Summary
의 연결 응답 Electrophysiological 특성은 뇌의 기능을 이해와 경로 추적을위한 염료의 위치를지도 중요합니다. 그러나 많은 연구 anesthetized 동물에서 수행됩니다. anesthetics없이 뇌 기능을 이해하기 위해서, 우리의 연결 응답 특성을 기록하고 깨어있는 마우스에 염료를 주입하는 방법을 개발했습니다.
Abstract
그것은 잘 마취가 두뇌의 여러 지역에서 신경 반응 속성을 바꿀지도 모르겠어 것으로 알려져 있습니다. 13. 청각 시스템에서 임계값, 주파수 특이성 및 억제 sidebands 포함한 brainstem의 뉴런의 근본적인 응답 특성 1-2 마취하에 상당한 방법으로 변경됩니다. 이러한 관찰 physiologists은 마취의 오염 영향없이 하나의 뉴런에서 녹화할 수있는 방법을 모색하라는 메시지가 나타납니다. 한 결과는 brainstem 완전히 midbrain 4의 수준에서 그었습니다 decerebrate 준비했습니다. 이 준비의 단점 무서운 수술, forebrain의 전망을 내림차순의 철폐, 그리고 midbrain 위의 구조를 조사하는 감각 자극을 사용하는 무능력이다. 다른 전략은 동물이 깨어 및 / 또는 5,6를 행동 중에 하나의 뉴런과 multiunit 클러스터에서 녹음 만성 전극 배열을 이식해왔다 10-12로 박쥐 7-9에서 사용 헤드 구속 기법을 적응했습니다. 이 방법을 사용하여, 우리는 unanesthetized 마우스에서 며칠 동안 electrophysiological 레코딩을 수행할 수 있습니다. 레코딩 세션의 끝에, 우리는 다음 전극 위치 및 녹음 사이트를 재구성하거나 및 녹화 loci의 경로가 결정 수 있도록 추적기 주입하는 염료를 주입하실 수 있습니다. 이 방법은 사용 anesthetics없이 여러 일 동안 잘 격리 단일 신경 세포 녹음을 허용합니다.
Protocol
1. 헤드 - 구속 개요
- 맞춤식 헤드 게시물을 조립하기 위해 십자가를 형성 스테인레스 스틸 막대 "32분의 3 년 뚫고 구멍에 수직 스테인레스 스틸은 롤 핀"1 / 16 삽입합니다. 헤드 게시물의 수직 조각 약 20 mm와 15mm에 대한 수평 십자가 조각이어야합니다. # 1-72 나사를 받아들이도록 수직 막대의 한쪽 끝을 누릅니다. (그림 1).
- 수술 및 녹음 중에는 헤드 게시물 # 1-72 나사 (그림 2)의 맞춤식 황동 또는 알루미늄 장착 표시줄에 보안이됩니다. 장착 막대의 긴 조각 약 90 mm 길고 폭이 5-10밀리미터 있어야합니다. 헤드 게시물 45 있길에 직각되는 긴 막대 해제 15mm 연장에 홈 인하로 힘드 네요. 장착 막대의 아래쪽에 작은 홈에 머리 회전, 헤드 게시물 nestles의 가로대을 방지합니다.
- 에 장착 막대 후 맞춤 알루미늄 마운팅 블록에 부착된K (그림 3). 마운트 블록은 약 30mm X 30mm X 25mm입니다. 이 마운트 블록은 정면 게시물의 위치가 정확하게 중간선을 따라와 Bregma에 배치할 수 있도록 micromanipulator에 첨부되어 있습니다. 마운팅 블록 나사 함께 들으며 두 가지로 구성되어 있습니다. 블록의 컷 아웃이 장착 표시줄에 밀어하고 나사로 고정 할 수 있습니다. 장착 막대가 테이블 표면에 평행이다. 녹음하는 동안 사용자 정의 stereotaxic 프레임 (그림 4)에서 막대를 확보. stereotax는 수술 중에 장착 블록에서 같은 위치에 막대를 탑재할 수 있도록 설계되었습니다. 이 배열은 마우스가 항상 실험적인 세션에 걸쳐 stereotaxic 프레임에 정렬된다는 보장합니다.
