Dissektion af voksne mus Utricle og adenovirus-medieret støtte-celleinfektion

Summary

Mechanosensory hårceller er receptor celler i det indre øre. Den bedst karakteriseres

Abstract

Høretab og balance forstyrrelser er ofte forårsaget af død mechanosensory hårceller, som er de receptor celler i det indre øre. Da der ikke er cellelinje, der på tilfredsstillende betegner mammale hårceller, forskning hårceller afhængig primære organkulturer. Den bedst karakteriseres in vitro model system af modent pattedyrprotein hårceller udnytter organkulturer af utricles fra voksne mus (figur 1) ^1-6. Det utricle er en vestibulære organ, og hårceller i utricle er ens i både struktur og funktion til at hårcellerne i det auditive organ, orglet af Corti. Den voksne mus utricle præparatet repræsenterer en moden sensorisk epithel til undersøgelser af den molekylære signaler, som regulerer overlevelsen, homeostase, og disse cellers død.

Mammale snegle-hårceller er terminalt differentierede og ikke regenereres, når de går tabt. I ikke-mammaliske hvirveldyr, auditive eller vestibulære hår celledød efterfølges af en robust regenerering, der genskaber hørelse og balance funktioner ^{7, 8.} Hårcelleregeneration medieres af glia-lignende understøtter celler, som kontakter de basolaterale overflade af hårceller i det sensoriske epithel ^{9, 10.} Støtte-celler er også vigtige mediatorer af hår celleoverlevelse og død ^11. Vi har for nylig udviklet en teknik til infektion af støtte celler i dyrkede utricles med adenovirus. Ved hjælp af adenovirus type 5 (dE1/E3) at afgive et transgen, der indeholder GFP under kontrol af CMV-promotoren, finder vi, at adenovirus specifikt og effektivt inficerer støtte-celler. Støtte celleinfektion effektivitet er ca 25-50%, og hårceller ikke inficeret (figur 2). Vigtigt, vi finder, at adenovirusinfektion understøtte celler ikke resulterer i toksicitet til hårceller eller støtter celler, som celletal i Ad-GFP infected utricles svarer til dem i ikke-inficerede utricles (Figur 3). Således adenovirus-medieret genekspression i støtte celler fra dyrkede utricles giver et kraftfuldt værktøj til at studere de roller støtte celler som mediatorer af hår celle overlevelse, død og genfødsel.

