Preparação de um mouse Awake para gravar as respostas neurais e injetando Tracers

Summary

Caracterização eletrofisiológica das respostas neuronais é importante para compreender o funcionamento do cérebro e para orientar a colocação de corantes para caminho traçado. No entanto, muitos estudos são realizados em animais anestesiados. Para entender o funcionamento do cérebro sem anestesia, foi desenvolvido um método para registrar propriedades resposta neuronal e injetar corantes no rato acordado.

Abstract

É bem conhecido que a anestesia altera as propriedades de resposta neurais em várias regiões do cérebro. ^13. No sistema auditivo, as propriedades fundamentais de resposta de neurônios do tronco cerebral como a tolerância, a especificidade, freqüência e bandas laterais inibitórias são alteradas de forma significativa sob anestesia ^1-2. Estas observações levaram os fisiologistas a buscar maneiras de gravar a partir de neurônios sem os efeitos contaminantes da anestesia. Um resultado foi uma preparação descerebrada, onde o tronco cerebral foi completamente seccionado ao nível do mesencéfalo ^4. As desvantagens desta preparação é uma cirurgia formidável, a eliminação de descer projeções do cérebro anterior, e uma incapacidade de usar a estimulação sensorial para examinar as estruturas acima do mesencéfalo. Uma estratégia diferente foi a implantação de eletrodos cronicamente a gravar a partir de neurônios isolados e aglomerados multiunidade enquanto o animal está acordado e / ou comportar ^5,6 7-9 ao mouse ^10-12. Usando este método, somos capazes de realizar gravações eletrofisiológicas durante vários dias no rato não anestesiados. No final das sessões de gravação, então podemos injectar um corante para reconstruir as posições de eléctrodos e os locais de gravação ou de injectar um traçador de modo que as vias de e para os loci de gravação pode ser determinada. Este método permite assim isolado gravações único neurónio durante vários dias sem os anestésicos de uso.

Protocol

1. Encosto de cabeça Visão

1. Para montar um custom-built cabeça pós-, insira um 1/16 "em aço inoxidável rolo pin-perpendicularmente em um buraco perfurado em 3/32" haste de aço inoxidável para formar uma cruz. A peça vertical da cabeça pós-deve ser cerca de 20 mm ea peça transversal horizontal de cerca de 15 mm. Toque uma extremidade da haste vertical para aceitar um parafuso # 1-72. (Fig. 1).
2. Durante a cirurgia e gravação, a cabeça de pós-está protegido num latão construído sob encomenda ou barra de alumínio de montagem com um 1-72 # parafuso (Fig. 2). A peça longo da barra de montagem deve ser cerca de 90 mm de comprimento e 5-10 mm de largura. A cabeça de pós-se encaixa num sulco cortado em uma extensão 15 milímetros para fora da barra de comprimento que é um ângulo de 45 graus. Para impedir a rotação da cabeça, a peça transversal dos aninha cabeça pós-em uma pequena ranhura na parte inferior da barra de montagem.
3. A barra de montagem em seguida, ligado a um bloco de alumínio custom-made de montagemk (Fig. 3). O bloco de montagem é de aproximadamente 30 mm x 30 mm x 25 mm. Este bloco de montagem é acoplado a um micromanipulador de modo que a posição da cabeça de pós-pode ser colocado com precisão ao longo da linha média e em bregma. O bloco de montagem é feita de duas peças montadas em conjunto com parafusos. Um recorte no bloco permite que a barra de montagem para deslizar para dentro e ser fixada com os parafusos. A barra de montagem é paralela à superfície da mesa. Durante a gravação, fixar a barra em um quadro estereotáxico personalizado (Fig. 4). O stereotax é concebido para montar a barra na mesma posição como no bloco de montagem durante a cirurgia. Este arranjo assegura que o rato será sempre alinhado com o quadro estereotáxico em sessões experimentais.
4. Cortar uma haste de tungsténio (diâmetro 0,010 ") a aproximadamente 5 mm de comprimento, com cerca de 1 milímetro dobrada a 45 °. Esta haste serve como o pino de terra (Fig. 1).