- 45 °에서 약 1 밀리미터 구부러진으로 약 5 밀리미터 길이로 텅스텐 막대 (직경 0.010 ")를 잘라.이 막대가 땅에 핀 (그림 1)로서의 역할을합니다.
2. Stereotaxic 알Craniotomy위한 ignment
참고 : 모든 절차는 아래 표준 무균 수술 테크닉을 따라 명시된와 워싱턴 주립 대학 동물 관리 및 사용위원회와 Garvan 연구소의 동물 윤리위원회의 승인되었습니다.
- 5% isoflurane으로 유도 챔버에 배치하여 마우스를 마취. 꼬리 및 / 또는 발가락 공략하기 위해 반응의 부족 동물 완전히 anesthetized임을 보장합니다.
- 마우스 어댑터 (Stoelting)에 장착된 쥐 stereotaxic 프레임에 마우스를 놓습니다. 마우스를 올바르게 동양에, 물린 막대의 구멍 안쪽에 치아를 배치하고 아늑한되도록 코 클램프를 조입니다. 더할 나위없이 가능한 물린 바, 코를 클램프에서 마우스를 놓으십시오. 마우스의 코 위에 라텍스 장갑의 조각으로 만든 얼굴 마스크를 놓고 마우스의 호흡 속도가 약 1 숨결 / 초까지 5 % isoflurane 보관하십시오. 1.5 isoflurane를 켜고 - 2.0 %를. T를 사용하여 머리를 고정그는 귀, 바, 아니 찔린 고막에 신중하다고. 바 아늑한 있지만 귀 운하에 너무 깊이 침투해서는 안됩니다.
- 마우스 밑에 가열 패드를 놓습니다.
- 말리는에서 눈을 막기 위해 안과 연고를 바릅니다.
- 최대 작은 면도기이나 미세 포인트 가위로 눈을에 귀 사이에서 두피 면도.
- 청소 및 알코올 다음 chlor-hexidine (또는 betadine) 스크럽 3 회 반복 헹굼에게 함께 지울하여 두피를 소독.
- 두개골의 맨 위에 피부를 제거하려면 머리 뒤쪽에서 눈을에 중간선을 따라 절개를합니다.
- 메스로 절개의 가장자리에 골막을 다쳤어요. 필요한 경우 (실험 대상에 따라), 신중하게 근육이 출혈을 최소화하기 위해 fascicles 따라 철거 수 있도록 집게와 목 뒤쪽 근육을 접어야합니다. 수분을 최소화하고 두개골을 통해 이동으로부터 피부를 방지하기 위해 두피 조직 아래 gelfoam을 적용합니다.
- 솜 스쳐지나 작은 주걱으로 두개골 표면은 두개골 랜드마크의 시각화을 향상시키기 위해 이소 프로필 알코올로 moistened 건조합니다.
- 표준 stereotaxic 좌표 13 두개골을 맞춥니다. 전극 홀더에 훌륭한 포인트 프로브를 삽입하고 stereotaxic micromanipulator에 첨부해 주시기 바랍니다. 날카롭게 금속 봉이 목적 (그림 5)을 위해 잘 작동합니다.
- 두개골에 Bregma (그림 5A)와 람다 (그림 5B)를 식별 포인트를 사용하십시오. 각 지역에 대한 측면 - 중간 좌표는 더 이상 50 μm의에 의해 차이가 있는지 확인,이 점 사이 - 및 - 앞뒤 프로브를 이동합니다. 신중 laterally 머리와 귀, 바를 이동하고, 귀, 바를 retightening, 귀, 바를 풀어하여 필요에 따라 머리를 재지정.
- 각 위치에 지느러미-복부 높이가 더 이상 50 μm의에 의해 차이가 있는지 확인합니다. 코 - 클램프의 높이를 조절, 즉, 귀, 막대의 축 주위 두개골을 회전합니다두개골 필요한 경우의 높낮이를 날려합니다. 귀, 막대의 높이 또한 조정해야 할 수도 있습니다.
