Summary
Nöronal yanıtların Elektrofizyolojik karakterizasyonu beyin fonksiyonu anlamak için ve yol izleme için boyaların yerleştirme yönlendirmek için önemlidir. Bununla birlikte, birçok çalışma anestetize hayvanlarda gerçekleştirilir. Anestezi olmadan beyin fonksiyonu anlamak için, nöronal yanıtı özellikleri kaydetmek ve uyanık fare boya enjekte etmek için bir yöntem geliştirdi.
Abstract
Biliyorsunuz anestezi, beynin çeşitli bölgelerinde nöral cevabı özelliklerini değiştirir olduğu bilinmektedir. 13. Işitme sistemi olarak, eşik, frekans özgüllük ve inhibitör sidebands dahil olmak üzere beyin sapı nöronları temel yanıtı özellikleri anestezi altında 1-2 belirgin şekilde değişmiş. Bu gözlemler fizyolojistleri anestezi kirletici etkisi olmayan tek nöronlardan kaydetmek için yollar aramaya sevk etti. Bir sonuç beyin sapı tamamen Ortabeyin 4 seviyesinde transeksiyon bir decerebrate hazırlanması, idi. Bu hazırlık sakıncaları müthiş bir ameliyat, ön beyin gelen projeksiyonlar inen ortadan kaldırılması ve orta beyin yukarıdaki yapıları incelemek için duyusal stimülasyon kullanmak için bir yetersizlik vardır. Farklı bir stratejiye hayvan uyanık ve / veya 5,6 davranışlar ise tek nöronlar ve multiunit kümelerden kaydetmek için kronik elektrod dizileri implant olmuştur 10-12 yarasalar 7-9 kullanılan bir kafalık tekniği adapte var. Bu yöntemi kullanarak, biz unanesthetized farenin birkaç gün içinde elektrofizyolojik yapabiliyoruz. Kayıt seansları sonunda, biz sonra elektrot pozisyonları ve kayıt siteleri yeniden ya ve kayıt lokus gelen yolları tespit edilebilir, böylece bir izleyici enjekte etmek için bir boya enjekte edebilir. Bu yöntem kullanımı anestezi olmadan birden fazla gün boyunca iyi izole tek nöron kayıtları için izin verir.
Protocol
1. Kafalığı Genel Bakış
- Özel-yerleşik kafa yazılan birleştirmek için, bir haç oluşturacak şekilde paslanmaz çelik çubuk "a 3/32 açılan bir delik içine dik paslanmaz çelik rulo-pin" 1/16 yerleştirin. Kafa-sonrası dikey parçanın yaklaşık 20 mm ile 15 mm kadar çapraz yatay parçanın olmalıdır. Bir # 1-72 vida kabul dikey çubuğun bir ucundan dokunun. (Şekil 1).
- Cerrahi ve kayıt sırasında, baş-sonrası bir # 1-72 vida (Şekil 2) ile özel-yerleşik pirinç veya alüminyum montaj çubuğu sabitlenir. Montaj çubuğunun uzun bir parça yaklaşık 90 mm uzunluğunda ve geniş 5-10 mm olmalıdır. Kafa-sonrası 45 derece açılıdır uzun bar kapalı bir 15 mm uzatma bir oluk kesme sığar. Montaj çubuğunun altında küçük bir oyuk içine baş dönmesi, baş-sonrası yuvalanmış olan lentolar önlemek için.
- De montaj çubuğu sonra ısmarlama alüminyum montaj blokuna bağlık (Şekil 3). Yerleştirme bloğu yaklaşık 30 mm x 30 mm x 25 mm. Bu, bağlantı bloğundan kafası-sonrası pozisyonu doğru orta hat boyunca ve bregma yerleştirilmiş olabilir böylece bir mikromanipülatör eklenir. Yerleştirme bloğu vidalar ile donatılmış iki parçadan oluşur. Blok bir cut-out montaj çubuğunda kaydırın ve vidaları ile sabitlenmelidir sağlar. Montaj çubuğu tablosu yüzeye paraleldir. Kayıt sırasında, özel bir stereotaksik frame (Şekil 4) çubuğu sabitleyin. Stereotax cerrahisi sırasında yerleştirme bloğu ile aynı konumda çubuğu monte etmek için tasarlanmıştır. Bu düzenleme, fare her zaman deneysel oturumlar boyunca stereotaksik çerçeveye uyumlu olacağını garanti eder.