2. Estereotáxica Alignment para Craniotomia

Nota: Todos os procedimentos descritos a seguir seguem padrão de assepsia e técnicas cirúrgicas têm sido aprovado pelo Animal Care Washington State University e da Comissão de Uso e o Animal Comitê de Ética do Instituto Garvan.

1. Anestesiar o rato através da colocação de uma câmara de indução com 5% de isoflurano. A falta de uma reacção à cauda e / ou pitada toe assegura que o animal é totalmente anestesiado.
2. Posicione o mouse em um quadro estereotáxico roedor equipado com um adaptador de mouse (Stoelting). Para orientar o mouse corretamente, colocar os dentes dentro do buraco da barra de mordida e apertar a braçadeira nariz por isso é confortável. Posicione o mouse o mais reto possível na barra de mordida e pinça o nariz. Colocar uma máscara facial feita a partir de um pedaço de luvas de látex sobre o nariz do rato, e manter o isoflurano em 5% até que a taxa do rato respiração é de aproximadamente 1 respiração / seg. Gire o isoflurano a 1,5 - 2,0%. Proteja a cabeça com tele auriculares bares tomando cuidado para não perfurar o tímpano. Barras deve ser confortável, mas não penetrar muito profundamente nos canais auditivos.
3. Coloque uma almofada de aquecimento debaixo do mouse.
4. Aplicar pomada oftálmica para evitar que os olhos sequem.
5. Raspar o couro cabeludo de entre as orelhas até os olhos com um barbeador pequeno ou fino de ponto tesoura.
6. Limpar e esterilizar o couro cabeludo limpando-o com cloro-hexidine (ou betadine) matagal, seguido pelo álcool lavagem repetido 3 vezes.
7. Para remover a pele sobre o topo do crânio fazer uma incisão ao longo da linha média da parte de trás da cabeça para os olhos.
8. Raspar o periósteo para as bordas da incisão com um bisturi. Se necessário (dependendo alvo experimental), cuidadosamente retrair a musculatura na parte de trás do pescoço com uma pinça, permitindo que o músculo para rasgar ao longo fascículos para minimizar a hemorragia. Aplicar Gelfoam debaixo tecido do couro cabeludo para minimizar a humidade e impedir que a pele que se move sobre o crânio.
9. Seca-se a superfície do crânio com um aplicador com ponta de algodão humedecido com álcool isopropílico, para melhorar a visualização de pontos de referência do crânio.
10. Alinhe o crânio a norma estereotáxica coordenadas ^13. Introduza uma sonda de ponta fina no porta-eletrodo e anexá-lo ao micromanipulador estereotáxica. Uma haste de metal afiada funciona bem para esta finalidade (Fig. 5).
11. Usar o ponto de identificar Bregma (Fig. 5A) e Lambda (Fig. 5B) no crânio. Mover a sonda vai-e-vem entre esses pontos, verificando que a coordenada lateral-medial para cada local é diferente por não mais que 50 um. Reposicionar a cabeça, conforme necessário, cuidadosamente soltando os orelha-bares, deslocando a cabeça e orelha-bares lateralmente, e reapertar os orelha-bares.
12. Verificar que a altura dorsal-ventral em cada local difere por não mais do que 50 uM. Ajustar a altura do nariz de fixação, que vai rodar o crânio em torno do eixo dos orelha-bares,para nivelar a altura do crânio, se necessário. A altura da orelha-bar também pode necessitar de ser ajustada.
13. Use um atlas ¹³ para identificar as coordenadas do alvo de interesse (Fig. 5C) em relação ao bregma. Marque o crânio acima da meta (por exemplo, um "X" ou usar tinta nanquim para dot quatro cantos de um quadrado) onde a craniotomia será feita (Fig. 5D).