- Bregma에 상대적으로 관심의 대상 (그림 5C)의 좌표를 식별하기 위해 아틀라스 13 사용합니다. 대상 위에있는 해골 마크 (예를 들어, "x"를 또는 사각형의 점이 곳곳에 인도 잉크 사용) craniotomy는 (그림 5D) 이루어집니다 어디.
3. 헤드 - 게시물과 접지 핀 설치
- 두개골을 청소 에칭 젤을 사용하십시오. 표면 (10 초) 동안 에칭 젤을 씻어하고 확산하기 위해 작은 주걱을 사용합니다. 물로 씻고 완전히 건조시키십시오. 작은 주걱을 사용하여 두개골 표면에 치과용 시멘트에 대한 입문서를 적용합니다. 새로운 작은 주걱으로 접착제를 펴. 자외선 - 총 (1주기)과 접착제를 치료.
- 대상 사이트에 대한 말초은 접지 핀의 위치를 선택합니다. 조심스럽게 지상 P의 짧은 끝이 그냥 통과 충분한 # 65 miniblade 메스의 팁을 사용하여 두개골에 작은 구멍을 뚫다입력하고 meninges 따라 쉬어야합니다. 그것이 Bregma하고 (그림 6A) 헤드 게시물 미래에서 떨어져 포인팅되도록 접지 핀이 지향이어야합니다.
- 장착 막대 헤드 게시물을 확보해서 차단하고 micromanipulator에 첨부해 주시기 바랍니다. 가로, 세로, 높이로 micromanipulator 이동하여 바로 두개골 (그림 6B)를 만지고, Bregma 위에 정면 게시물을 배치. 헤드 게시물의 기준은 두개골에 평평하게 누워 있습니다.
- 해부 프로브 사용하여 헤드 게시물과 접지 핀 (그림 6C) 주위에 치과 시멘트의 작은 금액을 적용합니다. 두개골의 좋은 접촉을 보장하기 위해 시멘트를 누르십시오. 참고 : 너무 많은 시멘트를 사용하지하거나 균일하게 강화하지 않을 마십시오. 자외선 - 총 (여러 각도 3-4 사이클)와 시멘트를 치료.
- 시멘트의 두 번째 단계를 적용하고 정면 포스트 주위에 기지를 구축하고 헤드 게시물 홈 (그림 6D)을 포괄합니다.
4. Craniotomy
- 부분적으로 프라이머로 덮여됩니다 craniotomy 참조 부호를 찾습니다. 본 사이트 주위 × 3 밀리미터 광장을 3mm를 표시하고 감도를 감소하고 출혈을 최소화하기 위해 lidocaine의 방울을 적용하기 # 65 메스를 사용하십시오.
- (그림 7A) 뼈를 통해 두뇌로 침입하지 않도록주의되는 사각형의 각 측면 (많은 10)에 복수의 점수를 확인하십시오.
- 뼈 플랩은 자유롭게된다되면 (그림 7B) 경질의 mater 그대로두고, 그것을 캐내려고 메스의 팁을 사용합니다.
- 뼈 왁스와 함께 표지.
5. 이후 수술
- 가스 마취를 끄고 stereotaxic 프레임에서 마우스를 제거합니다.
- 상처 주위에 센세이션을 달랠 때도에 노출 피부 주위 Lidocaine의 연고를 적용하는 솜 스쳐지나 작은 주걱을 사용하십시오. 노출된 피부에 Neosporin 적용할 수있는 또 다른 솜 스쳐지나 작은 주걱을 사용하십시오. 케토프로펜를 (개인 IACUC 수의사의 취향을 바탕으로 5 밀리그램 / kg 메신저 또는 IP)로 주사수술 후 진통제. 마우스는 일반적으로 최대 가스 정지의 분 이내에 이동됩니다.
- 따뜻한 케이지와 모니터의 장소는 마우스가 동물의 주거로 돌아갈 준비가 될 때까지.
- 그것이 수술로부터 복구되었습니다 후에 동물은 하루에 최소 한번에 확인하여야한다. 가난한 식생활 및 / 또는 음주와 마음이 내키지 않는 행동의 흔적을보세요. 고통이 의심되면 완화 전까지는 24 시간마다 (동일 선량 수술 끝에 등) 케토프로펜 제공합니다. Lidocaine은 로컬 동물 긁적 경우 상처에 적용하거나 불편의 흔적을 보여줍 수 있습니다. 동물은 일반적으로 합병증이나 통증없이 수술에서 회복.
