Dissektion av vuxen mus utriculus och adenovirus-medierad bärande cellsinfektion

Summary

Mechanosensory hårceller är receptor-celler i innerörat. Den bäst karakteriserade

Abstract

Hörselnedsättning och störningar balans beror ofta på döden av mechanosensory hårceller, som är de receptor cellerna i innerörat. Eftersom det inte finns någon cellinje som är tillfredsställande representerar däggdjursceller hårceller, bygger forskning på hårceller på primära organ kulturer. Den bäst karakteriserade in vitro-modellsystem av mogna däggdjursceller hårceller utnyttjar organkulturer av utricles från vuxna möss (figur 1) ^1-6. Den utriculus är en vestibulär organ och hårcellerna i utriculus är likartade i både struktur och funktion till hårcellerna i hörselorganet, det organ Corti. Den vuxna musen utriculus beredningen motsvarar en mogen sensorisk epitel för studier av de molekylära signaler som reglerar överlevnad, homeostas och död av dessa celler.

Däggdjursceller kokleära hårceller terminalt differentierade och inte regenereras när de förlorade. I icke-mamMali ryggradsdjur, hörsel eller vestibulära håret celldöd följs av en stark återhämtning som återställer hörsel-och balansrubbningar funktion ^{7, 8.} Hårcell regenerering medieras av glia-liknande stödjande celler, vilka kommer i kontakt de basolaterala ytan av hårceller i det sensoriska epitelet ^{9, 10.} Stödjande celler är också viktiga mediatorer av hår cellöverlevnad och död ^11. Vi har nyligen utvecklat en teknik för infektion av stödjande celler i odlade utricles hjälp adenovirus. Användning adenovirus typ 5 (dE1/E3) att tillföra en transgen innehållande GFP under kontroll av CMV-promotorn, finner vi att adenovirus specifikt och effektivt infekterar stödjande celler. Stöd effektiviteten cellsinfektion är ca 25-50%, och hårceller som inte är infekterade (Figur 2). Viktigt finner vi att adenoviral infektion av stödjande celler inte leder till toxicitet för hårceller eller stödjande celler, celltal i Ad-GFP infsad utricles är ekvivalenta med de i icke-infekterade utricles (figur 3). Därför adenovirus-medierad genuttryck för att stödja celler odlade utricles ger ett kraftfullt verktyg för att studera rollerna som stödjande celler som mediatorer av hår cellöverlevnad, död och förnyelse.

Protocol

1. Utriculus Dissection och kultur

1. Euthanize en vuxen (4 veckor gamla eller äldre) mus med en godkänd protokoll och halshugga.
2. Klippa den yttre hörselgången på båda sidorna av huvudet och drar huden framåt mot näsan. Tudela huvudet bakifrån och framåt och bort hjärnan från båda sidor för att avslöja den beniga labyrinten.
3. Trimma skallen bort från den beniga snäckan och överföra den beniga labyrinten (inklusive bulla) till en vävnadsodling huva försedd med ett dissektionsmikroskop (Obs: Adenovirus arbete ska utföras i ett klass II biologiskt säkerhetsskåp).
4. I huven, överför varje snäckan till en 35mm vävnadsodlingsskål innehållande steril dissekera media (M199, Gibco / Invitrogen # 12.350) (Figur 1A).
5. Om auditiva bulla är fortfarande intakt (det är möjligt att ta bort bulla under brutto dissektionen genom att sätta tumnageln mellan bulla och spetssnäckan), använda två pincett (ett # 3 och en # 5) för att bryta bulla (Figur 1B).
6. Identifiera landmärken i beniga snäckan beredningen: apex, bas, hörselbenen, ovala och runda fönster, VIII nervrot och båggångarna (Figur 1 C, D).
7. Placera innerörat i skålen med den mediala sidan uppåt, på så sätt att den ovala, runda fönster och spets är på botten av skålen och den VIII: e nerven rot är vänd uppåt. Hålla framställningen med användning av en # 3 tång i området för de båggångarna (Figur 1D).
8. Med hjälp av en skalpell utrustad med en # 11 blad, skär av toppen av snäckan precis apikala till nervroten (Figur 1D).
9. Vrid preparatet så att den skurna delen är vänd uppåt. Använd den främre halvcirkelformade kanalen som ett handtag för att stabilisera beredningen (Figur 1E).
10. Med # 5 pincett, ta bort snäckan på Modiolus nertill basen. Vid den punkt där kroken regionen i hörselsnäckan vänder nedåt, använd en fin sond (hälften av en bruten # 55 pincett) för att lyfta den sista beniga hylla bendefekter spiralen lamina (Figur 1F), avslöjar saccule. Precis under saccule är stigbygeln fotplattan, som är en viktig landmärke. Den utriculus är omedelbart intill stigbygeln fotplattan (Figur 1G), och den är omgiven av ben. Använd sonden till chip benet bort tillräckligt för att avslöja cirka 1/3 av utriculus. Ta försiktigt bort utriculus med # 55 pincett (Figur 1H). Detta förfarande kommer vanligtvis att resultera i avlägsnande av den pigmenterade epitelet taket som det utriculus dras från den beniga beredningen. Om emellertid utriculus avlägsnas med taket epitel intakt, taket kan avlägsnas med användning av # 55 pincett.
11. Utricles för adenovirus infektion (eller levande imaging experiment) måste ha otoconia bort under dissektionen (före infektion).I detta fall kan du använda en luer-lock spruta som är fylld med dissekera media och försågs med en liten nål (vanligtvis 26-28 gauge). Håll utriculus vid kanten med # 55 pincett (Figur 1I). Ta nålspetsen nära utriculus med avfasning av nålen pekar nedåt. Använd en ström av skärande media att blåsa bort otoconia (Figur 1J). Alternativt kan otoconia tas bort genom att borsta dem med en ögonfrans verktyg (Ted Pella, Inc. # 113). Utricles som inte kommer att undergå adenoviral infektion är normalt odlade friflytande i 24-brunnars vävnadsodlingsplattor med otoconia intakt (se nedan för post-fix otoconia avlägsnande, vilket är lättare).
12. När väl alla utricles dissekeras ändrar dissekera media till sterila odlingsmedia: DMEM F12 (Gibco # 11.320) kompletterat med 5% FBS och 50 U / ml penicillin G (Sigma).
13. Utricles odlas vid 37 ° C och _5% CO2. Om odlingarna vara maintagranskat mer än 48 timmar ska hälften av odlingsmedia bytas varannan dag. Kulturer kan upprätthållas under en vecka eller längre.