3. Cabeça e pós-instalação do pino terra

1. Use gel para limpar etch crânio. Use o aplicador para esfregar e espalhar gel etch sobre a superfície (10 seg). Lavar com água e secar completamente. Aplicar o primer para cimento dental para a superfície do crânio utilizando aplicador. Espalhe cola com aplicador novo. Curar o adesivo com um luz UV arma-(1 ciclo).
2. Escolha um local para o pino terra que é distal ao local de destino. Cuidadosamente, deu à luz um pequeno buraco no crânio, utilizando a ponta de um bisturi # 65 miniblade apenas larga o suficiente para a extremidade curta da p terrenopara entrar e repousar sobre as meninges. O pino de chão deve ser orientado de modo que é voltada para o lado de bregma e no futuro cabeça pós-(Fig. 6A).
3. Fixe a cabeça pós-à barra de montagem e bloquear e anexar ao micromanipulador. Ao mover o micromanipulador em três dimensões, posicionar a cabeça de pós-over Bregma, apenas a tocar o crânio (Fig. 6B). A base da cabeça pós-deve ficar plana sobre o crânio.
4. A utilização de sondas de dissecação, aplique uma pequena quantidade de cimento dental ao redor da cabeça e pós-pino terra (Fig. 6C). Pressione o cimento para baixo para assegurar um bom contato com o crânio. Nota: Não use cimento muito ou não vai endurecer uniformemente. Curar o cimento com uma luz UV-gun (3-4 ciclos de vários ângulos).
5. Aplicar a segunda fase de cimento e construir-se a base em torno da cabeça de pós-e cobrir as ranhuras da cabeça pós-(Fig. 6D).

4. Craniotomia

1. Localizar a craniotomia marca de referência, que será parcialmente obscurecido pelo primer. Use um bisturi # 65 para marcar um milímetro quadrado 3 x 3 mm em torno deste local e aplicar uma gota de lidocaína para reduzir a sensibilidade e para minimizar a hemorragia.
2. Fazer pontuações múltiplas de cada lado do quadrado (tantos quanto 10), tendo cuidado para não cortar o osso e no cérebro (Fig. 7A).
3. Uma vez que a aba de osso fica solto, utilizar a ponta do bisturi para erguer-la para cima, deixando a dura-máter intacta (Fig. 7B).
4. Cubra com cera de osso.

5. Pós-operatório

1. Desligue anestesia gás e retire o mouse a partir do quadro estereotáxico.
2. Use um aplicador com ponta de algodão para aplicar pomada de lidocaína em torno de pele exposta para amortecer a sensação em torno da ferida. Use outro aplicador com ponta de algodão para aplicar Neosporin para a pele exposta. Injectar cetoprofeno (5 IM mg / kg ou IP com base na preferência de individuais veterinários IACUC) comoum analgésico pós-operatório. Rato será geralmente levantam e se movimentam dentro dos minutos de interrupção de gás.
3. Local rato em uma gaiola quente e monitor até que ele está pronto para retornar ao alojamento dos animais.
4. O animal deve ser verificada em pelo menos uma vez por dia depois de ter recuperado de uma cirurgia. Preste atenção aos sinais de má alimentação e / ou beber e comportamento apático. Se a dor é suspeita, fornecer cetoprofeno a cada 24 horas (mesma dose que no final do pós-cirurgia) até aliviada. A lidocaína pode ser aplicado localmente sobre a ferida se o animal está se coçando ou mostra sinais de desconforto. Animais tipicamente recuperar de uma cirurgia sem complicações ou dor.

