Summary
Elektrofysiologische eigenschappen van de neuronale antwoorden is van belang voor het begrijpen van de hersenfunctie en voor het geleiden van de plaatsing van kleurstoffen voor route tracing. Er zijn echter vele studies uitgevoerd in verdoofde dieren. Om de hersenfunctie te begrijpen zonder verdoving, ontwikkelden we een methode om neuronale respons-eigenschappen op te nemen en te injecteren kleurstoffen in wakkere muis.
Abstract
Het is algemeen bekend dat verdoving neurale respons-eigenschappen verandert in verschillende regio's van de hersenen. 13. In het auditieve systeem, zijn fundamentele antwoord eigenschappen van neuronen hersenstam inclusief drempel, frequentie specificiteit en remmende zijbanden veranderd in belangrijke opzichten onder narcose 1-2. Deze waarnemingen gevraagd fysiologen zoeken naar manieren om van enkele neuronen op te nemen zonder de vervuilende effecten van narcose te zoeken. Het resultaat was een decerebratie preparaat, waarbij de hersenstam volledig was doorsneden ter hoogte van de middenhersenen 4. De nadelen van dit preparaat zijn een formidabele chirurgie, de eliminatie van dalende projecties van de voorhersenen, en een onvermogen om zintuiglijke stimulatie te gebruiken om structuren te onderzoeken boven de middenhersenen. Een andere strategie is om chronisch implanteren elektrode arrays op te nemen van enkele neuronen en meervoudige clusters, terwijl het dier wakker is en / of gedraagt 5,6 7-9 de muis 10-12. Met behulp van deze methode zijn wij in staat om elektrofysiologische opnames uit te voeren gedurende een aantal dagen in de unanesthetized muis. Aan het einde van de opnames, kan men dan injecteren kleurstof elektrode posities opname locaties reconstrueren of tracer injecteren zodat trajecten en naar de opname loci kan worden bepaald. Deze methode zorgt voor een goed geïsoleerd enkel neuron-opnamen over meerdere dagen zonder het gebruik anesthetica.
Protocol
1. Hoofdsteunen Overzicht
- Om een custom-built hoofd-bericht samen te stellen, "loodrecht RVS roll-pin in een gat geboord in een 3/32" Steek een 1/16 roestvrij stalen staaf aan een kruis te vormen. De verticale stuk van het hoofd-post moet ongeveer 20 mm en een horizontale dwarsstuk ongeveer 15 mm zijn. Raak een uiteinde van de verticale staaf een # 1-72 schroef accepteren. (Fig. 1).
- Tijdens de operatie en de opname wordt de hoofd-post bevestigd in een op maat gemaakte messing of aluminium montage-bar met een # 1-72 schroef (afb. 2). De lange stuk van de montage-bar moet ongeveer 90 mm lang en 5-10 mm breed. Het hoofd-bericht past in een gleuf die in een 15 mm verlenging uit de lange bar die een hoek van 45 graden. Rotatie van het hoofd, de dwarsbalk van de kop-post ingebed voorkomen in een kleine groef in de onderzijde van de montageplaat bar.
- De montage-bar in dan bevestigd aan een op maat gemaakte aluminium montage blokk (Fig. 3). De montageblok ongeveer 30 mm x 30 mm x 25 mm. Dit montageblok is aangesloten op een micromanipulator zodat de positie van het hoofd-na nauwkeurig worden geplaatst langs de middellijn en bregma. De montage blok uit twee delen met schroeven aangebracht. Een uitsparing in het blok kan de montage balk te glijden in en vastgezet worden met de schroeven. De montage bar evenwijdig aan het tafelblad. Tijdens het opnemen, zet de bar in een aangepaste stereotaxisch frame (afb. 4). De stereotax is ontworpen om de bar monteren in dezelfde positie in het montageblok tijdens chirurgie. Deze regeling zorgt ervoor dat de muis altijd worden afgestemd op de stereotaxisch frame over experimentele sessies.
- Snij een wolfraam stift (diameter 0,010 ") tot ongeveer 5 mm lengte met ongeveer 1 mm gebogen bij 45 °. Deze stang dient als de aardpen (Fig. 1).
