Dissektion af voksne mus Utricle og adenovirus-medieret støtte-celleinfektion
Summary
Mechanosensory hårceller er receptor celler i det indre øre. Den bedst karakteriseres<em> In vitro</em> Modelsystem af modne pattedyr hårceller udnytter organkulturer af utricles fra voksne mus. Vi præsenterer dissektion af voksne mus utricle, og vi viser adenovirus-medieret infektion af støtte-celler i dyrkede utricles.
Abstract
Høretab og balance forstyrrelser er ofte forårsaget af død mechanosensory hårceller, som er de receptor celler i det indre øre. Da der ikke er cellelinje, der på tilfredsstillende betegner mammale hårceller, forskning hårceller afhængig primære organkulturer. Den bedst karakteriseres in vitro model system af modent pattedyrprotein hårceller udnytter organkulturer af utricles fra voksne mus (figur 1) 1-6. Det utricle er en vestibulære organ, og hårceller i utricle er ens i både struktur og funktion til at hårcellerne i det auditive organ, orglet af Corti. Den voksne mus utricle præparatet repræsenterer en moden sensorisk epithel til undersøgelser af den molekylære signaler, som regulerer overlevelsen, homeostase, og disse cellers død.
Mammale snegle-hårceller er terminalt differentierede og ikke regenereres, når de går tabt. I ikke-mammaliske hvirveldyr, auditive eller vestibulære hår celledød efterfølges af en robust regenerering, der genskaber hørelse og balance funktioner 7, 8. Hårcelleregeneration medieres af glia-lignende understøtter celler, som kontakter de basolaterale overflade af hårceller i det sensoriske epithel 9, 10. Støtte-celler er også vigtige mediatorer af hår celleoverlevelse og død 11. Vi har for nylig udviklet en teknik til infektion af støtte celler i dyrkede utricles med adenovirus. Ved hjælp af adenovirus type 5 (dE1/E3) at afgive et transgen, der indeholder GFP under kontrol af CMV-promotoren, finder vi, at adenovirus specifikt og effektivt inficerer støtte-celler. Støtte celleinfektion effektivitet er ca 25-50%, og hårceller ikke inficeret (figur 2). Vigtigt, vi finder, at adenovirusinfektion understøtte celler ikke resulterer i toksicitet til hårceller eller støtter celler, som celletal i Ad-GFP infected utricles svarer til dem i ikke-inficerede utricles (Figur 3). Således adenovirus-medieret genekspression i støtte celler fra dyrkede utricles giver et kraftfuldt værktøj til at studere de roller støtte celler som mediatorer af hår celle overlevelse, død og genfødsel.
Protocol
Discussion
Sansehårceller er modtagelige for død forårsaget af en række spændinger, herunder ældning, støj trauma, og udsættelse for ototoksiske lægemidler, herunder aminoglykosid antibiotika og det antineoplastiske middel cisplatin. Hos pattedyr hår celledød resulterer i permanent høretab og / eller balance forstyrrelser. In vitro modelsystemer er kritiske værktøjer til undersøgelser med henblik på fastlæggelse af de cellulære og molekylære mekanismer bag hår celledød, såvel som dem, der sigter på …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af afdelingen for Egne Forskning ved National Institute on Døvhed og andre kommunikationsteknologier Disorders. Yderligere støtte blev leveret af NIDCD 5R01 DC007613.
Materials
| Reagent | Company | Catalog number |
| Medium 199 | Gibco/Invitrogen | 12350 |
| DMEM/F12 | Gibco/Invitrogen | 11320 |
| Fine forceps (#55) | Fine Science Tools | 11255-20 |
| Fine forceps (#5) | Fine Science Tools | 11252-30 |
| Forceps (#3) | Fine Science Tools | 11231-30 |
| Penicillin G | Sigma | P3032 |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10082-139 |
| Nunc mini-tray | Fisher | 12-565-68 |
| Adenovirus-GFP | Vector Biolabs | 1060* |
| Cal-Ex decalcifier | Fisher | CS510-1D |
| sodium borohydride | Sigma | 452882 |
| Anti-Myosin 7a (polyclonal) | Proteus Biosciences | 25-6790 |
| Anti-Myosin 7a (monoclonal) | Developmental Studies Hybridoma Bank | MYO7A 138-1 |
| Anti-Calmodulin | Sigma | C 3545 |
| Anti-Calbindin | Chemicon | AB1778 |
| Fluoromount G | Southern Biotechnology Associates | 0100-01 |
Table 1. Reagents and tools used in utricle culture and adenovirus infection.