6. 녹화 및 염료 분사
- 녹음을 위해 마우스를 사용하기 전에 헤드 게시물 수술 후 최소한 1 일 이상 기다립니다.
- 거품 - 접근 금지 장치 플레이스 마우스는 마우스의 시체에 맞는. 마우스는 이미으로써의 불안을 줄이고,이 장치에 맞게 조정되었습니다. 일반적인 적응은수술과 실험 이전의 이유 후 약 일주일 동안 매일 마우스를 처리하기 위해, 1~5분 위해 발포 장치에 마우스를 놓습니다. stereotaxic 프레임 (그림 4)에서 장치를 일시 중지합니다.
- 지금 stereotaxic 프레임 (그림 4)에 고정 장착 표시줄에 정면 게시물 보안.
- 뭉툭한 22-게이지 피하 주사 바늘 팁 때문에 종료 와이어와 접지 핀에 연결합니다.
- craniotomy를 통해 뼈 왁스를 제거합니다. miniblade 메스의 팁을 사용하여 필요할 경우 경질을 제거합니다.
- 적절한 stereotaxic 위치에 전극을 증가하고 (그림 8) 녹음을 시작합니다. 오직 electrophysiological 음반의 경우 전극의 다양한 사용하실 수 있습니다. 전극의 선택은 필요한 레코딩의 위치와 종류에 따라 다릅니다. 깨어 마우스 레코딩을위한 전극의 선택은 연구자가 anesthetized 마우스에 사용하는 것과 동일합니다. 과 결합 electrophysiological 녹음을 위해염료 / 추적기 주사, micropipette 전극 10 사용됩니다. micropipette은 그것이 iontophoretically electrophysiological 실험의 끝 부분에 주입 수 있도록 선택의 염료 / 트레 이서들로 가득 차 있습니다. Multibarrel 전극은 pharmacological 조작이 이루어질 수 있도록도 사용할 수 있습니다. multibarrel 전극은 단일 녹음 micropipette (그림 8)에 마운트됩니다. 이 기술은 문학에서 표준이며 anesthetized 대 깨어 레코딩에 대해 다른 않습니다.
- 녹음은 3-4 연속적인 일 동안 4~5시간 위해 만들 수 있습니다.
- 녹화 세션이 끝날 때, 염료 / 추적기는 주입 수 있습니다. 두뇌에는 통증 수용체가 없기 때문에 머리를 염색하거나 추적기의 iontophoretic 주사 불편을 일으킬 가능성이다. 주사는 만들 것이다 지역의 electrophysiological 응답 특성이 특징 일단 그러나, 동물 isoflurane F와 anesthetized 될 수또는 주사. 이것은 잠재적인 원치 않는 감각을 제거합니다. 염료 / 추적기가 micropipette에 이미 있기 때문에 활성 및 접지 리드는 iontophoretically 염료 / 추적기 삽입할 현재 발전기로 electrophysiological 녹화에서 설정 전환하실 수 있습니다. 전극의 염료 / 추적을위한 적절한 프로토콜을 사용합니다. headpost 구속 및 신체 구속으로부터 동물을 제거하고 홈 케이지로 돌아갑니다.
- 실험이 끝나면, 안락사 및 사출 사이트 및 라벨링을 복구하기위한 조직 처리를위한 적절한 절차를 따르십시오.