Protocol

1. Utricle Dissektion og Kultur

1. Afliv en voksen (4 uger gamle eller ældre) mus ved hjælp af en godkendt protokol og halshugge.
2. Røverkøb den ydre øregang på begge sider af hovedet og trække huden frem mod næsen. Gennemskære hovedet fra tilbage til forsiden og fjerne hjernen fra begge sider for at afsløre knoklet labyrint.
3. Trim kraniet væk fra benet cochlea og overføre den benede labyrint (herunder bulla) til en vævskultur hætte forsynet med et dissektionsmikroskop (Bemærk: adenovirus arbejde skal udføres i et klasse II biologisk sikkerhedsskab).
4. I hætten, overføre hver cochlea til en 35 mm vævskulturskål indeholdende sterile dissekering medier (M199, Gibco / Invitrogen # 12.350) (figur 1A).
5. Hvis det auditive Bulla er stadig intakt (det er muligt at fjerne Bulla under grov dissektion ved at indsætte tommelfingerneglen mellem Bulla og toppunktet afcochlea), anvendes to tænger (en # 3 og en # 5) for at bryde bulla (fig. 1B).
6. Identificer seværdigheder i knoglens cochlea præparatet: Apex, base, ossicles, ovale og runde vinduer, VIIIth nerve rod, halvrunde kanaler (Figur 1 C, D).
7. Anbring det indre øre i skålen med den mediale side opad, således at den ovale og rundt vinduer og apex er på bunden af ​​skålen og VIIIth nerveroden vender opad. Holde præparatet ved hjælp af en # 3 pincet i området af de halvcirkulære kanaler (figur 1D).
8. Ved hjælp af en skalpel udstyret med en # 11 klinge, afskære toppen af sneglen lige apikale til nerveroden (figur 1D).
9. Vende præparatet, således at den udskårne del vender opad. Anvende den forreste halvcirkulær kanal som et håndtag til at stabilisere præparatet (fig. 1E).
10. Brug # 5 pincet, cochlea fjerne på modiolus nedtil basen. På det sted, hvor krogen region af cochlea vender nedad, anvendes en fin probe (halvdelen af en brudt # 55 pincet) til at løfte den sidste knoglens hylde i knoglemasse spiral lamina (fig. 1F), afslører saccule. Lige under saccule er stapes fodpladen, hvilket er en vigtig milepæl. Den utricle er umiddelbart tilgrænsende til stapes fodpladen (fig. 1G), og den er omgivet af knogle. Anvende probe til chip knoglen væk nok til at afsløre omkring 1/3 af utricle. Fjern forsigtigt utricle med # 55 pincet (fig. 1 H). Denne fremgangsmåde vil sædvanligvis resultere i fjernelse af pigmenteret taget epithelium som utricle trækkes fra benet præparat. Men hvis utricle fjernes med taget epitel intakt, kan taget fjernes med # 55 pincet.
11. Utricles for adenovirusinfektion (eller levende billeddannelse eksperimenter) skal have otoconia fjernes under dissektion (før infektion).I dette tilfælde anvendes en luer-lock sprøjte, der fyldes med dissekering medier og forsynet med en lille kanyle (sædvanligvis 26-28 gauge). Hold utricle på kanten ved hjælp af # 55 pincet (fig. 1I). Bringe nålespidsen tæt på utricle med den skrå kant af nålen pegende nedad. Anvende en strøm af dissekering medier til at blæse ud otoconia (fig. 1J). Alternativt kan otoconia fjernes ved børstning dem væk ved hjælp af en ubetydelighed værktøj (Ted Pella, Inc. # 113). Utricles, der ikke vil undergå adenoviral infektion er normalt dyrkes fritflydende i 24-brønds vævskulturplader med otoconia intakt (se nedenfor for post-fix otoconia fjernelse, som er lettere).
12. Når alle utricles dissekeres, ændre dissekere mediet steril dyrkningsmedium: DMEM F12 (Gibco # 11.320) suppleret med 5% FBS og 50 U / ml penicillin G (Sigma).
13. Utricles dyrkes ved 37 ° C og _5% CO2. Hvis kulturer skal være maintained i mere end 48 timer, skal halvdelen af ​​dyrkningsmedier skal skiftes hver anden dag. Kulturer kan opretholdes i en uge eller længere.

2. Adenovirusinfektion af Støtte celler

Vigtigt: Arbejde med adenovirus kræver biosikkerhedsniveau 2 (BSL2) procedurer og certificering. Spørg din Institutionel biosikkerhed Officer for vejledning og uddannelse inden for BSL2 procedurer.

