Dissectie van volwassen muis Utricle en Adenovirus-gemedieerde Ondersteunende-cel infectie

Summary

Mechanosensorische haarcellen zijn de receptor cellen van het binnenoor. De meest kenmerk

Abstract

Gehoorverlies en evenwichtsstoornissen worden vaak veroorzaakt door de dood van mechanosensorische haarcellen, die de receptor cellen van het binnenoor. Omdat er geen cellijn die naar tevredenheid is zoogdier haarcellen, onderzoek naar haarcellen is gebaseerd op primaire orgaan culturen. De beste kenmerk vitro modelsysteem van volwassen zoogdieren haarcellen gebruikt orgaankweken van utricles van volwassen muizen (figuur 1) ^1-6. De utricle is een vestibulaire orgaan, en de haarcellen van het utricle zijn vergelijkbaar in zowel structuur als functie om de haarcellen in het gehoororgaan, het orgaan van Corti. De volwassen muis utricle voorbereiding is een volwassen sensorische epitheel voor de studie van de moleculaire signalen die het overleven, homeostase, en de dood van deze cellen te reguleren.

Zoogdieren cochleaire haarcellen zijn terminaal gedifferentieerd en niet wordt geregenereerd wanneer ze verloren zijn. In niet-mamMalinese gewervelde dieren, auditieve of vestibulaire haar celdood wordt gevolgd door robuuste regeneratie die gehoor en evenwicht functies ^{7, 8} herstelt. Hair celregeneratie wordt gemedieerd door glia-achtige ondersteunende cellen, die de basolaterale oppervlak van haarcellen contact op te nemen in de sensorische epitheel ^{9, 10.} Ondersteunende cellen zijn ook belangrijke mediatoren van haar overleving van de cel en de dood ^11. We hebben onlangs een methode voor infectie van cellen in cultuur ondersteunen utricles met adenovirus. Met adenovirus type 5 (dE1/E3) een transgen met GFP onder de controle van de CMV promoter leveren wij dat adenovirus specifiek en efficiënt infecteert ondersteunende cellen. Steun cel infectie-efficiëntie ongeveer 25-50% en haarcellen niet geïnfecteerd (figuur 2). Belangrijk vinden we dat adenovirale infectie van ondersteunende cellen niet leidt tot toxiciteit voor haarcellen of ondersteunende cellen, zoals cellen in Ad-GFP infected utricles gelijkwaardig zijn aan die in niet-geïnfecteerde utricles (figuur 3). Zo adenovirus-gemedieerde genexpressie in de ondersteuning van cellen van gekweekte utricles biedt een krachtig instrument om de rol van ondersteunende cellen als mediatoren van haar overleving van de cel, de dood en regeneratie te bestuderen.