2. Adenovirus Infektion av stödjande celler

Viktigt: Att arbeta med adenovirus kräver biosäkerhetsnivå 2 (BSL2) förfaranden och certifiering. Kontrollera med din Institutional Biosafety Officer för vägledning och utbildning på BSL2 förfaranden.

1. Dissekera utricles som ovan i dissekering medium (inget serum). Avlägsna otoconia som ovan.
2. När du är redo att infektera, överföra 1 utriculus (hårceller uppåt) i varje brunn i en Nunc mini-fack (Fisher # 12-565-68) innehållande 15 pl serumfritt DMEM F12 (detta är viktigt eftersom serum kan inaktivera viruset) . Denna överföring är lättare med en 1,5 mm microcurette (# 10.082-15 från fina Science Tools).
3. Vår Ad-GFP är serotyp 5 med de virala borttagna E1 och E3 gener och människans CMV promotorn driver transgen (GFP). Detta virus erhölls från Vector Biolabs (Philadelphia, PA vectorbiolabs.com ). Stock virus är anordnade vid titrar av 1,0-4,0 x ¹⁰ 10 ^ PFU / ml. Tillsätt 0,5-2 | il lager viruset till varje brunn innehållande en utriculus (figur 1 liter). Den faktiska mängden som används varierar beroende på viruset och lager titer. Vi infekterar vanligtvis varje utriculus med 1,0-4,0 x 10 ⁷ PFU.
4. Kultur av utricles i virus-innehållande medium vid 37 ° C / 5% CO2 i ₂ timmar. Efter 2 h överfördes utricles tillbaka till 24-brunnars vävnadsodlingsplatta innehållande odlingsmedium med serum. Kultur av utricles över natten vid 37 ° C / _5% CO2.
5. Utricles kan användas nästa dag för levande avbildning experiment, eller de kan rättas till hårceller immunkemi (se nedan). Virala transgenexpression ökar över tiden, så om transgenexpression är låg vid 24 timmar efter infektion kan denfördelaktigt att odla celler under ytterligare 24 timmar i serum-innehållande medium. Om du ser toxicitet hårceller, minska mängden virus som används.