* Note: Ad-GFP is normally provided by Vector Biolabs at a stock titer of 1×1010 PFU/ml. We requested a custom amplification in order to provide the stock virus at a titer of 1.2×1011 PFU/ml.
References
- Cunningham, L. L. The adult mouse utricle as an in vitro preparation for studies of ototoxic-drug-induced sensory hair cell death. Brain Res. , (2006).
- Schmitt, N. C., Rubel, E. W., Nathanson, N. M. Cisplatin-induced hair cell death requires STAT1 and is attenuated by epigallocatechin gallate. J. Neurosci. 29, 3843-3851 (2009).
- Ou, H. C. Identification of FDA-approved drugs and bioactives that protect hair cells in the zebrafish (Danio rerio) lateral line and mouse (Mus musculus) utricle. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 10, 191-203 (2009).
- Chiu, L. L. Using the zebrafish lateral line to screen for ototoxicity. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 9, 178-190 (2008).
- Sugahara, K., Rubel, E. W., Cunningham, L. L. JNK signaling in neomycin-induced vestibular hair cell death. Hear Res. , 221-221 (2006).
- Matsui, J. I., Cotanche, D. A. Sensory hair cell death and regeneration: two halves of the same equation. Curr. Opin. Otolaryngol. Head Neck Surg. 12, 418-4125 (2004).
- Ryals, B. M., Rubel, E. W. Hair cell regeneration after acoustic trauma in adult Coturnix quail. Science. 240, 1774-176 (1988).
- Corwin, J. T., Cotanche, D. A. Regeneration of sensory hair cells after acoustic trauma. Science. 240, 1772-174 (1988).
- Shang, J. Supporting cell division is not required for regeneration of auditory hair cells after ototoxic injury in vitro. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 11, 203-222 (2010).
- Stone, J. S., Cotanche, D. A. Hair cell regeneration in the avian auditory epithelium. Int. J. Dev. Biol. 51, 6-7 (2007).
- Lahne, M., Gale, J. E. Damage-induced activation of ERK1/2 in cochlear supporting cells is a hair cell death-promoting signal that depends on extracellular ATP and calcium. J. Neurosci. 28, 4918-4928 (2008).
- Cunningham, L. L., Cheng, A. G., Rubel, E. W. Caspase Activation in Hair Cells of the Mouse Utricle Exposed to Neomycin. Journal of Neuroscience. 22, 8532-8540 (2002).
- Matsui, J. I. Caspase inhibitors promote vestibular hair cell survival and function after aminoglycoside treatment in vivo. J. Neurosci. 23, 6111-6122 (2003).
- Matsui, J. I., Ogilvie, J. M., Warchol, M. E. Inhibition of caspases prevents ototoxic and ongoing hair cell death. J. Neurosci. 22, 1218-1227 (2002).
- Nakagawa, T. A novel technique for inducing local inner ear damage. Hear Res. 176, 1-2 (2003).
- Forge, A., Li, L. Apoptotic death of hair cells in mammalian vestibular sensory epithelia. Hear Res. 139, 1-2 (2000).
- Liu, W. Caspase inhibitors prevent cisplatin-induced apoptosis of auditory sensory cells. Neuroreport. 9, 2609-2614 (1998).
- Taleb, M. Hsp70 inhibits aminoglycoside-induced hearing loss and cochlear hair cell death. Cell Stress Chaperones. 14, 427-437 (2009).
- Taleb, M. Hsp70 inhibits aminoglycoside-induced hair cell death and is necessary for the protective effect of heat shock. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 9, 277-289 (2008).
- Francis, S. P. Celastrol Inhibits Aminoglycoside-Induced Ototoxicity via Heat Shock Protein 32 (HSP32). Cell Death and Disease. , (2011).
- Wang, J. Caspase inhibitors, but not c-Jun NH2-terminal kinase inhibitor treatment, prevent cisplatin-induced hearing loss. Cancer Res. 64, 9217-9224 (2004).
- Bird, J. E. Supporting cells eliminate dying sensory hair cells to maintain epithelial integrity in the avian inner ear. J. Neurosci. 30, 12545-12556 (2010).
- Sato, E. Expression of fractalkine receptor CX3CR1 on cochlear macrophages influences survival of hair cells following ototoxic injury. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 11, 223-234 (2010).