Protocol

1. Utricle Dissection en Cultuur

1. Euthanaseren van een volwassene (4 weken oud of ouder) muis met behulp van een goedgekeurd protocol en te onthoofden.
2. Knip de uitwendige gehoorgang aan beide zijden van het hoofd en trek de huid naar de neus. Halveren het hoofd van achter naar voren en verwijder de hersenen van beide zijden om de benige labyrint te onthullen.
3. Knip de schedel uit de buurt van het benige slakkenhuis en de benige labyrint (inclusief de bulla) om een ​​weefselkweek kap uitgerust met een dissectie microscoop te dragen (Let op: Adenovirus werk moet worden uitgevoerd in een klasse II biologische veiligheids-kast).
4. In de kap, breng elke slakkenhuis met een 35mm weefselkweek schotel met steriel dissecteren media (M199, Gibco / Invitrogen # 12350) (figuur 1a).
5. Als de auditieve bulla nog intact (het is mogelijk om de bulla verwijderen tijdens de bruto ontleding door uw miniatuur tussen bulla en de top vanhet slakkenhuis), gebruik maken van twee tang (een # 3 en een # 5) aan de bulla (Figuur 1B) te breken.
6. Identificeer de bezienswaardigheden van het benige slakkenhuis voorbereiding: top, basis, gehoorbeentjes, ovaal en ronde ramen, VIIIe zenuwwortel, halfcirkelvormige kanalen (zie figuur 1 C, D).
7. Plaats het binnenoor in de schaal met de mediale zijde naar boven, zodanig dat de ovaal en ronde ramen en de top bevinden zich op de bodem van de schaal en de VIIIe zenuwwortel naar boven wijst. Houd de preparatie met een tang # 3 in het gebied van de halfcirkelvormige kanalen (figuur 1D).
8. Met behulp van een scalpel uitgerust met een # 11 mes, sneed de top van het slakkenhuis net apicaal van de zenuwwortel (figuur 1D).
9. Draai de voorbereiding, zodat het gemaaide deel wordt naar boven. Gebruik de voorste halfrond kanaal als een handvat voor het opmaken van (figuur 1E) te stabiliseren.
10. Met behulp van # 5 tang, verwijder het slakkenhuis in het modiolus naar benedende basis. Op het punt waar de haak gebied van de cochlea gaat naar beneden, met een fijne sonde (de helft van een gebroken # 55 tang) tot de laatste benige plank van de benige lamina spiraal (figuur 1F) op te heffen, het openbaren van de sacculus. Net onder de sacculus is de stijgbeugel voetplaat, dat is een belangrijke mijlpaal. De utricle is direct naast de stijgbeugel voetplaat (figuur 1G), en het is omgeven door bot. Gebruik de sonde naar de been weg chip voldoende licht ongeveer 1/3 van de utricle. Verwijder voorzichtig de utricle met behulp van # 55 tang (figuur 1H). Deze procedure zal meestal resulteren in het verwijderen van de gepigmenteerde epitheel dak als de utricle wordt getrokken uit de benige voorbereiding. Indien de utricle verwijderd met het dak epitheel intact, het dak worden verwijderd met een pincet # 55.
11. Utricles voor adenovirus infectie (of live-imaging experimenten) moeten de otoconia verwijderd tijdens de dissectie (voorafgaand aan de infectie).In dit geval gebruik maken van een luer-lock spuit die gevuld is met het ontleden van media en voorzien van een kleine naald (meestal 26-28 meter). Houd de utricle aan de rand met behulp van # 55 tang (figuur 1 I). Breng de naald in de buurt van de utricle met de afschuining van de naald naar beneden. Gebruik een stroom van het ontleden van media op te blazen uit de otoconia (Figuur 1J). Als alternatief kan otoconia worden verwijderd door borstelen ze af met behulp van een wimper tool (Ted Pella, Inc # 113). Utricles die niet gaan adenovirale infectie ondergaan zijn normaal gekweekte vrij zwevend in 24-well kultuur platen met de otoconia intact (zie hieronder voor post-fix otoconia verwijderen, dat is makkelijker).
12. Zodra alle utricles worden ontleed, wijzigt u de ontleden media om steriele voedingsbodems: DMEM F12 (Gibco # 11320), aangevuld met 5% FBS en 50 U / ml penicilline G (Sigma).
13. Utricles gekweekt bij 37 ° C en _5% CO2. Als culturen worden maintaINED voor meer dan 48 uur, moet de helft van de voedingsbodems worden veranderd om de dag. Culturen kunnen worden gehandhaafd voor een week of langer.

2. Adenovirus Infectie van Ondersteunende cellen

Belangrijk: Werken met adenovirus vereist Biosafety Level 2 (BSL2) procedures en certificaten. Neem contact op met uw Institutionele bioveiligheid Officer voor begeleiding en opleiding op het BSL2 procedures.

