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Neuroscience

वयस्क माउस पौधे क सेल और Adenovirus - मध्यस्थता सहायक सेल संक्रमण का विच्छेदन

Published: March 28, 2012 doi: 10.3791/3734
Automatic Translation
1, 2, 3, 3
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 2Department of Microbiology & Immunology, Medical University of South Carolina, 3National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health

ERRATUM NOTICE

Summary

Mechanosensory बालों की कोशिकाओं भीतरी कान की रिसेप्टर कोशिकाओं रहे हैं. सबसे विशेषता

Protocol

1. पौधे क सेल विच्छेदन और संस्कृति

  1. एक वयस्क (उम्र या पुराने के 4 हफ्तों) माउस का उपयोग कर एक अनुमोदित प्रोटोकॉल और सिर काटना Euthanize.
  2. सिर के दोनों पक्षों पर बाहरी श्रवण नहर कटाव और त्वचा नाक की दिशा में आगे खींच. आगे से पीछे से सिर दोटूक करना और दोनों पक्षों से मस्तिष्क बोनी भूलभुलैया प्रकट करने के लिए हटा दें.
  3. खोपड़ी बोनी कोक्लीअ से दूर ट्रिम कर दीजिए और एक टिशू कल्चर एक विदारक खुर्दबीन के साथ सुसज्जित हुड बोनी भूलभुलैया हस्तांतरण (छाला सहित) (नोट: Adenovirus काम द्वितीय श्रेणी जैविक सुरक्षा कैबिनेट में प्रदर्शन किया जाना चाहिए).
  4. हुड में, एक 35 मिमी टिशू कल्चर बाँझ विदारक मीडिया युक्त पकवान (M199 / Gibco Invitrogen 12,350) (चित्रा 1 क) प्रत्येक कोक्लीअ हस्तांतरण.
  5. अगर श्रवण बुल्ला अब भी बरकरार है (यह संभव है कि सकल विच्छेदन दौरान बुल्ला और के शीर्ष के बीच अपने थंबनेल डालने के द्वारा बुल्ला हटाने) कोक्लीअ, दो संदंश का उपयोग करें (एक # 3 और एक # 5) (चित्रा 1 बी) बुल्ला तोड़.
  6. शीर्ष, आधार, ossicles, अंडाकार और दौर खिड़कियों, VIIIth तंत्रिका जड़, semicircular नहरों (चित्रा 1 सी, डी): बोनी कोक्लीअ तैयारी के स्थलों को पहचानें.
  7. पकवान में औसत दर्जे का सामना करना पड़ रहा है, ऐसी है कि अंडाकार और दौर खिड़कियों और शीर्ष पकवान और VIIIth तंत्रिका जड़ के तल पर कर रहे हैं का सामना करना पड़ रहा है पक्ष के साथ भीतरी कान रखें. पकड़ो तैयारी semicircular नहरों (चित्रा 1D) के क्षेत्र में एक # 3 संदंश का उपयोग.
  8. # 11 ब्लेड के साथ सुसज्जित स्केलपेल का उपयोग करना, सिर्फ तंत्रिका जड़ (चित्रा 1D) के शिखर कोक्लीअ के शीर्ष में कटौती.
  9. तैयारी बारी इतनी है कि कटौती भाग का सामना करना पड़ रहा है. तैयारी (चित्र 1E) को स्थिर करने के लिए संभाल के रूप में पूर्वकाल semicircular नहर का उपयोग करने के लिए.