- 45 ° C'de yaklaşık 1 mm eğilmiş olan, yaklaşık 5 mm uzunluğunda bir tungsten çubuk (çapı 0,010 ") kesilir. Bu çubuğu yerde pimi (Şekil 1) olarak görev yapar.
2. Stereotaksik AlKraniyotomi için ignment
Not: Tüm işlemler aşağıdaki standart aseptik cerrahi teknikler takip özetlenen ve Washington Eyalet Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi ve Garvan Enstitüsü Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır.
- % 5 izofluran ile bir indüksiyon odasında koyarak fare uyutmak. Kuyruk ve / veya ayak tutam bir reaksiyon olmaması hayvan tam anestezi olmasını sağlar.
- Bir fare adaptörü (Stoelting) ile donatılmış bir kemirgen stereotaksik çerçeve içinde fare yerleştirin. Fareyi doğru şekilde yönlendirmek için, ısırık çubuğunun delik içinde diş yerleştirin ve rahat bu yüzden burun kelepçe sıkın. Gibi düz mümkün snack bar ve burun kıskacı içinde fare yerleştirin. Farenin burnunun üzerinde lateks eldiven parçası yapılmış bir yüz maskesi yerleştirin ve farenin solunum hızı yaklaşık 1 nefes / sn kadar% 5 izofluran tutun. 1.5 izofluran çevirin -% 2.0. T ile baş sabitleyindiye kulak çubukları Delmeyiniz kulak zarının için dikkatli olmak. Barlar snug olabilir ama kulak kanalları içine daha derine nüfuz olmamalıdır.
- Farenin altında bir ısıtma yastığı yerleştirin.
- Kurumasını önlemek için göz oftalmik merhem uygulayın.
- Kadar küçük bir tıraş makinesi ya da ince noktası makasla göz kulak arasından kafa derisi Tıraş.
- Temizleyin ve alkol izledi klor-hexidine (veya betadin) fırçalama 3 kez tekrar durulama silerek derisi sterilize edin.
- Kafatasının üst üzerinde cilt kaldırmak için başın arkasından gözleri orta hat boyunca bir kesi yapmak.
- Bistüri ile kesi kenarları periost kazıyın. Gerektiğinde (deneysel hedef bağlı olarak), dikkatle kas kanama en aza indirmek için fasiküller boyunca gözyaşı sağlayan, forseps ile boyun arkasındaki kas geri çekin. Nem en aza indirmek ve kafatası üzerinde hareket gelen cilt önlemek için kafa derisi altına doku gelfoam uygulayın.
- Pamuk uçlu aplikatör ile kafatası yüzeyi kafatası yerlerinden görselleştirme artırmak için izopropil alkol ile ıslatılmış kuru.
- Standart stereotaksik koordinatları 13 kafatası hizalayın. Elektrot tutucu bir ince noktası probu yerleştirin ve stereotaksik mikromanipülatör ekleyin. Bir bilenmiş metal çubuk bu amaçla (Şekil 5) için de çalışıyor.
- Kafatası üzerinde bregma (Şekil 5A) ve Lambda (Şekil 5B) tanımlamak için noktasını kullanın. Her konum için lateral-medial koordinat fazla 50 mikron tarafından farklı olduğunu kontrol, bu noktalar arasında geri ve ileri-prob taşıyın. Dikkatli yanal baş ve kulak-bar değişen ve kulak çubukları retightening, kulak çubukları sökerek gerektiği gibi kafa konumlandırın.
- Her yerde dorsal-ventral yüksekliği en fazla 50 mikron göre değişir doğrulayın. Burun-kelepçe yüksekliğini ayarlayın, hangi, kulak çubukları ekseni etrafında kafatası dönecektirkafatası gerekirse sahaya düzleştirmekti. Kulak çubuğunun yüksekliği de ayarlanması gerekebilir.