2. Stereotaxische Alignment voor craniotomie
Opmerking: Alle procedures die de onderstaande standaard aseptische chirurgische technieken en zijn goedgekeurd door de Washington State University Animal Care en gebruik Comite en het Dier Ethische Commissie van het Garvan Instituut.
- Verdoof de muis door het plaatsen van een inductie kamer met 5% isofluraan. Het ontbreken van een reactie op staart en / of toe pinch zodat het dier volledig verdoofd.
- Plaats de muis in een knaagdier stereotaxisch frame uitgerust met een muis adapter (Stoelting). Te oriënteren de muis goed, plaats de tanden in het gat van de beet bar en draai de neus klem, zodat het stevig vast zit. Plaats de muis zo recht mogelijk in de bijt bar en neus klem. Plaats een masker gemaakt uit een stuk latex handschoen over de neus van de muis, en houd de isofluraan bij 5% tot de muis ademhaling is ongeveer 1 adem / sec. Draai de isofluraan tot 1,5 - 2,0%. Zet de kop met tHij oor-bars let daarbij goed op niet doorboren het trommelvlies. Bars moet goed aansluiten, maar niet binnen te dringen te diep in de gehoorgang.
- Plaats een verwarmingselement onder de muis.
- Breng oogzalf om de ogen niet uitdrogen.
- Scheer de hoofdhuid van tussen de oren tot aan de ogen met een klein scheerapparaat of fijn-punt schaar.
- Reinig en ontsmet de hoofdhuid schoon met chloor-hexidine (of betadine) scrub, gevolgd door alcohol spoelen 3 keer wordt herhaald.
- Om de huid te verwijderen over de bovenkant van de schedel een insnijding over de middellijn vanaf de achterkant van het hoofd naar de ogen.
- Schraap de periosteum de randen van de insnijding met een scalpel. Indien nodig (afhankelijk van de experimentele doel), voorzichtig terug te trekken de spieren aan de achterkant van de nek met een pincet, waardoor de spier te scheuren langs de bundels te bloeden te minimaliseren. Breng gelfoam onder hoofdhuid weefsel om zo weinig mogelijk vocht en te voorkomen dat de huid kan bewegen over de schedel.
- Droog de schedel oppervlak met een wattenstaafje bevochtigd met isopropylalcohol om de visualisatie van de schedel bezienswaardigheden te verbeteren.
- Lijn de schedel met standaard stereotaxische coördinaten 13. Steek een fijne-point sonde in de elektrode houder en bevestig deze aan de stereotaxische micromanipulator. Een scherp draadmetaal goed werkt voor dit doel (Fig. 5).
- Gebruik het punt om bregma (Fig. 5A) en Lambda (Fig. 5B) te identificeren op de schedel. Beweeg de sonde heen-en-weer tussen deze punten, te controleren of de laterale-mediale coördinaat voor elke locatie een verschil van niet meer dan 50 urn. Plaats het hoofd indien nodig door voorzichtig losmaken van de oor-bars, het verschuiven van het hoofd en oor-bars lateraal, en natrekken van de oor-bars.
- Controleer de rug-ventrale hoogte op elke plaats verschilt niet meer dan 50 pm. De hoogte van de neus-klem, die de schedel roteren rond de as van het oor-bars,om de toonhoogte van de schedel indien noodzakelijk niveau. De hoogte van de oor-bar zou ook moeten worden aangepast.
- Gebruik een atlas 13 tot en met de coördinaten van de doelstelling van belang (Fig. 5C) ten opzichte van bregma te identificeren. Markeer de schedel boven de doelstelling (bijvoorbeeld een "X" of gebruik maken van Oost-Indische inkt op dot vier hoeken van een vierkant) waar een craniotomie zal worden gemaakt (afb. 5D).
3. Head-post en Ground Pin Installatie
- Gebruik etsen gel om de schedel te reinigen. Gebruik de applicator te schrobben en etsen gel verspreid over het oppervlak (10 sec). Wassen met water en drogen. Breng de primer voor tandheelkundige cement aan de schedel oppervlak met behulp van de applicator. Verspreid lijm met nieuwe applicator. Cure de lijm met een UV-licht-gun (1 cyclus).