  10. 5 # संदंश का प्रयोग, modiolus में नीचे कोक्लीअ हटानेआधार करने के लिए. बिंदु जहां कोक्लीअ के हुक क्षेत्र के नीचे बदल जाता है, ठीक एक जांच का उपयोग करें (एक टूटी हुई # 55 संदंश के आधे) हड्डीवाला सर्पिल लामिना (चित्रा 1F) के अंतिम बोनी शेल्फ को लिफ्ट, अणुकोश खुलासा. Footplate stapes, जो एक महत्वपूर्ण मील का पत्थर है अणुकोश बस के नीचे है. पौधे क सेल तुरंत stapes footplate (चित्रा 1G) के निकट है, और यह हड्डी से घिरा हुआ है. जांच का प्रयोग करने के लिए हड्डी को दूर चिप 1/3 पौधे क सेल के बारे में खुलासा करने के लिए पर्याप्त है. ध्यान से हटाने के पौधे क सेल # 55 संदंश (1H चित्रा) का उपयोग कर. यह प्रक्रिया आम तौर पर के pigmented छत उपकला हटाने में परिणाम के रूप में पौधे क सेल बोनी तैयारी से खींच लिया है. हालांकि, अगर पौधे क सेल छत अक्षुण्ण उपकला साथ निकाल दिया जाता है, छत # 55 संदंश का उपयोग कर हटाया जा सकता है.
  11. Adenovirus संक्रमण के लिए utricles (या जीना प्रयोगों इमेजिंग) विच्छेदन (संक्रमण के पहले) के दौरान हटा दिया otoconia होना चाहिए.इस मामले में, एक सिरिंज Luer लॉक कि से विदारक मीडिया से भर जाता है और छोटे बोर (आमतौर पर 26-28 गेज) सुई के साथ सुसज्जित का उपयोग करें. # 55 संदंश (चित्रा 1 मैं) का उपयोग कर किनारे पर पौधे क सेल पकड़ो. सुई टिप नीचे ओर इशारा करते हुए सुई के उठाव के साथ पौधे क सेल करने के लिए करीब लाने के लिए. मीडिया otoconia (1J चित्रा) को उड़ाने के लिए विदारक की एक धारा का उपयोग करें. वैकल्पिक रूप से, otoconia उन्हें brushing के बंद एक बरौनी उपकरण (टेड पेला इंक, 113 #) का उपयोग करके हटाया जा सकता है. Utricles कि adenoviral संक्रमण से गुजरना करने के लिए नहीं जा रहे हैं सामान्य रूप से कर रहे हैं मुक्त अस्थायी सुसंस्कृत बरकरार otoconia (परसर्ग otoconia हटाने, जो आसान है के लिए नीचे देखें) के साथ 24 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेटों में.
  12. एक बार सभी utricles विच्छेदित कर रहे हैं, बाँझ संस्कृति मीडिया के लिए और विदारक मीडिया बदलने के लिए: DMEM F12 (# Gibco 11,320) 5% FBS और 50 यू / मिलीलीटर पेनिसिलिन जी (सिग्मा) के साथ पूरक.
  13. Utricles 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में संवर्धित कर रहे हैं. यदि संस्कृतियों mainta हो रहे हैंसे अधिक 48 घंटे के लिए ined हर दूसरे दिन, संस्कृति मीडिया के आधे से परिवर्तित किया जाना चाहिए. संस्कृतियों को एक सप्ताह या उससे अधिक समय के लिए बनाए रखा जा सकता है.

