Summary
神経応答の電気生理学的特性は、脳機能を理解するためと経路トレース用染料の配置を導くために重要である。しかし、多くの研究は麻酔下の動物で行われます。麻酔なしで脳機能を理解するために、我々は、ニューロンの応答特性を記録し、覚醒マウスの色素を注入する手法を開発した。
Abstract
これはよく麻酔は脳の様々な領域で神経応答特性を変化させることが知られている13。聴覚系では、しきい値、周波数特異性、阻害側波帯を含む脳幹の神経細胞の基本的な応答特性は、麻酔下に1から2の重要な方法で変更されます。これらの観察結果は、生理学者は、麻酔の汚染影響を与えることなく単一ニューロンから記録する方法を模索するように求められます。つの結果は、脳幹が完全に脳の4レベルで切断しました除脳の準備でした。この製剤の欠点は手ごわい手術、脳からの下降の予測を排除し、中脳、上記の構造を調べるために感覚刺激を使用することができないことがあります。動物が目を覚まし、そして/または、5,6に動作している間に別の戦略は、単一のニューロンとマルチユニットクラスタから記録するために慢性的に電極アレイを移植してきました10月12日にコウモリ7-9に使用されるヘッドレスト技術を適応している。この方法を使用して、我々は無麻酔マウスで数日間電気生理学的記録を行うことができます。レコーディングセッションの終わりに、我々は、電極の位置と記録部位を再構築するかにと記録座からの経路を決定することができるようにトレーサーを注入する色素を注入することができます。このメソッドは使用せずに、複数の麻酔薬日間も隔離された単一ニューロンの記録を可能にします。
Protocol
1。頭部拘束の概要
- 特注のヘッドポストを組み立てるために、クロスを形成するためにステンレス製のロッド"3/32にドリル穴に垂直にステンレス製のロールピン" 1月16日を挿入します。頭部ポストの垂直部分は約20mmと15 mm程度水平断面部分でなければなりません。 ＃1から72までネジを受け入れるように垂直ロッドの一方の端をタップします。 （ 図1）。
- 手術や録音中に、頭のポストは、＃1から72ネジ（ 図2）特注の真鍮やアルミの取り付けバーに固定されています。取り付けバーの長い作品は約90 mm長、幅5〜10ミリメートルでなければなりません。頭ポストは45度で傾斜している長いバーオフ15 mmの拡張子に溝カットに収まる。取り付けバーの下部にある小さな溝に頭の回転、ヘッドポスト程近い場所にありますの桟を防ぐことができます。
- カスタムメイドのアルミ取り付けブロックに取り付けられた後の取り付けバーK（ 図3）。取り付けブロックは約30ミリメートル×30ミリメートル×25 mmである。頭部ポストの位置を正確に正中線に沿って、ブレグマに配置することができますように、この取付ブロックは、マイクロマニピュレータに取り付けられています。取り付けブロックは、ネジと一緒に取り付けられて2つの部分から構成されています。ブロック内のカットアウトは、取り付けバーがでスライドし、ネジで固定することができます。マウント·バーは、テーブルの表面に平行である。録音中に、カスタム定位フレーム（ 図4）でバーを固定します。 stereotaxは、手術時の取付けブロックと同じ位置にバーをマウントするために設計されています。この配置は、マウスは、常に実験的なセッションをまたいで定位フレームに配置されることが保証されます。
- 45℃で約1 mmの曲げて、約5 mmの長さにタングステン棒（直径0.010 "）を切り取ります。このロッドはグランド·ピン（ 図1）としての役割を果たします。
2。定位アル開頭術のためにignment
注：すべての手順は、標準的な無菌手術手技に従う以下の通りとワシントン州立大学動物のケアと使用委員会とガーバン研究所の動物倫理委員会によって承認されている。
- イソフルラン5％誘導チャンバ内に配置することにより、マウスを麻酔。尾、そして/または、つま先のピンチへの反応の欠如は、動物が完全に麻酔であることを保証します。
- マウスアダプタ（Stoelting）装備げっ歯類の定位フレームにマウスを置きます。マウスの向きに、かまバーの穴の内側に歯を配置し、それがぴったりされるようにノーズクランプを締めます。一口バーと鼻クランプでできるだけまっすぐにマウスを置きます。マウスの鼻上のラテックス手袋の部分から作られたフェイスマスクを置き、マウスの呼吸速度が約1息/秒になるまで5％イソフルランを保持します。 1.5にイソフルランを回し - 2.0％。トンを使用してヘッドを固定します彼の耳·バーではなく穿刺鼓膜に注意して。バーがぴったりになりますが、外耳道に深く浸透するべきではありません。
- マウスの下に加熱パッドを配置します。
- 乾燥から目を防ぐために、眼軟膏を適用します。
- 小さなシェーバーや細かい点をはさみで上耳の間から目に頭皮を剃る。