- Bregma göre ilgi hedefin (Şekil 5C) koordinatlarını tanımlamak için bir Atlas 13 kullanabilir. Hedefin üzerinde kafatası işaretleyin (örneğin, bir "X" veya bir kare nokta dört köşe Türkiye mürekkep kullanın) kraniotomi (Şekil 5D) yapılacaktır nerede.
3. Head-sonrası ve Zemin Pin Kurulum
- Kafatası temizlemek için etch jel kullanın. Yüzey (10 sn) üzerinden etch jel fırçalayın ve yaymak için aplikatör kullanın. Su ile yıkayın ve tamamen kurulayın. Aplikatör kullanılarak kafatası yüzeye diş çimento astar uygulayın. Yeni aplikatör ile yapıştırıcı sürün. UV ışık-gun (1 döngü) ile yapıştırıcı Cure.
- Hedef siteye distal toprak pimi için bir konum seçin. Dikkatle zemin p kısa sonu için sadece yeterince geniş bir # 65 miniblade neşter ucunu kullanarak kafatasında küçük bir delik delikgirmek ve meninksler üzerine dinlenmek için. Bu bregma ve (Şekil 6A) baş-sonrası gelecekte uzak bakacak şekilde toprak pimi odaklı olmalıdır.
- Montaj çubuğuna baş sonrası emniyete ve engellemek ve mikromanipülatör iliştirin. Üç boyutlu mikromanipülatör hareket ettirerek, sadece kafatası (Şekil 6B) dokunmadan, bregma üzerine kafa sonrası konumlandırmak. Baş-post tabanı kafatası üzerinde düz durmalıdır.
- Diseksiyon problar kullanarak, baş-posta ve toprak pimi (Şekil 6C) etrafında diş çimento az miktarda uygulayın. Kafatası ile iyi temas sağlamak için çimento bastırın. Not: Çok fazla çimento kullanmayın ya da eşit sertleşmesine bulamayabilirsiniz. UV ışık-gun (çoklu açılardan 3-4 siklus) ile çimento Cure.
- Çimento ikinci aşamasında uygulayın ve kafa-sonrası etrafında temel oluşturmak ve baş-post oluklara (Şekil 6D) kapsamaktadır.
4. Kraniotomi
- Kısmen astar tarafından gizlenmiş olacaktır kraniotomi referans işareti, bulun. Bu site etrafında x 3 mm kare 3 mm işaretlemek ve hassasiyeti azaltmak ve kanamayı en aza indirmek için lidokain bir damla uygulamak için # 65 neşter kullanın.
- (Şekil 7A) kemik yoluyla ve beyin içine kesmemeye dikkat ederek, meydanın her tarafı (10 gibi) birden fazla puan olun.
- Kemik flep gevşek olduktan sonra, (Şekil 7B) duramater zedelemeden, onu gözetlemek neşter ucu kullanın.
- Kemik mum ile kaplayın.
5.. Post-cerrahi
- Gaz anestezi kapatın ve stereotaksik çerçeve fare çıkarın.
- Yara yerinde hissi törpülemeye maruz kalan deri çevresinde Lidokain merhem uygulamak için bir pamuk uçlu bir aplikatör kullanın. Maruz kalan cilde Neosporin uygulamak için başka bir pamuk uçlu bir aplikatör kullanın. Ketoprofen (bireysel IACUC veteriner hekim tercihine göre 5 mg / kg IM veya IP) olarak enjekteBir ameliyat sonrası analjezik. Fare genellikle yukarı olması ve gaz bırakma dakika içinde hareket edecektir.
- Sıcak bir kafes ve monitör yer fare, bu hayvan barınağı dönmek için hazır olana kadar.
- Bu ameliyat kurtarıldı sonra hayvan günde en az bir kez kontrol edilmelidir. Kötü beslenme ve / veya içme ve dikkatsiz davranışlar bekleyin. Ağrı şüpheleniliyorsa, hafifletilebilir kadar her 24 saatte bir (aynı doz sonrası cerrahi sonunda gibi) ketoprofen sağlar. Lidokain yerel hayvan kaşıma ise yara uygulanan veya rahatsızlık belirtileri gösteriyor olabilir. Hayvanlar, genellikle komplikasyon veya ağrı olmadan ameliyatın.