2. सहायक कोशिकाओं की adenovirus संक्रमण

महत्वपूर्ण: adenovirus साथ कार्य करना जैवसुरक्षा स्तर 2 (BSL2) प्रक्रियाओं और प्रमाणीकरण की आवश्यकता है. मार्गदर्शन और BSL2 प्रक्रियाओं पर प्रशिक्षण के लिए अपने संस्थागत जैवसुरक्षा अधिकारी के साथ की जाँच करें.

  1. Utricles के रूप में ऊपर विच्छेदन मीडिया में काटना (कोई सीरम). इसके बाद के संस्करण के रूप में otoconia निकालें.
  2. तैयार जब संक्रमित करने के लिए, की हर अच्छी तरह से में 1 पौधे क सेल (बालों की कोशिकाओं तक) स्थानांतरण (फिशर 12-565-68) मिनी ट्रे 15 μL सीरम मुक्त DMEM F12 (यह महत्वपूर्ण है क्योंकि सीरम वायरस निष्क्रिय कर सकते हैं) युक्त Nunc . इस हस्तांतरण एक 1.5 मिमी microcurette है (# ललित विज्ञान उपकरण से 10082-15) के साथ आसान है.
  3. हमारे विज्ञापन GFP वायरल E1 और E3 नष्ट कर दिया जीन और मानव सीएमवी transg के ड्राइविंग प्रमोटर के साथ 5 सीरोटाइप हैएकदा (GFP). यह वायरस वेक्टर BioLabs (फिलाडेल्फिया, फिलीस्तीनी अथॉरिटी से प्राप्त किया गया था vectorbiolabs.com ). स्टॉक वायरस हैं 1.0-4.0 × 10/10 Pfu मिलीलीटर के titers को प्रदान की जाती हैं. अच्छी तरह से एक पौधे क सेल (1L चित्रा) शामिल प्रत्येक के लिए स्टॉक वायरस का 0.5-2 μl जोड़ें. वास्तविक इस्तेमाल किया राशि वायरस और अनुमापांक स्टॉक पर निर्भर करता है. हम आम तौर पर 1.0-4.0 × 10 7 Pfu साथ प्रत्येक पौधे क सेल संक्रमित.
  4. संस्कृति में utricles वायरस युक्त 37 में मीडिया ° / सी 5% 2 घंटे के लिए सीओ 2. 2 घंटे के बाद, 24 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति सीरम संस्कृति मीडिया के साथ युक्त थाली utricles वापस हस्तांतरण. संस्कृति utricles 37 ° / सी 5% सीओ 2 में रात भर.
  5. रहते इमेजिंग प्रयोगों के लिए utricles अगले दिन इस्तेमाल किया जा सकता है, या वे बाल सेल immunochemistry के लिए तय किया जा सकता है (देखें नीचे). समय के साथ वायरल transgene अभिव्यक्ति बढ़ जाती है, इसलिए यदि transgene अभिव्यक्ति के बाद संक्रमण के 24 घंटे में कम है, यह हो सकता हैसंस्कृति कोशिकाओं एक सीरम युक्त मीडिया में एक अतिरिक्त 24 घंटे के लिए फायदेमंद है. यदि आप बाल सेल विषाक्तता देखने के लिए, प्रयोग किया जाता वायरस की राशि को कम.