1. Ontleden utricles zoals hierboven in de dissectie media (geen serum). Verwijder otoconia als hierboven.
2. Als u klaar bent om te besmetten, over te dragen een utricle (haarcellen boven) in elk putje van een Nunc mini-tray (Fisher # 12-565-68) met 15 ul serum-vrij DMEM F12 (dit is belangrijk, omdat serum kunnen inactiveren het virus) . Deze overdracht is makkelijker met een 1,5 mm microcurette (# 10082-15 van Fine Science Tools).
3. De Ad-GFP serotype 5 met de virale verwijderd E1 en E3 genen en de humane CMV promoter de transgENE (GFP). Dit virus werd verkregen van Vector BioLabs (Philadelphia, PA vectorbiolabs.com ). Stock virussen zijn aangebracht aan titers van 1,0-4,0 x 10 ¹⁰ pfu / ml. Voeg 0.5-2 ul voorraad virus aan elk putje met een utricle (figuur 1 liter). De werkelijk gebruikte hoeveelheid varieert, afhankelijk van het virus en voorraad titer. We algemeen infecteren elk utricle met 1.0-4.0 × 10 ⁷ PFU.
4. Cultuur de utricles in virus-bevattende media bij 37 ° C / _5% CO2 gedurende 2 uur. Na 2 uur, terug over te dragen van de utricles om de 24-en weefselkweek plaat met cultuur media met serum. De cultuur van de utricles nacht bij 37 ° C / 5% CO _2.
5. Utricles kan worden de volgende dag voor levende beeldvorming experimenten, of ze kunnen worden vastgesteld haarcellen immunochemische (zie hieronder). Virale transgenexpressie toeneemt in de tijd, dus als transgenexpressie is laag bij 24 uur na infectie kan hijgunstig kweekcellen eens 24 uur in serum-bevattende media. Als je ziet haar cel toxiciteit, vermindering van de hoeveelheid virus.

3. Utricle Fixatie, otoconia verwijderen, en Immunochemie

1. Aan het einde van de kweekperiode vast utricles in 4% paraformaldehyde voor een 3 uren bij kamertemperatuur (een schommelbeweging platform) of overnacht bij 4 ° C. Wash utricles (3 keer, 15 minuten elk) in 0,1 M (1X) fosfaat Sorensen de buffer van pH 7,4. Deze stappen worden uitgevoerd in een 24-well kultuur plaat.
2. Otoconia verwijderen: Opmerking: otoconia moet worden verwijderd voordat adenovirus infectie (zie stap 1.11 hierboven). Echter, utricles niet worden geïnfecteerd worden gekweekt en vast met de otoconia nog intact. In dit geval gebruik maken van de beschreven stappen hier om de otoconia verwijderen na fixatie. Controleer utricles voor de resterende gepigmenteerde dak epitheel. Verwijder voorzichtig het resterende dak epitheel met behulp van twee # 55 forceps. Om de otoconia verwijderen, vervangen Sorensen's fosfaatbuffer met 750-1000 ul Cal-Ex ontkalker (Fisher # CS510-1D). Laat Cal-Ex op utricles gedurende 1 minuut en 40 seconden (niet meer dan 2 minuten). Vervang Cal-Ex met 0,1 M fosfaat Sorensen's buffer en wassen (5 keer, 5 minuten per stuk).
3. Incubeer utricles in natriumboorhydride (Sigma # 452882, 1% in gedeïoniseerd water) voor 10 minuten. Was utricles in 0,1 M fosfaat Sorensen de buffer (5 keer, 5 minuten per stuk).
4. Place utricles in blokkeeroplossing (PBS + 2% bovine serum albumine + 0,8% normaal geitenserum + 0,4% Triton X-100) gedurende 3 uur bij kamertemperatuur op een schommelende platform.
5. Voeg primaire antilichamen en incubeer overnacht bij 4 ° C. Anti-Myosine 7a (ofwel Proteus Biosciences # 25-6790 of # MYO7A 138-1 van de Developmental Studies Hybridoma Bank) op 1:100 in het blokkeren oplossing labels alle haarcellen. Afzonderlijk te labelen striolar en niet-striolar haarcellen, hebben we gebruik gemaakt van een dubbel-label protocol met monoklonale anti-calmoduline (Sigma # C 3545, 1:150) en polyklonale anti-calbindin (Chemicon # AB1778, Temecula, CA, USA, 1:200). Secundaire antilichamen (gewoonlijk Alexa fluor geconjugeerde secundaire antilichamen van Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) verdund in blokkeeroplossing 1:500 en gedurende 4 uur in het donker bij kamertemperatuur op een schommelende platform.
6. Mount utricles op glasplaatjes met Fluoromount-G (Zuid-Biotech, Birmingham, AL, USA).