7. 대표 결과
헤드 게시물의 성공적인 설치는 실험자가 여러 일 동안 unanesthetized, 깨어있는 마우스에서 단일 및 multiunit 답변을 녹화할 수 있습니다. 규제 시스템은 뇌의 한 뉴런의 안정 electrophysiological 녹음을 허용합니다. 하나의 단위와 강력한 대응 전술이 우수한 절연O의 자극은 마우스 열등 colliculus (; 9B 그림, 하루에 두세 그림 9A, 첫날)의 예를 들어, 여러 일 동안 같은 뇌 구조에서 기록될 수 있습니다. 좋은 헤드 사후 설치로 각 마우스는 일관되게 stereotaxic기구 및 특정 뇌 핵의 안정적인 지방화 결과 마우스 stereotaxic 아틀라스, 13로 정렬됩니다. 이것은 안정적인 지역화 여러 녹화 일 후에 특정 구조물에 염료 및 추적기의 주입을 허용합니다. 예를 들어, 청각 brainstem에 청각 midbrain에서 전망치를 내림차순 평가하기 위해, electrophysiologically 주사의 사이트에의 연결 응답 특성을 식별 후 마우스 열등 colliculus (그림 10A)에 주입 수 dextran 아민을 (chromagen와 같은 시각을 사용 diaminobenzidine) biotinylated (그림. 10A에서 신경 세포는 51 kHz에서 중 최고의 주파수로 녹음되었다), 그리고 조직 처리 후,contralateral 지느러미 와우각 핵에서 nterograde 라벨링은 시각과 (그림 10B) 꾸몄다되어 있습니다. 높은 해상도에서 Photomicrographs도 anterogradely 분류 axons 및 터미널 (그림 10C)를 볼 얻을 수있다.
1 그림.
그림 2.
그림 3.
4 그림.
그림 5.
그림 7. 
그림 8. 
9 그림. 
10 그림.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
마우스의 electrophysiological 및 neuroanatomical 실험을위한 헤드 게시물 구속 시스템의 장점은 실험 마취 약물로 인한 잠재적인 응답 오염을 제거, unanesthetized, 깨어있는 생쥐로 수행할 수있다는 것입니다. 또한, 세트까지보다 효율적인 동물 사용할 수 있도록 여러 일 동안 사용할 수 있습니다.
헤드 게시물에 대한 대부분의 구성 요소는 재고품이 가능합니다. 만이 헤드 게시물과 장착 기기는 맞춤이며, 건설 비교적 간단하고 재사용이다 둘 다. 기계 공장은 기관에서 사용할 수없는 경우, 연구자는 가능성이 사용할 수 http://www.emachineshop.com/ 필요한 구성 요소를 조작하는 걸.
능숙 수술 기술이 필요합니다. 외과 의사가 최선의 현미경 아래에서 수행하고 일부는 미세 수술 기법과 능숙하게해야합니다. 수술은 무균 조건 하에서 수행되어야합니다. 두개골의 플랩을 제거하면 프로 시저의 가장 섬세한 지점입니다. 신중하고 부드럽게 작동 현미경을 통해 보면서 사각형의 4 측면을 따라 메스로 여러 점수를 만드는하여 두개골 플랩은 경질의 mater 그대로두고, 최소한의 출혈로 "서요"가 될 수 있습니다. 기본 vasculature과 친숙도 만들기로 큰 혈관 이상 인하는 바람직하지 출혈의 위험을 생성 필수적입니다. 우리의 연구는 청각 시스템에 초점을 맞추고 있기 때문에, 우리는 뼈를 실시 내이 (内耳)에 의한 외상의 가능성을 최소화하기 위해 craniotomies를 수행하기위한 훈련의 사용을 피할 수있다.
그것은 앞부분 - 후부 비행기 수준과 이전 헤드 게시물 부착에 stereotaxic 정렬의를하는 것이 중요합니다. 이러한 예방책은 머리를 실험적 시도에 걸쳐 수준 유지됩니다 것을 확인하고 뇌 아틀라스를 사용하여 두뇌 loci의 위치를 용이하게합니다.
텐트 "> 녹음 들어, 이전에 수술에 대한 몇 일 동안 매일 마우스를 처리할 때 유용합니다. 그냥 발포 장치에서 취급하며 구속에 노출된 마우스의 많은 감소 스트레스와 운동으로 더 이상 녹음 세션을 용이하게 받고 마우스. 키는 마우스 거품 샌드위치에 석판이 맞도록하는 것입니다. 동물 과도하게 움직일 수있다면 그것이 지속적으로 투쟁하는 경향이있다. 마우스가 고군분투 시작되면 그것이 녹음 세션을 종료하고 다시 다음을 데리러하는 것이 가장 좋습니다 자극에 의해 evoked되지 않은 레코딩에 큰 biopotentials에서 마우스 결과의 일. 운동. 이들은 실천 가능성과이 간헐적 것을 일반적으로 큰 진폭 있습니다. 운동 아티팩트도 동물을 만진 녹화 와이어에 의해 생성된 수 있습니다. 그것이 중요 한거죠 동물을 만진도 와이어가 없는지. 전반적으로 보장하기 위해,이 기술은 우리가 anesthetics를 사용하지 않고 청각 처리와 해부학에서 여러 연구를 수행하도록 허용했다.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
우리는 공개 할게 없다.
