективно заражает опорных клеток. Поддержка эффективности ячейки инфекции составляет примерно 25-50%, а волосковые клетки не заражены (рис. 2). Важно отметить, что мы обнаружили, что аденовирусная инфекция опорных клеток не приводит к токсичности для волосковых клеток или поддерживающие клетки, а клеток в Ad-GFP инфected Мешочки эквивалентны тем, кто в неинфицированных Мешочки (рис. 3). Таким образом, аденовирус-опосредованной экспрессии генов в клетках поддержки культурных Мешочки предоставляет мощный инструмент для изучения роли опорных клеток в качестве посредников волос выживаемость клеток, смерть и возрождение.
Протокол
1. Вскрытие мешочке и культуры
- Эвтаназии взрослых (4-недельного возраста и старше) мыши, используя утвержденного протокола и обезглавить.
- Надрез наружный слуховой проход по обеим сторонам головы и подтягивает кожу вперед, к носу. Пополам голову задом наперед и удалять мозга с обеих сторон, чтобы выявить костный лабиринт.
- Обрежьте черепа от костной улитки и передает костного лабиринта (в том числе буллы) на капот культуры тканей оснащен рассечения микроскопа (примечание: аденовирус работа должна быть выполнена в класс II бокса биологической безопасности).
- В капот, передавать друг улитки для 35мм блюдо культуры ткани со стерильн....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Сенсорные волосковые клетки чувствительны к смерти от различных стрессов, включая старение, шум травмы, и воздействие ототоксичных наркотиков, в том числе аминогликозидов и противоопухолевое средство цисплатин. У млекопитающих волосы гибель клеток приводит к постоянной потере слуха и / или нарушение равновесия. В системах пробирке модели важными инструментами для исследований, направленных на определение клеточных и молекулярных механизмов, лежащих в основе смерти волосковых клеток, а также те, которые.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Эта работа была поддержана Отделом Внутренние исследования в Национальном институте глухоты и других расстройств общения. Дополнительная поддержка была оказана NIDCD 5R01 DC007613.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Реагенты О компании Номер по каталогу | |||
| Среды 199 | Gibco / Invitrogen | 12 350 | |
| DMEM/F12 | Gibco / Invitrogen | 11 320 | |
| Fine щипцы (# 55) | Изобразительных средств наук | 11255-20 | |
| Fine щипцы (# 5) | Изобразительных средств наук | 11252-30 | |
| Щипцы (# 3) | Изобразительных средств наук | 11231-30 | |
| Пенициллин G | Sigma | P3032 | |
| Фетальной телячьей сыворотки | Invitrogen | 10082-139 | |
| Nunc мини-поднос | Fisher | 12-565-68 | |
| Аденовирус-GFP | Векторные Biolabs | 1060 * | |
| Cal-Ex decalcifier | Fisher | CS510-1D | |
| Боргидрид натрия | Sigma | 452882 | |
| Защита от миозина 7а (поликлональных) | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| Защита от миозина 7а (моноклональные) | Исследования развития Hybridoma банка | MYO7A 138-1 | |
| Защита от Кальмодулин | Sigma | С 3545 | |
| Защита от кальбиндин | Chemicon | AB1778 | |
| Fluoromount G | Южный биотехнологии Associates | 0100-01 |
Таблица 1. Реагенты и инструменты, используемые в мешочке культуры и аденовирусной инфекции.
* Примечание: Ad-GFP обычно обеспечивается векторные Biolabs на фондовой титр 1x10 10 БОЕ / мл. Мы просили пользовательского усиления, чтобы обеспечить запас вируса в титре 1,2 × 10 11 БОЕ / мл.
Ссылки
- Cunningham, L. L. The adult mouse utricle as an in vitro preparation for studies of ototoxic-drug-induced sensory hair cell death. Brain Res. , (2006).
- Schmitt, N. C., Rubel, E. W., Nathanson, N. M. Cisplatin-induced hair cell death ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Исправление
Formal Correction: Erratum: Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection
Posted by JoVE Editors on 4/17/2012. Citeable Link.
null