3. पौधे क सेल फिक्सेशन, Otoconia की हटाना, और Immunochemistry

  1. संस्कृति की अवधि के अंत में, या तो कमरे Temp पर 3 घंटे के लिए 4% paraformaldehyde के utricles (एक कमाल मंच पर) ठीक है या 4 में रात भर सी. ° 0.1 एम (1x) है Sorensen फॉस्फेट बफर 7.4 पीएच में धो utricles के (3 बार, 15 मिनट प्रत्येक). इन चरणों का 24 अच्छी तरह से एक ऊतक संस्कृति थाली में प्रदर्शन कर रहे हैं.
  2. Otoconia हटाने नोट: Otoconia के adenovirus संक्रमण से पहले हटा दिया जाना चाहिए (1.11 ऊपर कदम देखें). हालांकि, utricles कि संक्रमित नहीं कर रहे हैं और संवर्धित किया जा सकता है अभी भी बरकरार otoconia के साथ तय हो गई है. इस मामले में, यहाँ वर्णित चरणों निर्धारण के बाद otoconia हटाने का उपयोग किसी भी शेष pigmented छत उपकला के लिए utricles का निरीक्षण किया. ध्यान से किसी भी शेष छत दो च # 55 का उपयोग उपकला हटायेंorceps. को otoconia को दूर करने के लिए, 750-1000 μl काल पूर्व decalcifier (फिशर # CS510-1D) के साथ Sorensen फॉस्फेट बफर की जगह. Utricles पर सीएएल पूर्व 1 मिनट और 40 सेकंड (2 मिनट से अधिक नहीं) के लिए छोड़ दें. काल पूर्व 0.1 एम Sorensen फॉस्फेट बफर और धोने (5 बार, 5 मिनट प्रत्येक) के साथ बदलें.
  3. 10 मिनट के लिए सोडियम borohydride में utricles (452,882 # सिग्मा, विआयनीकृत पानी में 1%) सेते हैं. 0.1 एम Sorensen फॉस्फेट बफर (5 बार, 5 मिनट प्रत्येक) में utricles धो लें.
  4. समाधान अवरुद्ध में जगह utricles (पीबीएस + 2% गोजातीय albumin सीरम + 0.8% सामान्य बकरी + सीरम ट्राइटन 0.4% X-100) कमरे के तापमान पर एक कमाल मंच पर 3 घंटे के लिए.
  5. प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें और 4 में रात भर सेते हैं डिग्री सेल्सियस 1:100 अवरुद्ध समाधान लेबल सभी बालों की कोशिकाओं में पर एंटी मायोसिन 7a (या तो बदलनेवाला प्राणी बायोसाइंसेज 25-6790 # या # MYO7A विकास स्टडीज हाइब्रिडोमा बैंक से 138-1). अलग striolar और गैर striolar के बालों की कोशिकाओं लेबल, हम एक डबल लेबल protoco के इस्तेमाल किया हैऔर पॉलीक्लोनल विरोधी calbindin (Chemicon AB1778, Temecula, CA, संयुक्त राज्य अमेरिका, 1:200), मोनोक्लोनल (1:150 सिग्मा # सी 3545) विरोधी calmodulin साथ मैं. माध्यमिक एंटीबॉडी (आमतौर पर Invitrogen, Carlsbad, CA, संयुक्त राज्य अमेरिका से एलेक्सा स्त्राव संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी) अवरुद्ध समाधान में 1:500 पतला कर रहे हैं और एक कमाल मंच पर कमरे के तापमान पर अंधेरे में 4 घंटे के लिए incubated रहे.
  6. कांच Fluoromount जी (दक्षिणी बायोटेक, बर्मिंघम, अल, संयुक्त राज्य अमेरिका) का उपयोग कर स्लाइड पर माउंट utricles.

4. प्रतिनिधि परिणाम

Utricles इस विधि का उपयोग कर भरा बनाए रखने के सभ्य दोनों बालों की कोशिकाओं और समर्थन कोशिकाओं (चित्रा 2) के पूरक हैं. स्वस्थ संस्कृतियों में बालों की कोशिकाओं दौर परमाणु पतली cytoplasmic क्षेत्रों है कि 7a - सकारात्मक मायोसिन से घिरा प्रोफाइल दिखाने के लिए (चित्रा 2, शीर्ष पैनल). सहायक कोशिकाओं (विरोधी Sox2 साथ लेबल) छोटे होते हैं और बालों की कोशिकाओं (चित्रा 2, कम पैनल) की तुलना में अधिक घनी पैक. Adenovirus पौधे क सेल में समर्थन कोशिकाओं के 25-50 प्रतिशत को संक्रमित करता है, और कोई बालों की कोशिकाओं (चित्रा 2, विज्ञापन GFP पैनल) संक्रमित होते हैं. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि प्रत्येक adenovirus के इष्टतम काम कर अनुमापांक अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए, क्योंकि बाल कोशिका मृत्यु संभव है अगर वायरल अनुमापांक भी अधिक है. इसके अलावा, यांत्रिक क्षति (विच्छेदन दौरान कारण) के क्षेत्रों वायरस की बड़ी मात्रा में ले जाएगा. यांत्रिक क्षति के इन क्षेत्रों में आसानी से GFP अभिव्यक्ति और लापता बालों की कोशिकाओं की बहुत उच्च स्तर के साथ कोशिकाओं की एक सतत लाइन से अलग पहचाना. यह undamaged संस्कृति की कोशिकाओं (चित्रा 2) के समर्थन में बिखरे हुए GFP अभिव्यक्ति के विपरीत है.