4. Representatieve resultaten

Utricles gekweekt deze methode vol behouden aanvulling van zowel haarcellen en ondersteunen cellen (Figuur 2). Haarcellen in gezonde culturen te tonen rond nucleaire profielen omgeven door dunne cytoplasmatische regio's die 7a-positieve myosine (figuur 2, bovenste paneel). Ondersteunende cellen (gelabeld met anti-Sox2) zijn kleiner en dicht op elkaar gepakt dan haarcellen (figuur 2, onderste paneel). Adenovirus infecteert 25-50% van de ondersteunende cellen in de utricle en geen haar cellen geïnfecteerd (Figuur 2, Ad-GFP panelen). Opgemerkt dat de optimale werking titer van elk adenovirus dient empirisch te worden bepaald, aangezien haar celdood mogelijk indien de virale titer te hoog is. Bovendien zal gebieden van mechanische schade (veroorzaakt bij de ontleding) nemen van grote hoeveelheden virus. Deze regio's van mechanische beschadigingen zijn gemakkelijk te onderscheiden door een doorlopende lijn van cellen met een zeer hoge niveaus van GFP expressie en ontbrekende haarcellen. Dit in tegenstelling tot de verstrooide GFP expressie in cellen ondersteunen van een onbeschadigd kweek (Figuur 2).

Figuur 1. Utricle Dissection. A:. Auditieve bulla (AB) B:. De bulla is gebroken met behulp van twee stevige tang C: Bony slakkenhuis (RW = ronde venster, S =. stapedial slagader, C = slakkenhuis, ST = stijgbeugel) D: Een scalpel (SB) wordt gebruikt af te snijden de top van het slakkenhuis apicaal van de VIIIe hersenzenuw (8 ^ste N) ASC = voorste halfrond kanaal E..: Het preparaat is stevig vastgehouden met behulp van een # 3 pincet met een vork gestoken in de voorste halfrond kanaal (ASC) en de andere op de buitenste bot (pijlen). Het membraneuze labyrint wordt verwijderd met een pincet F:. Met de membraneuze labyrint verwijderd, de basale beurt aan de benige lamina spiraal zichtbaar is in de buurt van de haak regio. Een fijne sonde wordt daaronder bot plank aan de plank omhoog en (pijl) verwijderen G. Na verwijdering van de sacculus, utricle (U) zichtbaar direct naast de stijgbeugel voetplaat (SF) H:. Utricle (U ) wordt verwijderd met een pincet # 55 (pijl) SF = stapes voetplaat I:.. Utricle met otoconia (O) gedeeltelijk verwijderd eend sensorische epithelium (SE) zichtbaar onder J:. otoconia (O) worden verwijderd uit de utricle met een stroom van media die een injectiespuit voorzien van een 26-gauge naald. De schaduw van de naald (S) is zichtbaar aan de onderzijde van het beeld K. Utricle met otoconia verwijderd en sensorische epithelium (SE) zichtbaar L:. Adenovirale infectie elk utricle (U) in een afzonderlijk en een mini -tray. Ondersteunende cellen worden geïnfecteerd met adenovirus door pipetteren virus in de put (P = Pipet tip).

Figuur 2. Adenovirus-gemedieerde infectie van cellen ondersteunen. Utricles geïnfecteerd met adenovirus rij expressie van green fluorescent protein (GFP-Ad). Afgebeeld zijn confocale beelden van het haar cel laag en de ondersteunende cellaag in hetzelfde gebied van een utricle. Haarcellen zijn gelabeld met een antilichaam tegen Myosine 7a(Magenta). Ondersteunende cellen gelabeld met een antilichaam tegen Sox2 (rood). Schematisch is de structuur van de utricle sensorische epitheel en de ligging van de haarcellen (HC) en ondersteunende cellen (SC). Locaties van confocale (optische) secties in het bovenste (U) en onderste (L) panelen zijn aangegeven met streeplijnen in het schema. Bovenste panelen: In confocale beelden die op het niveau van het haar celkernen, Ad-GFP signaal verschijnt in de ruimten tussen haarcellen en niet overlappen met de haarcel marker Myosine 7a. Onderpanelen: In confocale delen op het niveau van de ondersteunende celkernen, Ad-GFP signaal colocalizes de ondersteunende celmerker Sox-2. Ad-GFP infectie resulteert in een GFP-expressie in de ondersteuning van cellen alleen, en geen haar cellen worden geïnfecteerd.