6. Kayıt ve Boya Enjeksiyon
- Kayıtları için fare kullanmadan önce baş-son ameliyattan sonra en az bir gün bekleyin.
- Bir köpük-frenlenmesinin cihazı koyun fare fare vücuduna şekillendirdi. Fare zaten böylece kendi kaygıyı azalttığı, bu cihaz için adapte edilmiştir. Tipik adaptasyonuameliyat ve deneyler için önceden sütten sonra ve yaklaşık bir hafta süreyle her gün fare işlemek için, 1-5 dakika için köpük cihazda fare yerleştirin. Stereotaksik frame (Şekil 4) cihazı Askıya.
- Artık stereotaksik çerçevenin (Şekil 4) sabitlenir montaj çubuğu, baş-sonrası güvenli.
- Künt 22-gauge derialtı iğne ucu ile sonlandırılmış bir tel ile toprak pimi bağlanın.
- Kraniotomi üzerinde kemik mum çıkarın. Bir miniblade neşter ucunu kullanarak gerekirse dura çıkarın.
- Uygun stereotaksik yere elektrot Sürücü ve (Şekil 8) kaydetmeye başlarsınız. Sadece elektrofizyolojik için, elektrotların farklı kullanılabilir. Elektrotun tercih gerekli kayıtların konumu ve türüne bağlıdır. Uyanık fare kayıtları için elektrodun seçimi bir araştırmacı, bir anestezi fare kullandığı gibi aynı olacaktır. Kombine elektrofizyolojik kayıtlar içinboya / izleyici enjeksiyonları, mikropipet elektrot 10 kullanılır. Mikropipet bunun iontophoretically elektrofizyolojik deneyler sonunda enjekte edilebilir, böylece tercih edilen boya / izleyici ile doldurulur. Multibarrel elektrotlar farmakolojik manipülasyonlar yapılabilir, böylece de kullanılabilir. Multibarrel elektrod bir tek kayıt mikropipet (Şekil 8) üzerine monte edilir. Bu teknikler literatüründe standart ve anestezi karşı uyanık kayıtları için farklı değildir.
- Kayıtlar 3-4 ardışık gün içinde 4-5 saat yapılabilir.
- Kayıt oturumu sonunda, boya / izleyici enjekte edilebilir. Beyinde herhangi bir ağrı reseptörleri olduğundan, beyin içine boya veya izleyicinin iyontoforetik enjeksiyon rahatsızlığa neden düşüktür. Enjeksiyon yapılacak olan bölgenin elektrofizyolojik tepkisi özellikleri karakterize edilir kez Ancak, hayvan izofluran f ile anestezi olabilirveya enjeksiyon. Bu, herhangi bir potansiyel istenmeyen duyumlar ortadan kaldıracaktır. Boya / izleyici mikropipet zaten olduğundan, aktif ve toprak uçları iontophoretically boya / izleyici enjekte etmek için mevcut jeneratör elektrofizyolojik kayıt kurulumdan değiştirilebilir. Elektrot boya / izleyici için uygun protokol kullanın. Headpost kısıtlama ve vücudu kısıtlama gelen hayvan çıkarın ve ev kafese döner.
- Deney sonunda ötenazi ve enjeksiyon ve etiketleme kurtarmak için doku işleme için uygun protokol izleyin.