3. Utriculus Fixering, Otoconia avlägsnandet och Immunochemistry

1. Vid slutet av odlingsperioden, fäst utricles i 4% paraformaldehyd under antingen 3 timmar vid rumstemperatur (på en gungande plattform) eller över natten vid 4 ° C. Tvättbetingelser utricles (3 gånger, 15 min vardera) i 0,1 M (1X) Sorensens fosfatbuffert, pH 7,4. Dessa steg utförs i en 24-brunnars vävnadsodlingsplatta.
2. Otoconia borttagning: Anmärkning: Otoconia måste avlägsnas före adenovirus infektion (se steg 1,11 ovan). Emellertid kan utricles som inte att vara infekterade odlas och fixeras med otoconia fortfarande intakt. I detta fall använder de steg som beskrivs här för att ta bort otoconia efter fixering. Kontrollera utricles för alla återstående pigmenterade taket epitel. Ta försiktigt bort eventuellt kvarvarande taket epitel med två # 55 forceps. För att ta bort otoconia, byta Sorensen: s fosfatbuffert med 750-1000 il Cal-Ex Kalklösare (Fisher # CS510-1D). Lämna Cal-Ex på utricles i 1 minut och 40 sekunder (inte överstiger 2 minuter). Ersätta Cal-Ex med 0,1 M Sorensens fosfatbuffert och tvätt (5 gånger, 5 min vardera).
3. Inkubera utricles i natriumborhydrid (Sigma # 452.882, 1% i avjoniserat vatten) under 10 minuter. Tvätta utricles i 0,1 M Sorensens fosfatbuffert (5 gånger, 5 min vardera).
4. Ställe utricles i blockeringslösning (PBS + 2% bovint serumalbumin + 0,8% normalt getserum + 0,4% Triton X-100) under 3 timmar vid rumstemperatur på en vaggande plattform.
5. Tillsätt primära antikroppar och inkubera över natten vid 4 ° C. Anti-myosin 7a (antingen Proteus Biosciences # 25-6790 eller # MYO7A 138-1 från Developmental Studies Hybridoma Bank) på 1:100 i blockerande lösning etiketter alla hårceller. Att separat etikett striolar och icke-striolar hårceller, har vi använt en dubbel-etikett protocol med monoklonal anti-kalmodulin (Sigma # C-3545; 1:150) och polyklonal anti-kalbindin (Chemicon # AB1778, Temecula, CA, USA; 1:200). Sekundära antikroppar (vanligen Alexa Fluor konjugerade sekundära antikroppar från Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) späds 1:500 i blockeringslösning och inkuberades under 4 timmar i mörker vid rumstemperatur på en vaggande plattform.
6. Mount utricles på glasskivor med Fluoromount-G (Southern Biotech, Birmingham, AL, USA).

4. Representativa resultat

Utricles odlades med användning av denna metod bibehåller fullständig komplement av både hårceller och stödjande celler (figur 2). Hårcellerna i friska kulturer visar runt kärnkraft profiler omgivna av tunna cytoplasmatiska regioner som myosin 7a-positiv (figur 2, övre panelen). Stödjande cellerna (märkt med anti-Sox2) är mindre och mer tätt packade än hårceller (figur 2, nedre panelen). Adenovirus infekterar 25-50% av de stödjande celler i utriculus, och inga hårceller är infekterade (Figur 2, Ad-GFP paneler). Det bör noteras att den optimala titem arbetar varje adenovirus måste bestämmas empiriskt, eftersom hår celldöd är möjligt om den virala titern är för hög. Dessutom kommer områdena av mekanisk skada (orsakas under dissektionen) ta upp stora mängder virus. Dessa regioner på mekaniska skador är lätta att urskilja genom en kontinuerlig linje av celler med mycket höga nivåer av GFP-uttryck och saknade celler hår. Detta är i motsats till den spridda GFP-uttryck i stödjande celler i en oskadad kultur (figur 2).

Figur 1. Utriculus Dissection. A:. Auditiv bulla (AB) B: Den bulla är bruten med hjälp av två kraftiga pincett C: Bony cochlean (RW = runda fönstret, S =. stapedial artär, C = snäckan, ST = stigbygeln) D: En skalpellblad (SB) används för att skära av toppen av koklea apikala till den VIII: e kranialnerven ^{(8: e} N) ASC = främre halvcirkulär kanal E..: Beredningen hålls fast med hjälp av en # 3 tång med en gaffel in i främre halvcirkelformade kanalen (ASC) och den andra på den yttersta ben (pilar). Den membranösa labyrint avlägsnas med användning av pincett F:. Med den membranösa labyrint avlägsnas, är den basala varv av spiralen bendefekter lamellen synlig nära hakområdet. En fin sond sätts in under denna beniga hyllan för att lyfta hyllan upp och ta bort den (pilen) G:. Efter avlägsnande av saccule är utriculus (U) synlig omedelbar anslutning till stigbygeln fotplattan (SF) H:. Utriculus (U ) tas bort med hjälp av en # 55 peang (pil) SF = stigbygeln fotplatta I:.. utriculus med otoconia (O) delvis bort end sensoriska epitelet (SO) synliga under J:. Otoconia (O) avlägsnas från utriculus med användning av en ström av medium som levereras av en spruta försedd med en 26-gauge nål. Skuggan av nålen (S) är synlig längst ned på bilden K:. Utriculus med otoconia bort och sensoriska epitelet (SE) synlig L:. Adenovirusinfektion: Varje utriculus (U) placeras i en individuell brunn på en mini -facket. Stödjande cellerna är infekterade med adenovirus genom att pipettera-virus i brunnen (P = pipettspets).

