Beredning av ett Awake mus för inspelning Neural svar och injicera Spårämnen

Summary

Elektrofysiologisk karaktärisering av neuronala svar är viktigt för att förstå hjärnans funktion och för att styra placeringen av färgämnen för väg spårning. Men många studier utförs i sövda djur. För att förstå hjärnans funktion utan bedövningsmedel, har vi utvecklat en metod för att spela in neuronala svar egenskaper och injicera färgämnen i Vakna mus.

Abstract

Det är väl känt att bedövningen förändrar neurala svar egenskaper i olika regioner i hjärnan. ^13. I hörselsystemet är grundläggande respons egenskaper hos hjärnstammen nervceller, inklusive tröskeln, frekvens specificitet och hämmande sidband förändras i betydande sätt under narkos ^1-2. Dessa observationer uppmanas fysiologer att söka vägar att spela in från enskilda nervceller utan förorenande effekterna av anestesi. Ett resultat blev en decerebrat beredning, där hjärnstammen var fullständigt transekterades vid nivån för mitthjärnan ^4. Nackdelarna med denna beredning är en formidabel kirurgi, eliminering av fallande prognoser från framhjärnan, och en oförmåga att använda sensorisk stimulering för att undersöka strukturer ovanför mitthjärnan. En annan strategi har varit att implantera elektrodgrupperna kroniskt för att spela in från enskilda nervceller och multiunit kluster medan djuret är vaken och / eller beter ^5,6 7-9 till mus ^10-12. Med denna metod kan vi genomföra elektrofysiologiska inspelningar under flera dagar i oanestetiserade musen. I slutet av inspelningarna kan vi injicera sedan ett färgämne för att rekonstruera elektroden positioner och platser inspelning eller injicera en tracer så att vägar till och från inspelning loci kan bestämmas. Denna metod gör det möjligt för väl isolerade enda neuron inspelningar under flera dagar utan användning anestetika.

Protocol

1. Huvudstödsanordningar Översikt

1. Att montera en specialbyggd huvud-post, mata in en 1/16 "rostfritt stål vals stift vinkelrätt i ett hål borrat i en 3/32" stav av rostfritt stål för att bilda ett kors. Den vertikala delen av huvudet i efterhand bör vara omkring 20 mm och den horisontella tvärstycke ca 15 mm. Tryck på en ände av den vertikala stången för att acceptera en # 1-72 skruvar. (Fig 1).
2. Under operation och inspelningen är huvud-post fast i en specialbyggd mässing eller aluminium montering bar med en # 1-72 skruv (Fig. 2). Den långa delen av monteringsstycket bör vara ca 90 mm lång och 5-10 mm breda. Den huvud-inlägg passar i ett spår skuret i en 15 mm förlängning av den långa stången som är vinklad 45 °. För att förhindra huvud rotation tvärstycket av huvud-post inbäddat i en liten skåra på botten av monteringsstycket.
3. Monteringen bar i fäst sedan till en skräddarsydd aluminium montering blockk (Fig. 3). Monteringsblocket är ca 30 mm x 30 mm x 25 mm. Detta monteringsblock är fäst till en mikromanipulator så att läget hos huvudet i efterhand noggrant kan placeras längs med mittlinjen och vid bregma. Monteringsblocket är tillverkad av två stycken är försedda med skruv. En utskuren i blocket tillåter monteringsstycket att glida in och säkras med skruvar. Monteringsstycket är parallell med bordsytan. Under inspelning, säkra bar i en anpassad stereotaktisk ram (bild 4). Den stereotax är utformad för montering av stången i samma position som i monteringsblocket under kirurgi. Detta arrangemang säkerställer att musen alltid kommer att anpassas till stereotaktisk ram över experimentella sessioner.
4. Skära en volfram stång (diameter 0,010 ") till ungefär 5 mm längd, med ca 1 mm böjning vid 45 °. Denna stav tjänar som jordstiftet (fig. 1).

2. Stereotaxisk Alignment för kraniotomi

OBS: Alla förfaranden som beskrivs nedan är aseptisk kirurgiska tekniker och har godkänts av Washington State University Animal Care and Use kommittén och Animal Ethics kommitté Garvan Institute.