7. Temsilcisi Sonuçlar
Kafa-sonrası başarılı bir şekilde monte deneyci birden gün boyunca bir unanesthetized, uyanık fareden tek ve multiunit yanıtları kaydetmenize olanak verir. Bağlama sistemi beynindeki nöronlar, tek stabil elektrofizyolojik sağlar. Tek bir birim ve güçlü tepkiler t Mükemmel izolasyono uyaran fare aşağı kollikulus (; 9B Şekil, günde iki Şekil 9A, günde bir), örneğin birden fazla gün boyunca aynı beyin yapısından kaydedilebilir. İyi bir kafa sonrası kurulumu sayesinde, her fare sürekli stereotaksik cihazları ve özellikle beyin çekirdeklerinin güvenilir lokalizasyonu sonucu fare stereotaksik atlas, 13 hizalanır. Bu güvenilir lokalizasyonu birden fazla kayıt gün sonra özel yapıları içine boyalar ve izleyiciler enjeksiyonu sağlar. Örneğin, işitsel beyin sapı işitsel Ortabeyin gelen projeksiyonlar azalan değerlendirmek için, elektrofizyolojik olarak enjeksiyon yerinde nöronal yanıt özelliklerini belirleme sonra fareyi aşağı kollikulus (Şekil 10A) enjekte edilebilir dekstran amin (kromajen görselleştirilmiştir kullanarak diaminobenzidin) biyotinile (Şekil. 10A, bir nöron 51 kHz frekans ile en iyi kaydedilmiştir) ve doku işlenmesinden sonra, birkontrlateral dorsal koklear nükleus içinde nterograde etiketleme ve görselleştirmişti (Şekil 10B) işlenmiştir olabilir. Yüksek çözünürlükte fotomikrografı da anterogradely etiketli aksonlar ve terminaller (Şekil 10C) görüntülemek için elde edilebilir.
Şekil 1..
Şekil 2.
Şekil 3.
Şekil 4.
Şekil 5.
Şekil 7. 
Şekil 8. 
Şekil 9. 
10 Şekil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fare elektrofizyolojik ve nöroanatomik deneyler için kafa sonrası koltuk sisteminin avantajı deneyler anestetik ilaçlara bağlı olası cevabı kirliliği ortadan kaldırarak, unanesthetized, uyanık fare ile yapılabilir olmasıdır. Buna ek olarak, bir kümesini daha verimli bir hayvan kullanım için izin vermek için birden çok gün boyunca kullanılabilir.
Kafa-sonrası için en bileşenleri off-the-raf mevcuttur. Sadece baş-sonrası ve montaj aparatları ısmarlama olduğu, inşa etmek oldukça basit ve yeniden kullanılabilir, her ikisi de. Bir makine atölyesi bir kurum mevcut değilse, araştırmacı olasılıkla kullanabilirsiniz http://www.emachineshop.com/ gerekli bileşenleri imal.
Yeterli cerrahi becerileri gereklidir. Cerrah iyi bir mikroskop altında yapılır bazıları ince cerrahi teknikler ile yeterli olmalıdır. cerrahi aseptik koşullarda yapılmalıdır. Kafatası flap kaldırma prosedürü en hassas noktasıdır. Dikkatli ve nazik bir operasyon mikroskobu bakarken dikdörtgenin 4 kenarları boyunca bir neşter ile birden fazla puan yaparak, kafatası flep duramater zedelemeden, minimal kanama ile "kapalı attı" olabilir. Altta yatan damarsal aşinalık yapma gibi büyük bir kan damarı üzerinde bir kesim istenmeyen kanama riski oluşturur esastır. Bizim araştırma işitme sistemi üzerinde duruluyor Çünkü kemik yürütülen iç kulak travması olasılığını en aza indirmek amacıyla Kraniyotomi gerçekleştirmek için matkaplar kullanmaktan kaçınmışlardır.
Bu ön-arka düzlemde seviyesi ve önceden baş-sonrası takılması için stereotaksik uyum içinde almak önemlidir. Bu önlem baş deneysel çalışmalar boyunca düzeyde kalacağını sağlar ve beyin atlası kullanarak beyin lokusların yerini kolaylaştırır.
