Disseksjon av Adult Mouse Utricle og Adenovirus-mediert støttende-celle Infeksjon

Summary

Mechanosensory hårcellene er receptor cellene i det indre øret. Den beste-preget

Abstract

Hørselstap og balanse forstyrrelser er ofte forårsaket av død mechanosensory hårcellene, som er receptor cellene i det indre øret. Siden det er ingen celle linje som tilfredsstillende representerer mammalske hårceller, avhengig forskning på hårcellene på primære organet kulturer. Det mest preget in vitro modell system av modne mammalske hårceller benytter orgel kulturer utricles fra voksne mus (figur 1) ^1-6. Den utricle er en vestibulære organ, og hårcellene i utricle er lik i både struktur og funksjon til hårcellene i det auditive organ, organ Corti. Den voksne mus utricle forberedelse representerer en moden sensorisk epitel for studier av de molekylære signaler som regulerer overlevelse, homeostase, og død av disse cellene.

Mammalske cochlea hårcellene terminalt differensiert og er ikke regenerert når de går tapt. I ikke-mammaliske virveldyr, auditive eller vestibulære hår celledød etterfølges av robust regenerering som gjenoppretter hørsel og balanse funksjoner ^{7, 8.} Håret celle gjenfødelse er mediert av gliaceller-lignende støtte celler, som kontakt med basolateral overflater av hårceller i sensorisk epitel ^{9, 10.} Støtter celler er også viktige mediatorer av hår celle overlevelse og død ^11. Vi har nylig utviklet en teknikk for infeksjon av støtte celler i dyrkede utricles med adenovirus. Bruke adenovirus type 5 (dE1/E3) å levere en transgenet inneholder GFP under kontroll av CMV arrangøren, finner vi at adenovirus spesielt og effektivt infiserer støtte celler. Støtte celle infeksjon effektivitet er ca 25-50%, og hårcellene blir ikke smittet (figur 2). Viktigere, finner vi at adenoviral infeksjon av støtte celler ikke medføre giftighet for hårcellene eller hjelpeverge celler, som blodceller i Ad-GFP infected utricles tilsvarer de i ikke-infiserte utricles (figur 3). Dermed adenovirus-mediert genuttrykk i støtte celler av dyrkede utricles gir et kraftig verktøy for å studere rollene til støtte celler som mediatorer av hår celle overlevelse, død og gjenfødelse.

Protocol

1. Utricle Dissection og kultur

1. Avlive en voksen (4 uker eller eldre) mus ved hjelp av en godkjent protokoll og halshugge.
2. Klipp den eksterne øregangen på begge sider av hodet og dra huden frem mot nesen. Halvere hodet fra rygg til front og fjerne hjernen fra begge sider for å avsløre benete labyrinten.
3. Trim skallen unna benete sneglehuset og overføre benete labyrinten (inkludert Bulla) til en vev kultur hette utstyrt med en dissekere mikroskop (Merk: Adenovirus arbeid skal utføres i en klasse II biologisk sikkerhet kabinett).
4. I panseret, overføre hver cochlea et 35mm vevskultur fatet inneholder sterilt dissekere media (M199, Gibco / Invitrogen # 12350) (figur 1A).
5. Hvis det auditive Bulla er fortsatt intakt (det er mulig å fjerne Bulla under brutto disseksjonen ved å sette din miniatyrbilde mellom Bulla og toppen avcochlea), bruker to tang (en # 3 og en # 5) til å bryte Bulla (Figur 1B).
6. Identifiser landemerkene i den benete sneglehuset forberedelse: Apex, base, ossicles, ovale og runde vinduer, VIIIth nerve rot, halvsirkelformet kanaler (Figur 1 C, D).
7. Plasser det indre øret i fatet med den mediale siden opp, slik at den ovale og runde vinduer og apex er på bunnen av fatet og VIIIth nerve rot vender opp. Hold forberedelse på en # 3 tang i regionen av den halvsirkelformede kanaler (Figur 1D).
8. Ved hjelp av en skalpell utstyrt med en 11 blad, avskåret spissen av sneglehuset bare apikal til nerve root (figur 1D).
9. Snu forberedelse slik at kuttet delen vender opp. Bruk fremre halvrunde kanalen som et håndtak for å stabilisere preparatet (figur 1E).
10. Bruk nr. 5 tang, fjerne sneglehuset på modiolus nedtil basen. På det punktet hvor kroken regionen i cochlea snur nedover, bruker du en fin probe (halvparten av et ødelagt # 55 tang) for å løfte den siste benete hylle i osseous spiral lamina (figur 1F), avslører saccule. Bare under saccule er stigbøylen fotplaten, som er en viktig landemerke. Den utricle er rett mot stigbøylen fotplaten (figur 1G), og det er omgitt av bein. Bruk sonden å chip beinet bort nok til å avsløre om lag 1/3 av utricle. Fjern forsiktig utricle hjelp nr. 55 tang (figur 1H). Denne prosedyren vil vanligvis resultere i fjerning av det pigmenterte taket epitelet som utricle trekkes fra benete forberedelse. Men hvis utricle fjernes med taket epitel intakt, kan taket fjernes med 55 tang.
11. Utricles for adenovirus-infeksjon (eller levende bilde-forsøk) må ha otoconia fjernet under disseksjonen (før infeksjon).I dette tilfellet bruker en luer-lock sprøyte som er fylt med dissekere media og utstyrt med en liten kanyle (vanligvis 26-28 gauge). Hold utricle på kanten ved hjelp av 55 tang (figur 1i). Ta nålespissen nær utricle med skråkant av nålen pekende nedover. Bruk en strøm av dissekere media å blåse av otoconia (figur 1J). Alternativt kan otoconia fjernes ved å børste dem vekk med en øyenvippe verktøy (Ted Pella, Inc. # 113). Utricles som ikke kommer til å gjennomgå adenoviral infeksjon er normalt kultivert frittflytende i 24-vel vevskulturstudier plater med otoconia intakt (se nedenfor for post-fix otoconia fjerning, noe som er enklere).
12. Når alle utricles er dissekert, endre dissekere media til sterilt kultur media: DMEM F12 (Gibco # 11320) supplert med 5% FBS og 50 U / ml penicillin G (Sigma).
13. Utricles dyrkes ved 37 ° C og 5% CO _2. Dersom kulturer skal være maintastudere aggressiv for mer enn 48 timer, bør halvparten av dyrkingsmedier byttes annenhver dag. Kulturer kan opprettholdes for en uke eller lenger.