चित्रा 1
आकृति 1. विच्छेदन पौधे क सेल. एक: श्रवण बुल्ला बी (एबी): बुल्ला दो तगड़ा संदंश का उपयोग कर टूट गया है. सी: बोनी कोक्लीअ (आरडब्ल्यू = दौर खिड़की, एस =stapedial धमनी, सी = कोक्लीअ, अनुसूचित जनजाति = stapes). एक स्केलपेल ब्लेड (एसबी) के लिए रवाना VIIIth कपाल तंत्रिका (8 वें एन) ए एस सी = पूर्वकाल semicircular नहर ई शिखर कोक्लीअ के शीर्ष में कटौती करने के लिए प्रयोग किया जाता है: तैयारी मजबूती से आयोजित किया जाता है एक पूर्वकाल semicircular (एएससी) बाह्यतम हड्डी (तीर) पर नहर और अन्य में डाला कांटा के साथ एक # 3 संदंश का उपयोग कर. झिल्लीदार भूलभुलैया संदंश का उपयोग कर निकाल दिया जाता है: एफ. के साथ झिल्लीदार भूलभुलैया हटाया, हड्डीवाला सर्पिल लामिना का बेसल बारी हुक क्षेत्र के निकट दिखाई देता है. ठीक जांच इस बोनी शेल्फ के नीचे डाला जाता है के लिए शेल्फ उठा और यह (तीर) को हटाने जी: अणुकोश के हटाने के बाद, पौधे क सेल (यू) है तुरंत stapes footplate (एस एफ) के निकट दिखाई देता है एच:. पौधे क सेल (यू ) # 55 संदंश (तीर) का उपयोग कर निकाल दिया जाता है एस एफ = stapes footplate मैं:. otoconia पौधे क सेल (ओ) के साथ आंशिक रूप से हटायाघ संवेदी उपकला (एसई) दिखाई नीचे जम्मू:. Otoconia (का.) एक 26 गेज सुई के साथ फिट सिरिंज द्वारा दिया मीडिया की एक धारा का उपयोग कर पौधे क सेल से हटा रहे हैं. सुई की छाया (एस) छवि के नीचे दिखाई देता है कश्मीर:. adenoviral संक्रमण: पौधे क सेल otoconia हटा और संवेदी उपकला (एसई) दिखाई एल के साथ प्रत्येक पौधे क सेल (यू) के एक व्यक्ति में रखा गया है अच्छी तरह से एक मिनी - ट्रे. सहायक कोशिकाओं adenovirus साथ अच्छी तरह से (पी = pipet टिप) में pipetting वायरस से संक्रमित हैं.

चित्रा 2
चित्रा 2. Adenovirus की मध्यस्थता कोशिकाओं का समर्थन करने के संक्रमण. Utricles, adenovirus हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन की असली अभिव्यक्ति (विज्ञापन GFP) से संक्रमित थे. दिखाया बाल सेल परत और एक पौधे क सेल के एक ही क्षेत्र में सेल परत समर्थन के confocal छवियों हैं. बालों की कोशिकाओं मायोसिन 7a के खिलाफ एक एंटीबॉडी के साथ चिह्नित कर रहे हैं(मैजंटा). सहायक कोशिकाओं से Sox2 (लाल) के खिलाफ एक एंटीबॉडी के साथ लेबल रहे हैं. योजनाबद्ध पौधे क सेल उपकला और संवेदी बालों की कोशिकाओं के स्थानों (एचसी) और समर्थन कोशिकाओं (अनुसूचित जाति) की संरचना से पता चलता है. Confocal (ऑप्टिकल) में दिखाया गया (यू) के ऊपरी और निचले वर्गों के स्थान (एल) पैनल योजनाबद्ध में धराशायी लाइनों द्वारा संकेत कर रहे हैं. ऊपरी पैनल: confocal बाल सेल नाभिक के स्तर पर लिया छवियों में, विज्ञापन GFP संकेत बालों की कोशिकाओं के बीच रिक्त स्थान में प्रकट होता है और बाल सेल मार्कर मायोसिन 7a के साथ ओवरलैप नहीं है. कम पैनल: समर्थन सेल नाभिक के स्तर पर confocal अनुभागों में, विज्ञापन GFP संकेत समर्थन सेल मार्कर Sox-2 के साथ colocalizes. विज्ञापन GFP कोशिकाओं को ही समर्थन में GFP अभिव्यक्ति, और नहीं बालों की कोशिकाओं में संक्रमण परिणाम संक्रमित हैं.