çadır "> kayıt için, cerrahi öncesi birkaç gün için bir günlük fare işlemek için yararlıdır. Sadece köpük cihaz taşıma ve bağlama maruz fare çok azaltılmış stres ve hareket ile daha uzun kayıt seansları kolaylaştırır alma fare. anahtarı fare köpük sandviç rahatça sığacak sahip olmaktır. hayvan aşırı derecede hareket edebilir, bu sürekli olarak mücadele etmek eğilimindedir. fare mücadele etmeye başlarsa, kayıt oturumu sonlandırmak ve tekrar bir sonraki almak için en iyisidir uyarıya cevabın değildir kayıtları büyük biyopotansiyeller içinde fare sonuçlarının gün. Hareketi. Bu aksiyon potansiyelleri ve aralıklı olduğunu genellikle daha fazla genlik. Hareketi eserler de hayvan dokunmadan kayıt teller tarafından oluşturulmuş olabilir. önemlidir hayvan dokunmadan hiçbir teller vardır. Genel sağlamak için, bu tekniğin bize anestezi kullanmadan işitsel işleme ve anatomi üzerinde birden fazla çalışmalar yapmak için izin verdi.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Biz ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
NSF hibe 0920060, NIH hibe DC004395, NHMRC hibe 1.009.482, Bilim ve Tıp Araştırmaları NSW ve Garnett Passe ve Rodney Williams Memorial Foundation tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Etch gel for cleaning skull prior to dental cement | Henry Schein | 101-5396 | 12/pk with 1.2 mL syringes |
| Primer for dental cement | Kerr Optibond | 25881 | 8 mL bottle |
| Adhesive for dental cement | Kerr Optibond | 25882 | 8 mL bottle |
| Applicators for dental cement | Kerr Optibond | 24680 | 200/pk |
| Dental Cement | Charisma, Heraeus Kulzer | 66000085 | 4gm Syringe Refill |
| Tungsten Rod (Ground Pin) | A-M Systems | 717200 | 0.010" diameter |
| Economy UV Curing Light | Henry Schein | CU-80 | |
| Head-post | Built in-house | ||
| Mounting bar | Built in-house | ||
| Mounting block | Built in-house | ||
| Stereotaxic Frame | David Kopf Instruments | 902 | |
| Mouse and Neonatal Rat Adaptor | Stoelting Co. | 51625 | |
| Deltaphase Isothermal Pad | Braintree Scientific, Inc. | 39DP |
References
- Evans, E. F., Nelson, P. G. The responses of single neurones in the cochlear nucleus of the cat as a function of their location and the anaesthetic state. Exp. Brain Res. 17, 402-427 (1973).
- Joris, P. X. Response classes in the dorsal cochlear nucleus and its output tract in the chloralose-anesthetized cat. J. Neurosci. 18, 3955-3966 (1998).
- Populin, L. C. Anesthetics change the excitation/inhibition balance that governs sensory processing in the cat superior colliculus. J. Neurosci. 25, 5903-5914 (2005).
- Young, E. D., Brownell, W. E. Responses to tones and noise of single cells in dorsal cochlear nucleus of unanesthetized cats. J. Neurophysiol. 39, 282-300 (1976).
- Donoghue, J. P. Contrasting properties of neurons in two parts of the primary motor cortex of the awake rat. Brain Res. , 333-3173 (1985).
- Westby, G. W., Wang, H. A floating microwire technique for multichannel chronic neural recording and stimulation in the awake freely moving rat. J. Neurosci. Methods. 76, 123-133 (1997).
- Suga, N., O'Neill, W. E., Manabe, T. Cortical neurons sensitive to combinations of information-bearing elements of biosonar signals in the mustache bat. Science. 200, 778-781 (1978).
- O'Neill, W. E., Suga, N. Target range-sensitive neurons in the auditory cortex of the mustache bat. Science. 203, 69-73 (1979).
- Suga, N., O'Neill, W. E., Manabe, T. Harmonic-sensitive neurons in the auditory cortex of the mustache bat. Science. 203, 270-274 (1979).
- Portfors, C. V., Felix, R. A. 2nd Spectral integration in the inferior colliculus of the CBA/CaJ mouse. Neuroscience. , 136-1159 (2005).
- Felix, R. A. 2nd, Portfors, C. V. Excitatory, inhibitory and facilitatory frequency response areas in the inferior colliculus of hearing impaired mice. Hear Res. 228, 212-229 (2007).
- Portfors, C. V., Jonson, K. G., Roberts, P. D. Over-representation of species-specific vocalizations in the awake mouse inferior colliculus. Neuroscience. 162, 486-500 (2009).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , 3rd edn, Academic Press. NY. (2007).