1. Dissekere utricles som ovenfor i dissektion medium (ingen serum). Fjerne otoconia som ovenfor.
2. Når de er klar til at inficere, overføre en utricle (hårceller up) i hver brønd af en Nunc mini-bakke (Fisher # 12-565-68) indeholdende 15 ul serum-frit DMEM F12 (dette er vigtigt, fordi serum kan inaktivere virus) . Denne overførsel er lettere med en 1,5 mm microcurette (# 10082-15 fra fine Science Tools).
3. Vores Ad-GFP er serotype 5 med de virale E1-og E3-deleteret gener og den humane CMV promotor driver transgen (GFP). Dette virus blev opnået fra Vector BioLabs (Philadelphia, PA vectorbiolabs.com ). Omgående vira er tilvejebragt ved titere af 1,0 til 4,0 x 10 ¹⁰ PFU / ml. Tilsættes 0,5-2 ul stamvirus til hver brønd indeholdende en utricle (fig. 1 I). Det faktiske anvendte mængde varierer afhængigt af virus og bestanden titer. Vi plejer at inficere hver utricle med 1,0-4,0 × 10 ⁷ PFU.
4. Dyrke utricles i virus-holdige medier ved 37 ° C / _5% CO2 i 2 timer. Efter 2 timer overføres utricles tilbage til 24-brønds vævskulturplade indeholdende dyrkningsmedier med serum. Dyrke utricles natten over ved 37 ° C / _5% CO2.
5. Utricles kan bruges næste dag for levende billeddannelse eksperimenter, eller de kan fastsættes for hår celle immunkemi (se nedenfor). Virale transgenekspression stiger over tid, så hvis transgenekspression er lav ved 24 timer efter infektion, kan denfordelagtigt at dyrke cellerne i yderligere 24 timer i serum-holdige medier. Hvis du ser hår celle toksicitet, reducere mængden af ​​virus anvendt.

3. Utricle Fiksering, Otoconia Fjernelse, og Immunochemistry

1. Ved afslutningen af ​​dyrkningsperioden, fastgøres utricles i 4% paraformaldehyd i enten 3 timer ved stuetemperatur (på en vippende platform) eller natten over ved 4 ° C. Vask utricles (3 gange, 15 minutter hver) i 0,1 M (1X) Sorensens phosphatpuffer pH 7,4. Disse trin udføres i en 24-brønds vævskulturplade.
2. Otoconia fjernelse: Note: Otoconia skal fjernes før adenovirus infektion (se trin 1,11 ovenfor). Imidlertid kan utricles, som ikke er inficeret dyrkes og fikseres med otoconia stadig intakt. I dette tilfælde skal du bruge de trin, der er beskrevet her for at fjerne otoconia efter fiksering. Undersøg utricles for eventuelt resterende pigmenterede tag epitel. Forsigtigt fjerne enhver resterende tag epitel med to # 55 forceps. For at fjerne otoconia, udskifte Sørensens fosfatbuffer med 750-1000 gl Cal-Ex afkalker (Fisher # CS510-1D). Lad Cal-Ex om utricles i 1 minut og 40 sekunder (ikke overstige 2 minutter). Erstatte Cal-Ex med 0,1 M Sorensens phosphatbuffer og vaskes (5 gange, 5 minutter hver).
3. Inkuber utricles i natriumborhydrid (Sigma # 452.882, 1% i deioniseret vand) i 10 minutter. Vask utricles i 0,1 M Sorensens phosphatpuffer (5 gange, 5 minutter hver).
4. Sted utricles i blokeringsopløsning (PBS + 2% bovint serumalbumin + 0,8% normalt gedeserum + 0,4% Triton X-100) i 3 timer ved stuetemperatur på en vippende platform.
5. Tilsættes primære antistoffer og inkuberes natten over ved 4 ° C. Anti-Myosin 7a (enten Proteus Biosciences # 25-6790 eller # MYO7A 138-1 fra Developmental Studies Hybridoma Bank) på 1:100 i blokerende opløsning etiketter alle hårceller. Til særskilt mærke striolar og ikke-striolar hårceller, har vi brugt en dobbelt-label protocol med monoklonalt anti-calmodulin (Sigma # C 3545, 1:150) og polyklonalt anti-calbindin (Chemicon # AB1778, Temecula, CA, USA; 1:200). Sekundære antistoffer (sædvanligvis Alexa fluor konjugerede sekundære antistoffer fra Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) fortyndet 1:500 i blokerende opløsning og inkuberet i 4 timer i mørke ved stuetemperatur på en vippende platform.
6. Mount utricles på objektglas ved hjælp af Fluoromount-G (Southern Biotech, Birmingham, AL, USA).