1. Bedöva mus genom att placeras i en induktionskammare med 5% isofluran. Avsaknaden av en reaktion på svans och / eller tå nypa ser till att djuret är helt bedövad.
2. Placera musen i en gnagare stereotaktisk ram utrustad med en mus adapter (Stoelting). Att orientera musen korrekt placera tänderna i hålet för bettet baren och dra näsan klämman så det är tätt. Placera musen så rakt som möjligt i bettet baren och näsan klämma. Placera en ansiktsmask tillverkad av en bit av latex handske över musens nos, och hålla isofluran vid 5% till dess att musens andningsfrekvensen är ungefär 1 andedräkt / sek. Vrid isofluran till 1,5 - 2,0%. Fäst huvudet med tHan öron-bar var noga med att inte punktera trumhinnan. Barer skall sitta stadigt men inte tränger för djupt in i hörselgången.
3. Placera en värmedyna under musen.
4. Applicera oftalmisk salva för att förhindra att ögonen torkar ut.
5. Raka hårbotten från mellan öronen upp till ögonen med en liten rakapparat eller fin-point sax.
6. Rengör och sterilisera hårbotten genom att torka med klor-hexidine (eller Betadine) scrub följt av alkohol skölj upprepas 3 gånger.
7. Att avlägsna huden över toppen av skallen göra ett snitt längs mittlinjen från baksidan av huvudet till ögonen.
8. Skrapa periosteum till kanterna av snittet med en skalpell. Vid behov (beroende på experimentell mål), försiktigt dra tillbaka muskulaturen på baksidan av halsen med pincett, vilket gör att muskeln att riva längs fasciklar för att minimera blödning. Applicera Gelfoam under hårbotten vävnad för att minimera fukt och hindrar huden från att röra sig över skallen.
9. Torka skallytan med en applikator med bomullstopp fuktad med isopropylalkohol för att förbättra visualiseringen av skallen landmärken.
10. Rikta skallen till standard stereotaktisk koordinater ^13. Sätt en fin-punkt sond i elektroden hållaren och anslut den till stereotaktisk mikromanipulator. En skärpt metallstav fungerar väl för detta ändamål (fig. 5).
11. Använda den punkt att identifiera Bregma (fig. 5A) och lambda (fig. 5B) på skallen. Flytta sonden fram-och tillbaka mellan dessa punkter, kontrollera att den laterala-mediala koordinat för varje plats inte avviker mer än 50 | im. Flytta huvudet efter behov genom att försiktigt lossa öron-barer, flytta huvudet och öron-bar i sidled och sedan dra åt öron-barer.
12. Verifiera att dorsal-ventral höjd vid varje plats inte avviker mer än 50 | im. Justera höjden av näsan-klämma, som kommer att rotera i skallen runt axeln för de öron-stängerna,att jämna delningen av skallen vid behov. Höjden av örat-stången kan även vara nödvändigt justeras.
13. Använd en atlas ¹³ för att identifiera koordinaterna för målet av intresse (Fig. 5C) i förhållande till bregma. Markera skallen över målet (t.ex. ett "X" eller använda tusch för att dot fyra hörn av en kvadrat) där en kraniotomi kommer att göras (Fig. 5D).

3. Head-post och Ground Pin installation

1. Använd etch gel för att rengöra skalle. Använd applikatorn för att skrubba och sprida etch gel över hela ytan (10 sek). Tvätta med vatten och torka helt. Applicera primer för dentala cement till skallen ytan med applikator. Sprid lim med ny applikator. Härda limmet med en UV-ljus-pistol (1 cykel).
2. Välja en plats för jordstift som är distal till målstället. Försiktigt borra ett litet hål i skallen hjälp av spetsen på en # 65 miniblade skalpell precis tillräckligt bred för den korta änden av marken pi att komma in och vila på hjärnhinnorna. Jordstiftet bör vara orienterade så att den är riktad bort från Bregma och framtiden huvud-inlägg (Fig. 6A).
3. Fäst huvudet post till monteringsstången och blockera och fäster vid mikromanipulator. Genom att flytta mikromanipulator i tre dimensioner, placera huvudet-post via Bregma bara röra skallen (Fig. 6B). Basen i huvudet-post ska ligga platt på skallen.
4. Med dissekering sonder, applicera en liten mängd dentala cement runt huvudet-post och jord stiftet (bild 6C). Tryck på cement för att garantera god kontakt med skallen. Obs: Använd inte för mycket cement eller det kommer inte hårdnar jämnt. Härda cementen med en UV-ljus-pistol (3-4 cykler från flera vinklar).
5. Applicera den andra etappen av cement och bygga upp basen runt huvudet-post och täcka spåren av huvudet-post (Fig. 6D).

4. Kraniotomi

1. Lokalisera kraniotomi referensmärke, som kommer att partiellt skymd av primern. Använd en # 65 skalpell för att markera en 3 mm x 3 mm fyrkant runt den här webbplatsen och tillämpa en droppe av lidokain för att minska känsligheten och minimera blödning.
2. Göra flera poäng på varje sida av torget (så många som 10), är noga med att inte skära igenom benet och in i hjärnan (Fig. 7A).
3. När väl benklaffen lossnar, med spetsen av den skalpell för att bända upp den, som lämnar den dura mäter intakt (fig. 7B).
4. Täck med ben vax.