6. Injeção de gravação e Dye

1. Aguarde pelo menos um dia depois de cabeça pós-cirurgia antes de usar o mouse para as gravações.
2. Coloque o rato em um dispositivo de contenção de espuma moldada ao corpo do mouse. O rato já foi adaptado a este dispositivo, reduzindo assim a sua ansiedade. Adaptação típica élidar com o mouse todos os dias após o desmame, por cerca de uma semana antes da cirurgia e experiências, coloque o mouse no dispositivo de espuma durante 1-5 minutos. Suspender dispositivo no quadro estereotáxico (Fig. 4).
3. Seguro cabeça pós-a barra de montagem, que agora é fixado à armação estereotáxico (Fig. 4).
4. Ligue para o pino de aterramento com um fio encerrado com um contundente ponta da agulha hipodérmica calibre 22.
5. Remover cera de osso sobre a craniotomia. Remover dura-máter, se necessário, usando a ponta de um bisturi miniblade.
6. Conduz eléctrodo para o local adequado estereotáxico e iniciar a gravação (Fig. 8). Por apenas gravações electrofisiológicos, uma variedade de eléctrodos podem ser usados. A escolha do eléctrodo é dependente da localização e do tipo de gravações requeridas. A escolha do eléctrodo para as gravações de rato desperto será o mesmo que o que um pesquisador utiliza em um rato anestesiado. Para combinados com gravações eletrofisiológicascorante / traçador injeções, um eletrodo de micropipeta é utilizada ^10. A micropipeta é preenchido com o corante / traçador de escolha de modo que ele pode ser injectado iontoforéticamente no final das experiências electrofisiológicos. Eléctrodos Multibarrel também pode ser utilizado de modo a que as manipulações farmacológicas podem ser feitas. O eléctrodo multibarrel é montado de uma micropipeta de gravação única (Fig. 8). Estas técnicas são padrão na literatura e não são diferentes para as gravações anestesiados contra acordado.
7. As gravações podem ser feitas para 4-5 horas durante 3-4 dias consecutivos.
8. No final da sessão de gravação, o corante / traçador pode ser injectado. Como não existem receptores da dor no cérebro, a injecção iontoforético do corante ou traçador para o cérebro é pouco provável que cause desconforto. No entanto, uma vez que as propriedades electrofisiológicas de resposta da região onde a injecção é para ser feita são caracterizados, o animal pode ser anestesiados com isoflurano fou a injecção. Isso eliminaria todas as sensações possíveis indesejados. Porque o corante / traçador já está na micropipeta, os eléctrodos activos e moído pode ser ligada a partir da gravação electrofisiológico set-se ao gerador de corrente para injectar o corante iontoforéticamente / traçador. Use protocolo apropriado para a tintura / marcador no eletrodo. Retire o animal do contenção e moderação headpost corpo e voltar para sua gaiola.
9. No final da experiência, seguir o protocolo apropriado para a eutanásia e processamento de tecidos para recuperar local da injecção e rotulagem.

7. Os resultados representativos

Instalação bem-sucedida da cabeça pós-permite que o experimentador para gravar as respostas individuais e multiunidade de um mouse, não anestesiados acordado durante vários dias. O sistema de retenção permite estáveis ​​gravações eletrofisiológicas de neurônios individuais no cérebro. Excelente isolamento de unidades individuais e respostas fortes testímulos O podem ser gravado a partir da estrutura do cérebro mesmo durante vários dias, por exemplo, no colículo inferior do rato (Fig. dia, 9A um; Figura 9B, dia dois). Com uma instalação pós-cabeça boa, cada rato será sempre alinhado com o aparelho estereotáxico eo mouse estereotáxica atlas, ^13, resultando na localização de confiança de núcleos cerebrais particular. Esta localização permite fiável para injecção de corantes e traçadores em estruturas específicas após dias de gravação múltiplas. Por exemplo, para avaliar descendente projecções a partir do mesencéfalo auditivo para o tronco cerebral auditivo, biotinilado dextrano amina (diaminobenzidina usando visualizada como cromogénio) pode ser injectado no rato colículo inferior (Fig. 10A) após electrofisiologicamente identificar propriedades resposta neuronal no local da injecção (na fig. 10A, um neurónio foi gravado com uma melhor frequência de 51 kHz), e após o processamento de tecidos, umarotulagem nterograde no núcleo dorsal contralateral coclear pode sido visualizou e representado (Fig. 10B). As fotomicrografias com maior resolução pode também ser obtida para ler axónios anterogradamente rotulados e terminais (Fig. 10C).

Figura 1.