Figur 2. Adenovirus-medierad infektion av stödjande celler. Utricles infekterades med adenovirus som driver expression av grönt fluorescerande protein (Ad-GFP). Visas är konfokala bilder av håret cellskiktet och det bärande cellskiktet i samma område av en utriculus. Hårceller märks med en antikropp mot myosin 7a(Magenta). Stödjande cellerna är märkta med en antikropp mot Sox2 (röd). Schematisk visar strukturen av utriculus sensoriska epitelet och placeringen av hårcellerna (HC) och stödjande celler (SC). Lägena för konfokala (optisk) sektioner som visas i den övre (U) och nedre (L) är panelerna indikeras med streckade linjer i den schematiska. Övre paneler: I konfokala bilder tagna på samma nivå i håret cellkärnan tycks Ad-GFP signal i utrymmena mellan hårcellerna och inte överlappar med håret cellen markören myosin 7a. Lägre paneler: I konfokala sektioner vid nivån för den stödjande cellkärnor, colocalizes Ad-GFP-signal med den bärande cellmarkör Sox-2. Ad-GFP-infektion resulterar i uttryck av GFP i stödjande celler enbart och inga celler hår är infekterade.

Figur 3. Adenovirusinfektion inte leder till död av hårceller eller stödjande celler. Utricles infekterades med Ad-GFP vid 4 x 10 ⁸ PFU / ml. Utricles märktes med antikroppar mot myosin 7a (hårceller markör) och Sox2 (stödjande celler markör). Hårceller och stödja cellräkningar var lika för kontroll utricles och Ad-GFP infekterade utricles.

Discussion

Sensoriska hörselceller är känsliga för död orsakad av en mängd olika spänningar, innefattande åldrande, buller trauma och exponering för ototoxiska läkemedel, inklusive de aminoglykosidantibiotika och det antineoplastiska medlet cisplatin. Hos däggdjur död hår cell resulterar i permanent hörselnedsättning och / eller balans störningar. In vitro-modellsystem är kritiska verktyg för studier som syftar till att fastställa de cellulära och molekylära mekanismerna bakom håret celldöd, samt de som syftar till att förhindra eller motverka döden hårcell . Till skillnad från cochlea hårceller från vuxna däggdjur, hårcellerna i utriculus överlever bra i kulturen. Utriculus hårceller är känsliga till döds från exponering för samma terapeutiska läkemedel som är giftiga för cochlea hårceller, och de cellulära mekanismer som ligger bakom ototoxiska håret celldöd och överlevnad är liknande för både utrikulära och Cochlear hårceller ^12-18. Dessutom, när data som erhållits i utriculus modellsystem är tested in vivo har utriculus preparatet visat sig vara en pålitlig prediktor av hår cellöverlevnad och död i den mogna snäckan ^{12, 18-21.} Musen utriculus preparatet gör också att vi kan undersöka effekterna av specifika proteiner genom att använda utricles från transgena och knockout djur.

De signaler som förmedlar överlevnad och död av sensoriska hårceller under stress är dåligt förstådda. Tyder dock på nya bevis för att andra typer av celler i innerörat kan spela viktiga roller för att avgöra om hårceller under stress slutligen leva eller dö ^{11, 22, 23.} Det utriculus Modellen kan användas för att undersöka dessa kritiska cell-cell interaktioner i ett moget däggdjur sensorisk epitel. Adenoviral infektion ger en metod för att förändra genexpression i stödjande celler, vilket underlättar studier av den roll (er) av stödjande celler i hår cellöverlevnad, död, fagocytos och regenerering.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medium 199	GIBCO, by Life Technologies	12350
DMEM/F12	GIBCO, by Life Technologies	11320
Fine forceps (#55)	Fine Science Tools	11255-20
Fine forceps (#5)	Fine Science Tools	11252-30
Forceps (#3)	Fine Science Tools	11231-30
Penicillin G	Sigma-Aldrich	P3032
Fetal bovine serum	Invitrogen	10082-139
Nunc mini-tray	Fisher Scientific	12-565-68
Adenovirus-GFP	Vector Biolabs	1060*
Cal-Ex decalcifier	Fisher Scientific	CS510-1D
sodium borohydride	Sigma-Aldrich	452882
Anti-Myosin 7a (polyclonal)	Proteus Biosciences	25-6790
Anti-Myosin 7a (monoclonal)	Developmental Studies Hybridoma Bank	MYO7A 138-1
Anti-Calmodulin	Sigma-Aldrich	C 3545
Anti-Calbindin	Chemicon International	AB1778
Fluoromount G	SouthernBiotech	0100-01
Table 1. Reagents and tools used in utricle culture and adenovirus infection
* Note: Ad-GFP is normally provided by Vector Biolabs at a stock titer of 1x1010 PFU/ml. We requested a custom amplification in order to provide the stock virus at a titer of 1.2×1011 PFU/ml.