5. Efter operation

1. Stänga gasanestesi och avlägsna mus från stereotaktisk ram.
2. Använd en bomullspinne att tillämpa Lidokain salvan runt utsätts huden för att dämpa känsla runt såret. Använd en annan bomullspinne att tillämpa Neosporin på exponerad hud. Spruta ketoprofen (5 mg / kg IM eller IP baserad på önskemål av enskilda lACUC veterinärer) somen post-operation smärtstillande. Musen kommer i allmänhet och flyttas inom några minuter av gas upphör.
3. Placera musen i en varm bur och bildskärmen tills den är redo att återvända till djurstallar.
4. Djuret bör kontrolleras minst en gång per dag efter det har återhämtat sig från operationen. Se upp för tecken på dålig kost och / eller dricka och håglös beteende. Om smärtan misstänks ge ketoprofen var 24 timmar (samma dos som i slutet av post-operation) tills lindras. Lidokain kan lokalt appliceras på såret om djuret kliar eller visar tecken på obehag. Djur återhämta vanligtvis från operation utan komplikationer eller smärta.

6. Inspelning och Dye Injection

1. Vänta minst en dag efter head-post operation innan du använder musen för inspelningar.
2. Placera mus i en skum-fasthållningsanordningen formas för att musens kropp. Musen har redan anpassats till denna enhet, och därmed minska sin ångest. Typisk anpassning ärför att hantera musen varje dag efter avvänjning och för cirka en vecka före operation och experiment, placera musen i skummet enheten för 1-5 minuter. Suspendera anordning i den stereotaktiska ramen (fig. 4).
3. Säker huvud-post till montering bar, som nu är fixerad till stereotaktisk ram (bild 4).
4. Anslut till marken pin med en tråd avslutas med en trubbig 22-gauge injektionsnål spets.
5. Avlägsna benvax över kraniotomi. Ta bort dura om nödvändigt hjälp av spetsen på en miniblade skalpell.
6. Kör elektrod till rätt stereotaxisk plats och börja spela in (Fig. 8). Under endast Elektrofysiologiska registreringar kan en mängd olika elektroder användas. Valet av elektroden är beroende på läget och typen av erfordras inspelningar. Valet av elektrod för den vakna mus inspelningarna kommer att vara samma som vad forskare använder i en sövd mus. För kombinerade elektrofysiologiska inspelningar medfärgämne / spårämne injektioner, är en mikropipett elektrod som används ^10. Mikropipetten är fylld med färgämnet / spårämne i val, så att den jontoforetiskt kan injiceras vid slutet av elektrofysiologiska experiment. Multibarrel elektroder kan även användas för att farmakologiska manipulationer kan göras. Den multibarrel elektroden är monterad på en enda inspelning mikropipett (fig. 8). Dessa tekniker är standard i litteraturen och är inte olika för sövda kontra vaken inspelningar.
7. Inspelningar kan göras för 4-5 timmar under 3-4 dagar i följd.
8. I slutet av inspelningen, kan färgen / spårämnet injiceras. Eftersom det inte finns några smärtreceptorer i hjärnan, är den jontoforetiska injektion av färgämne eller spårämnet i hjärnan osannolikt att orsaka obehag. Men när elektrofysiologiska respons hos den region där injektionen skall göras kännetecknas kan djuret bedövas med isofluran feller injektion. Detta skulle eliminera eventuella oönskade känslor. Eftersom färgämnet / spårämne redan finns i mikropipetten, kan de aktiva och jordledarna kopplas om från den elektrofysiologisk registrering uppbyggnaden till strömgeneratorn för att jontoforetiskt tillföra färgen / spårämne. Använd lämpligt protokoll för att färgen / spårämne i elektroden. Ta bort djuret från headpost återhållsamhet och kroppen återhållsamhet och återgå till sitt hem bur.
9. Vid slutet av experimentet, följer lämpligt protokoll för eutanasi och vävnadsbehandling att återvinna injektionsstället och märkning.