2. Adenovirus Infeksjon å støtte Cells

Viktig: Arbeide med adenovirus krever biosikkerhetsnivå 2 (BSL2) prosedyrer og sertifisering. Sjekk med din Institutional biosikkerhet Officer for veiledning og opplæring på BSL2 prosedyrer.

1. Dissekere utricles som ovenfor i disseksjon media (ingen serum). Fjern otoconia som ovenfor.
2. Når du er klar til å infisere, overføre en utricle (hårcellene opp) i hver brønn av et Nunc mini-brett (Fisher # 12-565-68) inneholder 15 mL serum-free DMEM F12 (dette er viktig fordi serum kan inaktivere virus) . Denne overføringen er enklere med en 1,5 mm microcurette (# 10082-15 fra fine Science Tools).
3. Vår Ad-GFP er serotype 5 med viral E1 og E3 gener slettet og menneskelige CMV promoter driver transgENE (GFP). Dette viruset ble innhentet fra Vector BioLabs (Philadelphia, PA vectorbiolabs.com ). Stock virus tilbys på titere av 1,0 til 4,0 × ¹⁰ 10 PFU / ml. Legg 0,5 til 2 mL av lager virus til hver brønn inneholder en utricle (Figur 1L). Det faktiske beløpet som brukes varierer avhengig av virus og lager titer. Vi pleier å infisere hvert utricle med 1,0 til 4,0 × 10 ⁷ PFU.
4. Kultur de utricles i virus-inneholder media ved 37 ° C / 5% CO ₂ i 2 timer. Etter 2 timer, overføre utricles tilbake til 24-brønnen vevskultur plate inneholder dyrkingsmedier med serum. Kultur de utricles natten ved 37 ° C / 5% CO _2.
5. Utricles kan brukes neste dag for live bildebehandling eksperimenter, eller de kan festes til håret celle Immunokjemiske (se nedenfor). Viral transgenet uttrykk øker over tid, så hvis transgene uttrykk er lav ved 24 timer etter infeksjon det kangunstig for kultur celler ytterligere 24 timer i serum som inneholder media. Hvis du ser håret celle toksisitet, redusere mengden av virus brukt.