चित्रा 3
चित्रा 3. Adenoviral संक्रमण बालों की कोशिकाओं या समर्थन कोशिकाओं की मौत में परिणाम नहीं करता है. केन्द्र शासित प्रदेशों केricles विज्ञापन GFP के साथ 4 × 10 8 / Pfu मिली संक्रमित थे. Utricles मायोसिन (बाल सेल मार्कर) 7a और Sox2 (सेल मार्कर समर्थन) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ लेबल रहे थे. बालों सेल और कोशिकाओं की गिनती का समर्थन नियंत्रण utricles और विज्ञापन GFP संक्रमित utricles के लिए बराबर थे.

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Discussion

संवेदी बालों की कोशिकाओं सहित उम्र बढ़ने, शोर, और आघात aminoglycoside एंटीबायोटिक दवाओं और अर्बुदरोधी एजेंट cisplatin के ototoxic दवाओं सहित, के लिए जोखिम, तनाव की एक किस्म की वजह से मौत के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं. स्तनधारियों स्थायी सुनवाई हानि और / या संतुलन अशांति में बाल कोशिका मृत्यु के परिणाम में इन विट्रो मॉडल प्रणाली में सेलुलर और आणविक अंतर्निहित बाल सेल मौत तंत्र के रूप में के रूप में अच्छी तरह से रोकने या बाल कोशिका मृत्यु के पीछे के उद्देश्य से उन का निर्धारण करने के उद्देश्य से अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण औजार हैं. . वयस्क स्तनधारियों से cochlear बालों की कोशिकाओं के विपरीत, पौधे क सेल के बालों की कोशिकाओं संस्कृति में अच्छी तरह से जीवित रहते हैं. पौधे क सेल बालों की कोशिकाओं के जोखिम से ही चिकित्सीय औषधियों कि कर्णावत बालों की कोशिकाओं को विषाक्त कर रहे हैं, और सेलुलर अंतर्निहित ototoxic बाल कोशिका मृत्यु और अस्तित्व दोनों पोलो जगह से सम्बधित और कर्णावत बाल कोशिकाओं 12-18 के लिए समान हैं तंत्र के लिए मौत के प्रति संवेदनशील हैं. इसके अलावा, जब पौधे क सेल मॉडल प्रणाली में प्राप्त डेटा ते हैंvivo में sted हैं, पौधे क सेल तैयार करने के लिए बाल सेल अस्तित्व और परिपक्व कोक्लीअ 12, 18-21 में मौत का एक विश्वसनीय कारक साबित हो गया है. माउस पौधे क सेल तैयारी भी हमें ट्रांसजेनिक और पीटा जानवरों से utricles उपयोग के द्वारा विशिष्ट प्रोटीन के प्रभाव की जांच करने के लिए अनुमति देता है.