Figura 2.

Figura 3.

Figura 4.

Figura 5.

Figura 7.

Figura 8.

Figura 9.

Figura 10.

Discussion

A vantagem do sistema de apoio de cabeça pós-para experimentos eletrofisiológicos e neuroanatômicas em rato é que os experimentos podem ser realizados com anestesiados, ratos acordados, eliminando a contaminação potencial de resposta devido à drogas anestésicas. Além disso, a configuração pode ser usada durante vários dias para permitir o uso de animais mais eficiente.

A maioria dos componentes para a pós-cabeça estão disponíveis off-the-shelf. Apenas a cabeça pós-montagem e aparelhos são feitos sob medida, ambas as quais são relativamente simples de construir e são reutilizáveis. Se uma loja de máquina não está disponível em uma Instituição, o pesquisador pode provavelmente usar http://www.emachineshop.com/ para fabricar os componentes necessários.

Proficiente habilidades cirúrgicas são necessárias. Os cirurgiões devem estar acostumado com finas técnicas cirúrgicas, algumas das quais são mais feitas debaixo de um microscópio. O cirurgia deve ser feita sob condições assépticas. Retirar a aba do crânio é o ponto mais delicado do processo. Através de uma cuidadosa e delicadamente fazendo pontuações múltiplas com um bisturi ao longo dos 4 lados do retângulo ao olhar através de um microscópio cirúrgico, a aba do crânio pode ser "exibido fora", com sangramento mínimo, deixando a dura-máter intacta. Familiaridade com a vasculatura subjacente é essencial, como fazer um corte acima de um grande vaso sanguíneo cria um risco de hemorragia indesejável. Porque a nossa investigação centra-se no sistema auditivo, que têm evitado o uso de brocas para a realização de craniotomias, a fim de minimizar o potencial de osso conduzida trauma ouvido interno.

É importante para obter o nível plano ântero-posterior e em alinhamento estereotáxica antes de encaixar a cabeça-post. Essa precaução garante que a cabeça vai permanecer em nível de estudos experimentais e facilita a localização dos loci cerebrais usando um atlas do cérebro.

tenda "> Para a gravação, é útil para lidar com o mouse em uma base diária por alguns dias antes da cirurgia. Basta pegar o mouse exposto a manipulação e contenção no dispositivo de espuma facilita as sessões de gravação mais longos, com redução do stress e muito movimento do mouse. A chave é ter o mouse se encaixem no sanduíche de espuma. Se o animal pode mover-se excessivamente, ele tende a lutar continuamente. Se o mouse começa a lutar, é melhor encerrar a sessão de gravação e pegar novamente o próximo dia. Movimento dos resultados do rato em biopotenciais grandes em que as gravações não são evocadas pelos estímulos. Estes são geralmente maior amplitude que os potenciais de acção e são intermitentes. artefactos de circulação pode também ser gerado por os fios de gravação em contacto com o animal. É importante para assegurar que não existem fios em contacto com o animal. um modo geral, esta técnica permitiu-nos para conduzir estudos múltiplos em processamento auditivo e anatomia sem o uso de anestésicos.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Etch gel for cleaning skull prior to dental cement	Henry Schein	101-5396	12/pk with 1.2 mL syringes
Primer for dental cement	Kerr Optibond	25881	8 mL bottle
Adhesive for dental cement	Kerr Optibond	25882	8 mL bottle
Applicators for dental cement	Kerr Optibond	24680	200/pk
Dental Cement	Charisma, Heraeus Kulzer	66000085	4gm Syringe Refill
Tungsten Rod (Ground Pin)	A-M Systems	717200	0.010" diameter
Economy UV Curing Light	Henry Schein	CU-80
Head-post	Built in-house
Mounting bar	Built in-house
Mounting block	Built in-house
Stereotaxic Frame	David Kopf Instruments	902
Mouse and Neonatal Rat Adaptor	Stoelting Co.	51625
Deltaphase Isothermal Pad	Braintree Scientific, Inc.	39DP