3. Utricle Fiksering, Otoconia fjerning, og Immunokjemiske

1. På slutten av kultur perioden, fikse utricles i 4% paraformaldehyde for enten 3 timer ved romtemp (på en gyngende plattform) eller over natten ved 4 ° C. Vask utricles (3 ganger, 15 min hver) i 0,1 M (1X) Sørensens fosfatbuffer pH 7,4. Disse trinnene er utført i en 24-brønns vevskultur plate.
2. Otoconia fjerning: Merk: Otoconia må fjernes før adenovirus-infeksjon (se trinn 1.11 ovenfor). Imidlertid kan utricles som ikke skal bli smittet dyrkes og festes med otoconia fortsatt intakt. I dette tilfellet bruker fremgangsmåten som er beskrevet her for å fjerne otoconia etter fiksering. Inspiser utricles for eventuelle gjenværende pigmentert tak epitel. Fjern forsiktig eventuelle gjenværende tak epitel med to # 55 forceps. For å fjerne otoconia, erstatte Sørensens fosfatbuffer med 750-1000 mL Cal-Ex decalcifier (Fisher # CS510-1D). La Cal-Ex på utricles for 1 minutt og 40 sekunder (ikke overstige 2 minutter). Bytt Cal-Ex med 0,1 M Sørensens fosfatbuffer og vask (5 ganger, 5 min hver).
3. Inkuber utricles i natriumborhydrid (Sigma # 452882, 1% i avionisert vann) i 10 minutter. Vask utricles i 0,1 M Sørensens fosfat buffer (5 ganger, 5 min hver).
4. Plasser utricles i blokkering Solution (PBS + 2% bovint serum albumin + 0,8% normal geit serum + 0,4% Triton X-100) i 3 timer ved romtemperatur på en rocking plattform.
5. Legg primære antistoffer og inkuber natten ved 4 ° C. Anti-Myosin 7a (enten Proteus biovitenskap # 25-6790 eller # MYO7A 138-1 fra utviklingsstudier hybridoma Bank) på 1:100 i blokkering løsning etiketter alle hårcellene. For separat merke striolar og ikke-striolar hårceller, har vi brukt en dobbel-etikett protocol med monoklonalt anti-calmodulin (Sigma # C 3545, 1:150) og polyklonale anti-calbindin (Chemicon # AB1778, Temecula, CA, USA, 1:200). Sekundære antistoffer (vanligvis Alexa Fluor konjugerte sekundære antistoffer fra Invitrogen, Carlsbad, California, USA) er fortynnet 1:500 i blokkering løsning og inkuberes i 4 timer i mørke ved romtemperatur på en rocking plattform.
6. Mount utricles på glassplater med Fluoromount-G (Southern Biotech, Birmingham, AL, USA).

4. Representative Resultater

Utricles dyrket ved hjelp av denne metoden beholde fullt utfyller av både hår celler og støtte celler (figur 2). Hårcellene i friske kulturer viser runde kjernefysiske profiler omgitt av tynne cytoplasmatiske regioner som er myosin 7a-positive (figur 2, topp-panelet). Støtter celler (merket med anti-Sox2) er mindre og mer tettpakket enn hårcellene (figur 2, nedre panel). Adenovirus smitter 25-50% av de som støtter cellene i utricle, og ingen hårcellene infisert (figur 2, Ad-GFP paneler). Det bør bemerkes at den optimale arbeider titer av hvert adenovirus må bestemmes empirisk, siden håret celledød er mulig hvis viral titer er for høy. I tillegg vil deler av mekanisk skade (forårsaket under disseksjon) tar opp store mengder virus. Disse regionene i mekanisk skade er lett gjenkjennelig ved en sammenhengende linje av celler med svært høye nivåer av GFP uttrykk og manglende hårceller. Dette er i kontrast til den spredte GFP uttrykk i støtte celler i en uskadet kultur (figur 2).

Figur 1. Utricle Dissection. A:. Auditory Bulla (AB) B:. Den Bulla er brutt med to solide tang C: Bony cochlea (RW = runde vinduet, S =. stapedial arterie, C = cochlea, ST = stigbøylen) D: En skalpell blad (SB) brukes til å kutte toppen av sneglehuset apikal til VIIIth hjernenerven (8 ^th N) ASC = anterior halvsirkelformet kanalen E..: Preparatet holdes fast ved hjelp av en # 3 pinsett med en gaffel inn i fremre halvrunde kanalen (ASC) og den andre på den ytterste bein (piler). Membran labyrinten fjernes med pinsett F:. Med membranous labyrinten fjernet, er basal begynnelsen av osseous spiral lamina synlig nær kroken regionen. En fin sonde settes inn under denne benete hylle å løfte hyllen opp og fjern den (pil) G:. Etter fjerning av saccule, er utricle (U) synlig rett mot stigbøylen fotplaten (SF) H:. Utricle (U ) fjernes med en # 55 tang (pil) SF = stigbøylen fotplate jeg:.. Utricle med otoconia (O) delvis fjernet end sensoriske epitel (SE) synlige under J:. Otoconia (O) er fjernet fra utricle ved hjelp av en strøm av medier som leveres med en sprøyte utstyrt med en 26-gauge kanyle. I skyggen av nålen (S) er synlig nederst på bildet K:. Utricle med otoconia fjernet og sensorisk epitel (SE) synlig L:. Adenoviral infeksjon: hver utricle (U) er plassert i en enkelt brønn av en mini -skuffen. Støtter celler er infisert med adenovirus ved pipettering virus i brønnen (P = Pipet tips).