- アルコールに続いてスクラブ塩素hexidine（またはbetadine）で拭いて頭皮をきれいにし、消毒を3回繰り返してすすぎます。
- 頭蓋骨の上に皮膚を削除するには、頭の後ろから目に正中線に沿って切開を行います。
- メスで切開の端に骨膜をこすり。 （実験ターゲットに応じて）必要に応じて、慎重に筋肉出血を最小限に抑えるために束に沿って裂くできるように、鉗子で首の後ろに筋肉を撤回。水分を最小限にし、頭蓋骨を介して移動するから肌を防ぐために、頭皮の組織の下にgelfoamを適用します。
- 頭蓋骨のランドマークの可視化を強化するためにイソプロピルアルコールで湿らせた綿棒で頭蓋骨表面を乾燥させます。
- 標準の定位座標13〜頭蓋骨を合わせます。電極ホルダーの微細探針を挿入し、定位マイクロマニピュレータに取り付けます。シャープ金属棒は、この目的に適しています（ 図5）。
- 頭蓋骨のブレグマ（ 図5A）およびラムダ（ 図5B）を識別するためにポイントを使用します。それぞれの場所の横内側座標は以上50μm以下で異なることを確認し、これらのポイント間の往復プローブを移動します。慎重に横方向に頭と耳のバーをずらして、耳棒を締め、耳·バーを緩めて、必要に応じてヘッドの位置を変更します。
- それぞれの場所で背腹軸の高さはこれ以上50μm以下で異なっていることを確認します。耳棒の軸の周りに頭蓋骨を回転させ、鼻クランプの高さを、調整する必要に応じて、頭蓋骨のピッチレベルに設定します。耳バーの高さも調整する必要があります。
- ブレグマ相対的関心の対象（ 図5C）の座標を特定するためにアトラス13を使用しています。開頭術が行われるターゲット（例えば、 "X"または正方形のドット四隅に墨を使用）（ 図5D）上記の頭蓋骨をマークします。
3。ヘッドポストとグランド·ピンの取り付け
- 頭蓋骨をきれいにエッチングゲルを使用しています。表面上のエッチングゲルをスクラブし、広めるためにアプリケータを使用して（10秒）。水で洗い、完全に乾かします。アプリケーターを用いて頭蓋骨の表面に歯科用セメント用のプライマーを適用します。新しいアプリケーターを有する接着剤を広げた。 UVライトガン（1サイクル）を有する接着剤を硬化させます。
- 標的部位への遠位であるグランド·ピンの場所を選択します。慎重に地面pの短い方の端のためだけに十分に広い第65 minibladeメスの先端を使って頭蓋骨に小さな穴を開けると入力し、髄膜に残り部分に。グランド·ピンは、ブレグマと将来のヘッドポスト（ 図6A）から離れて向くように配向しなければなりません。
- 取り付けバーやブロックにヘッドポストを確保し、マイクロマニピュレーターに取り付けます。三次元でマニピュレータを移動することにより、（ 図6B）だけで頭蓋骨に触れ、ブレグマを介してヘッドポストに配置します。ヘッドポストのベースは、頭蓋骨の上に平らになるようにします。
- 解剖プローブを使用して、頭ポストとグラウンド·ピン（ 図6C）を中心に歯科用セメントの少量を適用します。頭蓋骨との良好な接触を確保するためにセメントを押します。注：それは硬化が均一にできませんあまりにも多くのセメントを使用したりしないでください。 UVライトガン（複数の角度3から4サイクル）とセメントを硬化させます。
- セメントの第2段階を適用し、頭部ポストの周りにベースを構築し、ヘッドポスト（ 図6D）の溝をカバーしています。
4。開頭術
- 部分的にプライマーによって隠される開頭リファレンスマークを探します。このサイトの周りに3mm×3mmの正方形をマークし、感度を減らすために、出血を最小限に抑えるためにリドカインのドロップを適用するためにメス＃65を使用しています。
- （ 図7A）骨を通って脳に切らないように注意して、正方形の各側（多くの10など）上で複数のスコアを確認します。
- 骨弁が緩んになると、硬膜をそのままにした（ 図7B）、それを詮索するメスの先端を使用しています。
- 骨のワックスでカバーしています。
5。術後
- ガス麻酔をオフにして、定位フレームからマウスを削除します。
- 傷の周りの感覚を和らげるために露出した皮膚の周囲にリドカイン軟膏を適用するには綿棒を使用しています。露出した皮膚にネオスポリン適用するために別の綿棒を使用しています。ケトプロフェン（個々のIACUCの獣医師の好みに基づいて5 mg / kgのIMまたはIP）として注入する術後の鎮痛剤。マウスは、一般的に起動され、ガス停止後数分以内に移動します。
- 暖かいケージにマウスを置き、それが動物のハウジングに戻す準備が完了するまで監視します。
- それは手術から回復した後の動物は、少なくとも1日1回で確認する必要があります。貧しい食生活および/または飲料と物憂げな行動の兆候を監視します。痛みが疑われる場合には、緩和されるまで24時間ごとに（手術後の終了時と同じ用量）ケトプロフェン提供しています。動物が傷や不快感の兆候を示している場合リドカインは局所的に創傷に適用することができます。動物は一般的に合併症や痛みを伴わない手術から回復します。