7. Representativa resultat

Lyckad installation av huvud-post gör att försöksledaren att spela singel-och multiunit svar från en oanestetiserade, vakna musen över flera dagar. Fasthållningsanordningen möjliggör stabila elektrofysiologiska registreringar av enskilda nervceller i hjärnan. Utmärkt isolering av enskilda enheter och starka reaktioner to stimuli kan spelas in från samma hjärnstrukturen över flera dagar, till exempel i mus underlägsna colliculus (Fig. 9A, dag ett, figur 9B, dag två). Med ett bra huvud-post installationen kommer varje mus att konsekvent anpassas till stereotaxisk apparat och mus stereotaktisk atlas, ¹³ resulterar i tillförlitliga lokalisering av särskilt hjärnans kärnor. Denna pålitliga lokalisering möjliggör injektion av färgämnen och spårämnen i specifika strukturer efter flera inspelningar dagar. Till exempel, för att bedöma fallande prognoser från auditiva mitthjärnan till hörsel hjärnstammen, biotinylerade dextran amin (visualiseras med diaminobensidin som kromagen) kan injiceras i musen inferior colliculus (Fig. 10A) efter elektrofysiologiskt att identifiera neuronala svar egenskaper vid injektionsstället (i FIG. 10A, var en neuron registrerades med en bästa frekvens av 51 kHz), och efter vävnadsbehandling, ennterograde märkning i kontralaterala dorsala Cochlear Nucleus kan man visualiseras och ritas (Fig. 10B). Mikrofotografier med högre upplösning kan även erhållas för att visa anterogradely märkta axoner och terminaler (Fig. 10C).

Figur 1.

Figur 2.

Figur 3.

Figur 4.

Figur 5.

Figur 7.

Figur 8.

Figur 9.

Figur 10.

Discussion

Fördelen med huvudet-post fasthållningsanordning för elektrofysiologiska och neuroanatomisk experiment i mus är att experiment kan utföras med obedövade och vakna möss, vilket eliminerar risken svar förorening på grund av anestetiska läkemedel. Dessutom upp den inställda kan användas över flera dagar för att möjliggöra mer effektiv djur.

De flesta komponenter för huvud-post finns off-the-shelf. Endast huvud-post och montering apparater är skräddarsydd, som båda är relativt enkel att konstruera och kan återanvändas. Om en verkstad är inte tillgänglig på en institution, kan forskaren använda sannolikt http://www.emachineshop.com/ att tillverka de nödvändiga komponenterna.

Duktiga kirurgiska kunskaper är nödvändiga. Kirurger måste vara skickliga med fina kirurgiska tekniker, av vilka några är bäst görs under ett mikroskop. Den operation måste göras under aseptiska förhållanden. Ta bort skallen fliken är den känsligaste punkten i förfarandet. Genom att noggrant och försiktigt göra flera poäng med en skalpell längs 4 sidor av rektangeln samtidigt som du tittar genom en operativ mikroskop kan skallen fliken vara "poppade off" med minimal blödning, lämnar dura mater intakt. Förtrogenhet med den underliggande kärlsystemet är viktigt, gör ett snitt över en större blodkärl skapar en risk för oönskad blödning. Eftersom vår forskning fokuserar på hörselsystemet har vi undvikit att använda borrar för att utföra craniotomies för att minimera risken för ben genomfördes-innerörat trauma.

Det är viktigt att få den främre-bakre planet och i stereotaxisk linje innan du sätter fast huvudet-post. Denna försiktighetsåtgärd säkerställer att huvudet kommer att förbli nivå över experimentella studier och underlättar placeringen av hjärnan loci med en hjärna Atlas.

tält "> För inspelning är det lämpligt att hantera musen på en daglig basis för ett par dagar före operation. Bara att få musen utsätts för hantering och återhållsamhet i skummet enheten underlättar längre inspelningar med mycket reducerad stress och rörelse musen. Nyckeln är att ha musen passa väl i skummet sandwich. Om djuret kan röra sig överdrivet, tenderar det att kämpa hela tiden. Om musen börjar kämpa, är det bäst att avsluta inspelningen och plocka upp igen nästa dagen. musens rörelser resulterar i stora biopotentialer i inspelningar som inte framkallade av stimuli. Dessa är i allmänhet större amplitud som aktionspotentialer och är intermittent. Movement artefakter kan också genereras av inspelningen trådarna vidrör djuret. Det är viktigt att säkerställa att det inte finns några ledningar vidrör djuret. Sammantaget har denna teknik gett oss möjlighet att genomföra flera studier om auditiva bearbetning och anatomi utan användning av bedövningsmedel.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Etch gel for cleaning skull prior to dental cement	Henry Schein	101-5396	12/pk with 1.2 mL syringes
Primer for dental cement	Kerr Optibond	25881	8 mL bottle
Adhesive for dental cement	Kerr Optibond	25882	8 mL bottle
Applicators for dental cement	Kerr Optibond	24680	200/pk
Dental Cement	Charisma, Heraeus Kulzer	66000085	4gm Syringe Refill
Tungsten Rod (Ground Pin)	A-M Systems	717200	0.010" diameter
Economy UV Curing Light	Henry Schein	CU-80
Head-post	Built in-house
Mounting bar	Built in-house
Mounting block	Built in-house
Stereotaxic Frame	David Kopf Instruments	902
Mouse and Neonatal Rat Adaptor	Stoelting Co.	51625
Deltaphase Isothermal Pad	Braintree Scientific, Inc.	39DP