Mechanosensory hårceller är receptor-celler i innerörat. Den bäst karakteriserade<em> In vitro</em> Modellsystem av mogna däggdjursceller hårceller använder organkulturer av utricles från vuxna möss. Vi presenterar dissektion av den vuxna musen utriculus, och visar vi adenovirusmedierad infektion av stödjande celler i odlade utricles.
Hörselnedsättning och störningar balans beror ofta på döden av mechanosensory hårceller, som är de receptor cellerna i innerörat. Eftersom det inte finns någon cellinje som är tillfredsställande representerar däggdjursceller hårceller, bygger forskning på hårceller på primära organ kulturer. Den bäst karakteriserade in vitro-modellsystem av mogna däggdjursceller hårceller utnyttjar organkulturer av utricles från vuxna möss (figur 1) 1-6. Den utriculus är en vestibulär organ och hårcellerna i utriculus är likartade i både struktur och funktion till hårcellerna i hörselorganet, det organ Corti. Den vuxna musen utriculus beredningen motsvarar en mogen sensorisk epitel för studier av de molekylära signaler som reglerar överlevnad, homeostas och död av dessa celler.
Däggdjursceller kokleära hårceller terminalt differentierade och inte regenereras när de förlorade. I icke-mamMali ryggradsdjur, hörsel eller vestibulära håret celldöd följs av en stark återhämtning som återställer hörsel-och balansrubbningar funktion 7, 8. Hårcell regenerering medieras av glia-liknande stödjande celler, vilka kommer i kontakt de basolaterala ytan av hårceller i det sensoriska epitelet 9, 10. Stödjande celler är också viktiga mediatorer av hår cellöverlevnad och död 11. Vi har nyligen utvecklat en teknik för infektion av stödjande celler i odlade utricles hjälp adenovirus. Användning adenovirus typ 5 (dE1/E3) att tillföra en transgen innehållande GFP under kontroll av CMV-promotorn, finner vi att adenovirus specifikt och effektivt infekterar stödjande celler. Stöd effektiviteten cellsinfektion är ca 25-50%, och hårceller som inte är infekterade (Figur 2). Viktigt finner vi att adenoviral infektion av stödjande celler inte leder till toxicitet för hårceller eller stödjande celler, celltal i Ad-GFP infsad utricles är ekvivalenta med de i icke-infekterade utricles (figur 3). Därför adenovirus-medierad genuttryck för att stödja celler odlade utricles ger ett kraftfullt verktyg för att studera rollerna som stödjande celler som mediatorer av hår cellöverlevnad, död och förnyelse.
Sensoriska hörselceller är känsliga för död orsakad av en mängd olika spänningar, innefattande åldrande, buller trauma och exponering för ototoxiska läkemedel, inklusive de aminoglykosidantibiotika och det antineoplastiska medlet cisplatin. Hos däggdjur död hår cell resulterar i permanent hörselnedsättning och / eller balans störningar. In vitro-modellsystem är kritiska verktyg för studier som syftar till att fastställa de cellulära och molekylära mekanismerna bakom håret celldöd…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av avdelningen för Interna Forskning vid National Institute on Dövhet och andra störningar kommunikation. Ytterligare stöd kom från NIDCD 5R01 DC007613.
Reagent | Company | Catalog number |
Medium 199 | Gibco/Invitrogen | 12350 |
DMEM/F12 | Gibco/Invitrogen | 11320 |
Fine forceps (#55) | Fine Science Tools | 11255-20 |
Fine forceps (#5) | Fine Science Tools | 11252-30 |
Forceps (#3) | Fine Science Tools | 11231-30 |
Penicillin G | Sigma | P3032 |
Fetal bovine serum | Invitrogen | 10082-139 |
Nunc mini-tray | Fisher | 12-565-68 |
Adenovirus-GFP | Vector Biolabs | 1060* |
Cal-Ex decalcifier | Fisher | CS510-1D |
sodium borohydride | Sigma | 452882 |
Anti-Myosin 7a (polyclonal) | Proteus Biosciences | 25-6790 |
Anti-Myosin 7a (monoclonal) | Developmental Studies Hybridoma Bank | MYO7A 138-1 |
Anti-Calmodulin | Sigma | C 3545 |
Anti-Calbindin | Chemicon | AB1778 |
Fluoromount G | Southern Biotechnology Associates | 0100-01 |
Table 1. Reagents and tools used in utricle culture and adenovirus infection.
* Note: Ad-GFP is normally provided by Vector Biolabs at a stock titer of 1×1010 PFU/ml. We requested a custom amplification in order to provide the stock virus at a titer of 1.2×1011 PFU/ml.