6。録音および色素注入
- 録音用のマウスを使用する前に、頭術後後、少なくとも一日待ってください。
- マウスの体に成形発泡拘束装置にマウスを置きます。マウスは、すでにそれによってその不安を減らすことは、このデバイスに適応されています。典型的な適応は、手術と実験の前に、離乳後約一週間毎日マウスを処理するために、1-5分間泡デバイスにマウスを置きます。定位フレーム（ 図4）でデバイスを一時停止します。
- 今定位フレーム（ 図4）に固定された取付バーに頭をポスト安全です。
- 無愛想な22ゲージの皮下注射針の先端で終了線とグランド·ピンに接続します。
- 開頭の上に骨蝋を削除します。 minibladeメスの先端を使用して、必要に応じて硬膜を除去します。
- 適切な定位位置に電極を駆動し（ 図8）録音を開始します。唯一の電気生理学的記録については、電極のさまざまな使用することができます。電極の選択は、必要な記録の位置と種類に依存しています。覚醒マウスの録音のための電極の選択は、研究者が麻酔をマウスで使用するものと同じになります。を組み合わせた電気生理学的記録のために色素/トレーサー注射、マイクロピペット電極10を使用されています。マイクロピペットは、それがiontophoretically電気生理学実験の終了時に注入することができるように、選択した染料/トレーサーで満たされている。 Multibarrel電極は、薬理学的操作を行うことができるように使用することもできます。 multibarrel電極が単一の記録マイクロピペット（ 図8）にマウントされています。これらの技術は、文献では標準であり、麻酔対覚醒録音の違いはありません。
- 録音は3から4日間連続して上の4-5時間のために行うことができます。
- レコーディング·セッションの終了時に、染料/トレーサーを注入することができます。脳内の痛みの受容体が存在しないため、脳への染料またはトレーサーのイオン導入注入は不快感を引き起こすことはほとんどありません。注入がなされるべき領域の電気生理学的応答特性が特徴付けされた後しかし、動物はイソフルランで麻酔し、Fかもしれませんまたは注射。これは任意の潜在的な望ましくない感覚をなくすだろう。色素/トレーサーはマイクロピペット内にすでに存在するので、アクティブとグラウンドのリード線はiontophoretically染料/トレーサーを注入するために電気生理学的記録セットアップから現在の発電機に切り替えることができます。電極における色素/トレーサーのために適切なプロトコルを使用しています。 headpost抑制と身体拘束から動物を削除し、そのホームケージに戻ります。
- 実験の終了時に、注射部位とラベリングを回復するための処理を安楽死や組織のために適切なプロトコルに従ってください。
7。代表的な結果
頭ポストが正常にインストールされて実験者が複数日間の無麻酔、覚醒マウスからシングルおよびマルチユニットの応答を記録することができます。拘束装置は、脳内の単一神経細胞の安定した電気生理学的記録を可能にします。シングルユニットと強力な応答tの優れたアイソレーションoの刺激はマウス下丘（; 図9B、二日目図9A、初日）の例では、複数日にわたって同じ脳の構造から記録することができます。良い頭のポストインストールでは、各マウスは、一貫して定位固定装置と特定の脳核の信頼性の高いローカライズ、その結果、マウス脳地図、13に整列されます。この信頼性の高いローカライゼーションは、複数の記録日後に特定の構造体に染料およびトレーサーの注入が可能になります。たとえば、聴覚中脳から聴覚脳幹への投射を降順評価するために、デキストランアミン（chromagenとしてジアミノベンジジンを用いて視覚化）電気生理学的に注射部位のニューロンの応答特性を識別した後、マウス下丘（ 図10A）に注入することができビオチン（ 図10Aに、ニューロンが51 kHzの最高周波数で記録された）、および組織処理後、反対側の背側蝸牛神経核でnterograde標識は可視化した（ 図10B）にプロットされたことができます。より高い分解能で顕微鏡写真も順向性に標識された軸索と端末（ 図10C）を表示するために得ることができます。
図1。
図2。
図3。
図4。
図5。
図7。 
図8。 
図9。 
図10。
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Discussion
マウスの電気生理学的および神経解剖学実験のための頭部ポスト拘束システムの利点は、実験は麻酔薬に起因する潜在的な応答の汚染を排除し、無麻酔、覚醒したマウスで行うことができるということです。さらに、セットアップがより効率的な動物の使用を可能にするために複数の日にわたって使用することができます。