Acknowledgments
NSF 교부금 0,920,060, NIH 교부금 DC004395, NHMRC 교부금 1,009,482, 과학 및 의학 연구의 NSW Office 및 가넷 예스 러운와 로드니 윌리엄스 기념 재단 지원.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Etch gel for cleaning skull prior to dental cement | Henry Schein | 101-5396 | 12/pk with 1.2 mL syringes |
| Primer for dental cement | Kerr Optibond | 25881 | 8 mL bottle |
| Adhesive for dental cement | Kerr Optibond | 25882 | 8 mL bottle |
| Applicators for dental cement | Kerr Optibond | 24680 | 200/pk |
| Dental Cement | Charisma, Heraeus Kulzer | 66000085 | 4gm Syringe Refill |
| Tungsten Rod (Ground Pin) | A-M Systems | 717200 | 0.010" diameter |
| Economy UV Curing Light | Henry Schein | CU-80 | |
| Head-post | Built in-house | ||
| Mounting bar | Built in-house | ||
| Mounting block | Built in-house | ||
| Stereotaxic Frame | David Kopf Instruments | 902 | |
| Mouse and Neonatal Rat Adaptor | Stoelting Co. | 51625 | |
| Deltaphase Isothermal Pad | Braintree Scientific, Inc. | 39DP |
References
- Evans, E. F., Nelson, P. G. The responses of single neurones in the cochlear nucleus of the cat as a function of their location and the anaesthetic state. Exp. Brain Res. 17, 402-427 (1973).
- Joris, P. X. Response classes in the dorsal cochlear nucleus and its output tract in the chloralose-anesthetized cat. J. Neurosci. 18, 3955-3966 (1998).
- Populin, L. C. Anesthetics change the excitation/inhibition balance that governs sensory processing in the cat superior colliculus. J. Neurosci. 25, 5903-5914 (2005).
- Young, E. D., Brownell, W. E. Responses to tones and noise of single cells in dorsal cochlear nucleus of unanesthetized cats. J. Neurophysiol. 39, 282-300 (1976).
- Donoghue, J. P. Contrasting properties of neurons in two parts of the primary motor cortex of the awake rat. Brain Res. , 333-3173 (1985).
- Westby, G. W., Wang, H. A floating microwire technique for multichannel chronic neural recording and stimulation in the awake freely moving rat. J. Neurosci. Methods. 76, 123-133 (1997).
- Suga, N., O'Neill, W. E., Manabe, T. Cortical neurons sensitive to combinations of information-bearing elements of biosonar signals in the mustache bat. Science. 200, 778-781 (1978).
- O'Neill, W. E., Suga, N. Target range-sensitive neurons in the auditory cortex of the mustache bat. Science. 203, 69-73 (1979).
- Suga, N., O'Neill, W. E., Manabe, T. Harmonic-sensitive neurons in the auditory cortex of the mustache bat. Science. 203, 270-274 (1979).
- Portfors, C. V., Felix, R. A. 2nd Spectral integration in the inferior colliculus of the CBA/CaJ mouse. Neuroscience. , 136-1159 (2005).
- Felix, R. A. 2nd, Portfors, C. V. Excitatory, inhibitory and facilitatory frequency response areas in the inferior colliculus of hearing impaired mice. Hear Res. 228, 212-229 (2007).
- Portfors, C. V., Jonson, K. G., Roberts, P. D. Over-representation of species-specific vocalizations in the awake mouse inferior colliculus. Neuroscience. 162, 486-500 (2009).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , 3rd edn, Academic Press. NY. (2007).