Figur 2. Adenovirus-mediert infeksjon av støtte celler. Utricles ble smittet med adenovirus kjøring uttrykk av grønt fluoriserende protein (Ad-GFP). Vist er confocal bilder av håret celle laget og støtte celle laget i det samme området av en utricle. Hårcellene er merket med et antistoff mot Myosin 7a(Magenta). Støtter celler er merket med et antistoff mot Sox2 (rød). Skjematisk viser strukturen i utricle sensorisk epitel og plasseringen av de hårcellene (HC) og støtte celler (SC). Plassering av confocal (optisk) seksjoner vises i øvre (U) og lavere (L) paneler er angitt med stiplede linjer i skjematisk. Øvre paneler: I confocal bilder tatt på nivået av håret cellekjerner, synes Ad-GFP signal i mellomrommene mellom hårceller og ikke overlapper med håret celle markøren Myosin 7a. Nedre paneler: I confocal seksjoner på nivå med den bærende cellekjerner, colocalizes Ad-GFP signal med støtte celle markør Sox-2. Ad-GFP infeksjon resulterer i GFP uttrykk i støtte celler bare, og ingen hårcellene er smittet.

Figur 3. Adenoviral infeksjon vil ikke resultere i død av hårceller eller hjelpeverge celler. Utricles var smittet med Ad-GFP på 4 × 10 ⁸ PFU / ml. Utricles ble merket med antistoffer mot Myosin 7a (hårcelle markør) og Sox2 (støtter celle markør). Hår celle og støtte celletall var like for kontroll utricles og Ad-GFP smittet utricles.

Discussion

Sensoriske hårcellene er utsatt for dødsfall forårsaket av en rekke påkjenninger, inklusive aldring, støy traumer, og eksponering for Ototoksisk narkotika, inkludert aminoglykosidantibiotika og cytostatikum cisplatin. Hos pattedyr hår celledød resulterer i permanent hørselstap og / eller balanse forstyrrelse. In vitro modellsystemer er kritiske verktøy for studier med sikte på fastsettelse av cellulære og molekylære mekanismer bak håret celledød, samt de som tar sikte på å forebygge eller reversere hår celledød . I motsetning cochlea hårcellene fra voksne pattedyr, hårcellene i utricle overleve godt i kulturen. Utricle hårcellene er følsomme for døden fra eksponering til de samme terapeutiske stoffer som er giftige for cochlea hårceller og de ​​cellulære mekanismene bak Ototoksisk hår celledød og overlevelse er lik for både utricular og cochlea hårcellene ^12-18. Dessuten, når data innhentet i utricle modellen systemet er teSted in vivo, har utricle forberedelse vist seg å være en pålitelig prediktor for hår celle overlevelse og død i den modne ^{12 cochlea, 18-21.} Musen utricle forberedelse kan vi også undersøke effekten av spesifikke proteiner ved å utnytte utricles fra transgene og knockout dyr.

Signalene som formidler overlevelse og død av sensoriske hårceller under stress er dårlig forstått. Imidlertid tyder nye bevis for at andre celletyper i det indre øret kan spille viktige roller i å avgjøre om hårcellene under stress slutt leve eller dø ^{11, 22, 23.} Det utricle Modellen kan brukes til å undersøke disse kritiske celle-celle interaksjoner i en moden pattedyr sensorisk epitel. Adenoviral infeksjon gir en metode for å endre genuttrykk i støtte celler, og dermed tilrettelegge for studier av rollen (e) for å støtte celler i håret celle overlevelse, død, fagocytose, og gjenfødelse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medium 199	GIBCO, by Life Technologies	12350
DMEM/F12	GIBCO, by Life Technologies	11320
Fine forceps (#55)	Fine Science Tools	11255-20
Fine forceps (#5)	Fine Science Tools	11252-30
Forceps (#3)	Fine Science Tools	11231-30
Penicillin G	Sigma-Aldrich	P3032
Fetal bovine serum	Invitrogen	10082-139
Nunc mini-tray	Fisher Scientific	12-565-68
Adenovirus-GFP	Vector Biolabs	1060*
Cal-Ex decalcifier	Fisher Scientific	CS510-1D
sodium borohydride	Sigma-Aldrich	452882
Anti-Myosin 7a (polyclonal)	Proteus Biosciences	25-6790
Anti-Myosin 7a (monoclonal)	Developmental Studies Hybridoma Bank	MYO7A 138-1
Anti-Calmodulin	Sigma-Aldrich	C 3545
Anti-Calbindin	Chemicon International	AB1778
Fluoromount G	SouthernBiotech	0100-01
Table 1. Reagents and tools used in utricle culture and adenovirus infection
* Note: Ad-GFP is normally provided by Vector Biolabs at a stock titer of 1x1010 PFU/ml. We requested a custom amplification in order to provide the stock virus at a titer of 1.2×1011 PFU/ml.