Figuur 3. Adenovirale infectie niet leiden tot de dood van haarcellen of ondersteunen cellen. Utricles werden geïnfecteerd met Ad-GFP in 4 x 10 ⁸ pfu / ml. Utricles werden gemerkt met antilichamen tegen Myosine 7a (haarcel marker) en Sox2 (ondersteunende cel marker). Haarcel en het ondersteunen van cel-tellingen gelijk waren voor controle utricles en Ad-GFP geïnfecteerd utricles.

Discussion

Haarcellen zijn gevoelig voor de dood veroorzaakt door een veelheid van spanningen, zoals vergrijzing, lawaai trauma, en blootstelling aan ototoxische geneesmiddelen, met inbegrip van het aminoglycoside-antibiotica en het antineoplastische middel cisplatine. Bij zoogdieren haar celdood leidt tot blijvend gehoorverlies en / of balans verstoring. In vitro model systemen zijn essentiële hulpmiddelen voor studies die gericht zijn op het bepalen van de cellulaire en moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan haar celdood, evenals die gericht op het voorkomen of omkeren van haar celdood . In tegenstelling tot de cochleaire haarcellen van volwassen zoogdieren, haar cellen van de utricle goed overleven in cultuur. Utricle haarcellen zijn gevoelig voor de dood van blootstelling aan de dezelfde therapeutische geneesmiddelen die giftig zijn voor cochleaire haarcellen en de cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan ototoxische haar celdood en overleving zijn vergelijkbaar voor zowel utricular en cochleaire haarcellen ^12-18. Bovendien, wanneer verkregen in het utricle model systeem tested in vivo, heeft de utricle voorbereiding bewezen een betrouwbare voorspeller van haar overleving van de cel en de dood in de volwassen slakkenhuis ^{12, 18-21} zijn. De muis utricle voorbereiding stelt ons ook in om de effecten van specifieke eiwitten te onderzoeken door gebruik te maken utricles van transgene en knock-out dieren.

De signalen dat het overleven en de dood van sensorische haarcellen onder stress te bemiddelen worden slecht begrepen. Echter, nieuwe gegevens blijkt dat andere soorten cellen in het binnenoor kunnen een belangrijke rol spelen bij het ​​bepalen of de haarcellen onder stress uiteindelijk leven of sterven ^{11, 22, 23.} Het utricle model systeem kan worden gebruikt om deze kritische cel-cel interacties in een volwassen zoogdier sensorische epitheel te onderzoeken. Adenovirale infectie een werkwijze voor het wijzigen genexpressie in cellen ondersteunen, gemakkelijker studies van de rol (len) ondersteunen cellen in haar celoverleving, dood fagocytose en regeneratie.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medium 199	GIBCO, by Life Technologies	12350
DMEM/F12	GIBCO, by Life Technologies	11320
Fine forceps (#55)	Fine Science Tools	11255-20
Fine forceps (#5)	Fine Science Tools	11252-30
Forceps (#3)	Fine Science Tools	11231-30
Penicillin G	Sigma-Aldrich	P3032
Fetal bovine serum	Invitrogen	10082-139
Nunc mini-tray	Fisher Scientific	12-565-68
Adenovirus-GFP	Vector Biolabs	1060*
Cal-Ex decalcifier	Fisher Scientific	CS510-1D
sodium borohydride	Sigma-Aldrich	452882
Anti-Myosin 7a (polyclonal)	Proteus Biosciences	25-6790
Anti-Myosin 7a (monoclonal)	Developmental Studies Hybridoma Bank	MYO7A 138-1
Anti-Calmodulin	Sigma-Aldrich	C 3545
Anti-Calbindin	Chemicon International	AB1778
Fluoromount G	SouthernBiotech	0100-01
Table 1. Reagents and tools used in utricle culture and adenovirus infection
* Note: Ad-GFP is normally provided by Vector Biolabs at a stock titer of 1x1010 PFU/ml. We requested a custom amplification in order to provide the stock virus at a titer of 1.2×1011 PFU/ml.