संकेत है कि अस्तित्व और तनाव के तहत संवेदी बालों की कोशिकाओं की मौत मध्यस्थता खराब समझ रहे हैं. हालांकि, उभरते सबूत से पता चलता है कि अंदरूनी कान में अन्य कोशिका प्रकार निर्धारित करता है कि तनाव के तहत बालों की कोशिकाओं के अंत में रहते हैं या 11, 22, 23, मर में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं. पौधे क सेल मॉडल प्रणाली के लिए एक परिपक्व स्तनधारी संवेदी उपकला में इन महत्वपूर्ण सेल सेल बातचीत की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Adenoviral संक्रमण समर्थन कोशिकाओं में जीन की अभिव्यक्ति फेरबदल की एक विधि प्रदान करता है, इस प्रकार बाल सेल, मृत्यु, उत्थान, और phagocytosis अस्तित्व में कोशिकाओं का समर्थन की भूमिका (ओं) की पढ़ाई की सुविधा.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

इस काम बहरापन और अन्य संचार विकार पर राष्ट्रीय संस्थान पर अंदर का अनुसंधान प्रभाग द्वारा समर्थित किया गया. अतिरिक्त समर्थन NIDCD 5R01 DC007613 द्वारा प्रदान की गई थी.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Medium 199 GIBCO, by Life Technologies 12350
DMEM/F12 GIBCO, by Life Technologies 11320
Fine forceps (#55) Fine Science Tools 11255-20
Fine forceps (#5) Fine Science Tools 11252-30
Forceps (#3) Fine Science Tools 11231-30
Penicillin G Sigma-Aldrich P3032
Fetal bovine serum Invitrogen 10082-139
Nunc mini-tray Fisher Scientific 12-565-68
Adenovirus-GFP Vector Biolabs 1060*
Cal-Ex decalcifier Fisher Scientific CS510-1D
sodium borohydride Sigma-Aldrich 452882
Anti-Myosin 7a (polyclonal) Proteus Biosciences 25-6790
Anti-Myosin 7a (monoclonal) Developmental Studies Hybridoma Bank MYO7A 138-1
Anti-Calmodulin Sigma-Aldrich C 3545
Anti-Calbindin Chemicon International AB1778
Fluoromount G SouthernBiotech 0100-01
Table 1. Reagents and tools used in utricle culture and adenovirus infection
* Note: Ad-GFP is normally provided by Vector Biolabs at a stock titer of 1x1010 PFU/ml. We requested a custom amplification in order to provide the stock virus at a titer of 1.2×1011 PFU/ml.

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References

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तंत्रिका विज्ञान 61 अंक हेयर सेल ototoxicity सुनवाई हानि अंग संस्कृति

Erratum

Formal Correction: Erratum: Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection
Posted by JoVE Editors on 04/17/2012. Citeable Link.

A correction was made to Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection. The incorrect version of figure 2 was published, the middle initials of the authors were omitted, and the acknowledgements were updated.

Figure 2. Adenovirus-mediated infection of supporting cells was corrected to include a schematic showing the structure of the utricle sensory epithelium. The incorrect figure was inadvertently published. This error does not change the scientific conclusions of the article in any way. The editors apologize for this error.

The acknowledgements were updated to:

The authors are grateful to Dr. Shimon P. Francis for generating the confocal micrographs.

This work was supported by the Division of Intramural Research at the National Institute on Deafness and Other Communication Disorders. Additional support was provided by NIDCD 5R01 DC007613.

From:

This work was supported by the Division of Intramural Research at the National Institute on Deafness and Other Communication Disorders. Additional support was provided by NIDCD 5R01 DC007613.

The authors were updated to:

Carlene S. Brandon, Christina Voelkel-Johnson, Lindsey A. May, Lisa L. Cunningham

From:

Carlene Brandon, Christina Voelkel-Johnson, Lindsey May, Lisa Cunningham

वयस्क माउस पौधे क सेल और Adenovirus - मध्यस्थता सहायक सेल संक्रमण का विच्छेदन
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Brandon, C. S., Voelkel-Johnson, C., … More

Brandon, C. S., Voelkel-Johnson, C., May, L. A., Cunningham, L. L. Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection. J. Vis. Exp. (61), e3734, doi:10.3791/3734 (2012).

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