4. Repræsentative resultater

Utricles dyrket ved denne metode bevarer den fulde komplementer af både hårceller og understøttende celler (figur 2). Hårceller i raske kulturer viser runde nukleare profiler omgivet af tynde cytoplasmiske regioner, som er myosin 7a-positive (figur 2, øverste panel). Støtte-celler (mærket med anti-Sox2) er mindre og mere tætpakkede end hårceller (fig. 2, nedre panel). Adenovirus inficerer 25-50% af de bærende celler i utricle, og ingen hårceller er inficeret (figur 2, Ad-GFP paneler). Det skal bemærkes, at den optimale bearbejdning titer af hver adenovirus skal bestemmes empirisk, eftersom hår celledød er muligt, hvis den virale titer for høj. Desuden vil regioner mekanisk beskadigelse (forårsaget under dissektionen) optage store mængder virus. Disse regioner af mekanisk beskadigelse let skelnes ved en kontinuerlig linie af celler med meget høje niveauer af GFP-ekspression og manglende hårceller. Dette er i modsætning til den spredte GFP-ekspression i understøtte celler af en ubeskadiget kultur (figur 2).

Figur 1. Utricle dissektion. A:. Auditory Bulla (AB) B:. Den Bulla brydes ved hjælp af to kraftige tænger C: Bony cochlea (RW = runde vindue, S =. stapedial arterie, C = cochlea, ST = stapes) D: En skalpel (SB) anvendes til at afskære toppen af sneglen apikale til VIIIth kraniale nerve ^(8. N) ASC = forreste halvcirkulær kanal E..: Præparatet holdes fast ved hjælp af en # 3 pincet med en gaffel indsat i forreste halvrunde kanalen (ASC) og den anden på den yderste knogle (pile). Den membranøs Labyrinten fjernes ved hjælp af en pincet F. Med membranøs labyrint fjernet, den basale vinding af knoglemasse spiral laminatlag er synlig i nærheden af krogen region. Et fint sonde indsættes under dette benede hylde at løfte hylden op og fjerne det (pil) G. Efter fjernelse af saccule er utricle (U) synlig umiddelbart tilgrænsende til stapes fodpladen (SF) H:. Utricle (U ) fjernes ved hjælp af en # 55 pincet (pil) SF = stapes fodpladen I:.. Utricle med otoconia (O) delvist fjernet end sensoriske epithel (SE) er synlige under J.. Otoconia (O) fjernes fra utricle anvendelse af en strøm af medier, der leveres af en sprøjte udstyret med en 26-gauge nål. Skyggen af nålen (S) er synlig ved bunden af billedet K. Utricle med otoconia fjernet og sensoriske epithel (SE) synlig L. Adenoviral infektion: hver utricle (U) er anbragt i en individuel brønd i en mini -bakke. Understøtter celler inficeres med adenovirus ved pipettering virus i brønden (P = pipettespids).

Figur 2. Adenovirus-medieret infektion af støtte-celler. Utricles blev inficeret med adenovirus driver ekspression af grønt fluorescerende protein (Ad-GFP). Vist er konfokale billeder af hårcelledifferentiering lag og det understøttende cellelag i samme område af en utricle. Hårceller er mærket med et antistof mod Myosin 7a(Magenta). Understøtter celler mærkes med et antistof mod Sox2 (rød). Skematisk viser strukturen af ​​utricle sensoriske epithel og placeringen af ​​hårceller (HC) og støtte-celler (SC). Placeringen af ​​konfokale (optisk) sektioner vist på den øverste (U) og nedre (L) paneler er angivet ved punkterede linier i den skematiske. Øvre paneler: I konfokale billeder taget på niveauet af håret cellekerner, forekommer Ad-GFP signal i mellemrummene mellem hårceller og ikke overlapper med håret celle-markør Myosin 7a. Nedre paneler: I konfokale snit på niveauet af den understøttende cellekerner, colocalizes Ad-GFP signal med den understøttende cellemarkøren Sox-2. Ad-GFP infektion resulterer i GFP-ekspression i støtte-celler alene og ingen hårceller er inficeret.