ヘッドポストのほとんどのコンポーネントは、既製の用意されています。頭だけポストと取付装置は、カスタムメイドであり、構築するのが比較的簡単で、再利用可能などちらも。機械工場は、施設で利用できない場合は、研究者は、おそらく使用することができますhttp://www.emachineshop.com/必要なコンポーネントを製造する。
熟練した外科的なスキルが必要です。外科医は、最高の顕微鏡の下に行われるいくつかの微細な外科技術を持つ熟練しなければなりません。ザ手術は無菌条件下で行わなければなりません。頭蓋骨のフラップを削除する手順の中で最もデリケートな点です。手術用顕微鏡を見ながら慎重にゆっくりと、四角形の4辺に沿ってメスを持つ複数のスコアをすることによって、頭蓋骨のフラップは、硬膜をそのまま残し、最小限の出血で "ポップ"することができます。基礎となる血管系に精通しては、主要な血管、上記のカットは望ましくない出血のリスクを作成することとして、必要不可欠です。我々の研究は、聴覚系に重点を置いているので、我々は、骨導超内耳の外傷の可能性を最小限に抑えるために、開頭術を行うためのドリルの使用を避けてきました。
ヘッドポストを取り付ける前に、前後面のレベルを取得し、定位配置ですることが重要です。この予防措置は、頭は実験的な臨床試験全体のレベルが残ることを保証し、脳アトラスを用いて脳の遺伝子座の位置を容易にします。
テントは ">録音のためには、手術前に数日間毎日のようにマウスを処理するのに便利です。だけで泡装置で処理し、拘束にさらされたマウスがはるかに減少し、ストレスや運動となったレコーディング·セッションを容易に得るマウスキーは、マウスが泡サンドイッチにぴったりフィットすることです。動物が過度に移動することができます場合は、継続的に苦労する傾向があります。マウスが苦労して起動した場合、それは、レコーディング·セッションを終了し、再び次のをピックアップするのが最善の方法です刺激によって誘発されていない録音に大きなbiopotentialsでマウスの結果の日。運動は、これらは活動電位とは、断続的であることを一般的に大きな振幅である。運動の成果物も動物に触れて記録線によって生成することができます。ことが重要です動物に触れない線が存在しないことを確認する。全体として、この技術は、私たちは麻酔を使用せずに、聴覚処理と解剖学上の複数の研究を実施することができました。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
我々は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
NSFの助成金0920060、NIHの助成金DC004395、NHMRC助成金1009482、科学と医学研究のNSW Office、およびガーネットPasseのとロドニー·ウィリアムズ記念財団によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Etch gel for cleaning skull prior to dental cement | Henry Schein | 101-5396 | 12/pk with 1.2 mL syringes |
| Primer for dental cement | Kerr Optibond | 25881 | 8 mL bottle |
| Adhesive for dental cement | Kerr Optibond | 25882 | 8 mL bottle |
| Applicators for dental cement | Kerr Optibond | 24680 | 200/pk |
| Dental Cement | Charisma, Heraeus Kulzer | 66000085 | 4gm Syringe Refill |
| Tungsten Rod (Ground Pin) | A-M Systems | 717200 | 0.010" diameter |
| Economy UV Curing Light | Henry Schein | CU-80 | |
| Head-post | Built in-house | ||
| Mounting bar | Built in-house | ||
| Mounting block | Built in-house | ||
| Stereotaxic Frame | David Kopf Instruments | 902 | |
| Mouse and Neonatal Rat Adaptor | Stoelting Co. | 51625 | |
| Deltaphase Isothermal Pad | Braintree Scientific, Inc. | 39DP |
References
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