Figur 3. Adenoviral infektion ikke resulterer i død af hårceller eller støtter celler. Utricles blev inficeret med Ad-GFP ved 4 x 10 ⁸ PFU / ml. Utricles blev mærket med antistoffer mod Myosin 7a (hår celle markør) og Sox2 (støtte celle markør). Hår celle og støtte celletal var ens for kontrol utricles og Ad-GFP-inficerede utricles.

Discussion

Sansehårceller er modtagelige for død forårsaget af en række spændinger, herunder ældning, støj trauma, og udsættelse for ototoksiske lægemidler, herunder aminoglykosid antibiotika og det antineoplastiske middel cisplatin. Hos pattedyr hår celledød resulterer i permanent høretab og / eller balance forstyrrelser. In vitro modelsystemer er kritiske værktøjer til undersøgelser med henblik på fastlæggelse af de cellulære og molekylære mekanismer bag hår celledød, såvel som dem, der sigter på at forebygge eller vende hår celledød . Modsætning snegle-hårceller fra voksne pattedyr, overleve hårceller i utricle godt i kultur. Utricle hårceller er følsomme over for død ved eksponering til de samme terapeutiske lægemidler, som er toksiske for snegle-hårceller og de ​​cellulære mekanismer, der ligger ototoksisk hår celledød og overlevelse er ens for begge utriculare og snegle-hårceller ^12-18. Desuden, når data er opnået i utricle modelsystem er teplace in vivo, har utricle præparatet vist sig at være en pålidelig indikator for hår celle overlevelse og død i den modne cochlea ^{12, 18-21.} Musen utricle forberedelse tillader os også at undersøge virkningerne af specifikke proteiner ved at udnytte utricles fra transgene og knockout dyr.

De signaler, der medierer overlevelse eller død af sansehårceller under belastning er dårligt forstået. Men nye oplysninger tyder på, at andre celletyper i det indre øre kan spille en vigtig rolle i afgørelsen af, om hårceller under stress i sidste ende leve eller dø ^{11, 22, 23.} Den utricle model kan anvendes til at undersøge disse kritiske celle-celle interaktioner i et modent pattedyrprotein sensorisk epithel. Adenoviral infektion tilvejebringer en fremgangsmåde til ændring af genekspression i støtte-celler, hvilket vil lette undersøgelser af rolle (r) til at understøtte celler i håret celleoverlevelse, død, fagocytose og regenerering.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medium 199	GIBCO, by Life Technologies	12350
DMEM/F12	GIBCO, by Life Technologies	11320
Fine forceps (#55)	Fine Science Tools	11255-20
Fine forceps (#5)	Fine Science Tools	11252-30
Forceps (#3)	Fine Science Tools	11231-30
Penicillin G	Sigma-Aldrich	P3032
Fetal bovine serum	Invitrogen	10082-139
Nunc mini-tray	Fisher Scientific	12-565-68
Adenovirus-GFP	Vector Biolabs	1060*
Cal-Ex decalcifier	Fisher Scientific	CS510-1D
sodium borohydride	Sigma-Aldrich	452882
Anti-Myosin 7a (polyclonal)	Proteus Biosciences	25-6790
Anti-Myosin 7a (monoclonal)	Developmental Studies Hybridoma Bank	MYO7A 138-1
Anti-Calmodulin	Sigma-Aldrich	C 3545
Anti-Calbindin	Chemicon International	AB1778
Fluoromount G	SouthernBiotech	0100-01
Table 1. Reagents and tools used in utricle culture and adenovirus infection
* Note: Ad-GFP is normally provided by Vector Biolabs at a stock titer of 1x1010 PFU/ml. We requested a custom amplification in order to provide the stock virus at a titer of 1.2×1011 PFU/ml.