- Kies een locatie voor de aardingspin die distaal van de beoogde site. Voorzichtig droeg een klein gaatje in de schedel met behulp van de punt van een # 65 miniblade scalpel net breed genoeg voor de korte einde van de grond pin binnen te komen en rusten op de hersenvliezen. De aardpen moet gericht, zodat deze wijzen van bregma en de toekomst kop-post (Fig. 6A).
- Zet de kop-post aan de montage bar en te blokkeren en hechten aan de micromanipulator. Door het verplaatsen van de micromanipulator in drie dimensies, de positie van de kop-post over bregma, alleen het aanraken van de schedel (Fig. 6B). De basis van het hoofd-post moet plat op de schedel.
- Met behulp van dissectie probes, een kleine hoeveelheid van tandheelkundige cement rond het hoofd-post en op de grond pin (Fig. 6C). Druk cement tot een goed contact met de schedel verzekeren. Let op: Gebruik niet te veel cement of het zal niet uitharden gelijkmatig. Cure het cement met een UV-licht-gun (3-4 cycli vanuit meerdere hoeken).
- Breng de tweede fase van cement en de opbouw van de bodem rond het hoofd-post en dekken de groeven van het hoofd-post (fig. 6D).
4. Craniotomie
- Zoek de craniotomie referentie-merk, die gedeeltelijk zal worden gestoord door de primer. Gebruik een # 65 scalpel op een 3 mm markeren x 3 mm vierkant rond op deze site en een daling van lidocaïne om de gevoeligheid te verminderen en om het bloeden te minimaliseren toe te passen.
- Maak meerdere scores aan beide zijden van het plein (zoveel als 10), zorg dat u dwars door het bot en in de hersenen (fig. 7A).
- Zodra het bot klep los komt te zitten, gebruik dan de punt van het scalpel om het te wrikken op, het verlaten van de dura mater intact (afb. 7B).
- Bedek met been was.
5. Post-operatie
- Schakel gas verdoving en verwijder de muis van de stereotaxisch frame.
- Gebruik een wattenstaafje om Lidocaïne zalf toe te passen rond de blootgestelde huid te verdoven gevoel rond wond. Gebruik een ander wattenstaafje toe te passen Neosporin op de blootgestelde huid. Injecteer ketoprofen (5 mg / kg IM of IP op basis van voorkeur van de individuele IACUC dierenartsen) alseen post-operatie analgeticum. Mouse zal in het algemeen en die zich binnen minuten van gas stoppen.
- Plaats de muis in een warme kooi en de monitor totdat het klaar is om terug te keren naar huisvesting van dieren.
- Het dier worden gecontroleerd op ten minste eenmaal per dag is hersteld operatie. Let op tekenen van slecht eten en / of drinken en lusteloos gedrag. Als de pijn wordt vermoed, om te voorzien ketoprofen elke 24 uur (dezelfde dosis als aan het eind van na de operatie) tot verlicht. Lidocaïne kan lokaal worden toegepast op de wond als het dier wordt krassen of tekenen van ongemak. Dieren meestal te herstellen van een operatie zonder complicaties of pijn.
6. Opnemen en Dye Injectie
- Wacht minstens een dag na hoofd-na de operatie voor het gebruik van de muis voor de opnames.
- Plaats de muis in een schuim-remmende apparaat gegoten om het lichaam van de muis. De muis is reeds aangepast aan deze inrichting, waardoor de angst. Typische aanpassing isom de muis te verwerken elke dag na het spenen en voor ongeveer een week voorafgaand aan de operatie en experimenten, plaatst u de muis in het schuim apparaat voor 1-5 minuten. Suspendeer apparaat in de stereotaxisch frame (Fig. 4).
- Beveiligde kop post-baar, dat nu is bevestigd aan het stereotaxisch frame (Fig. 4).
- Maak verbinding met de grond pin met een draad afgesloten met een stompe 22-gauge injectienaald tip.
- Verwijder het bot was over de craniotomie. Verwijder de dura indien nodig met behulp van de punt van een miniblade scalpel.
- Rijd elektrode om de juiste stereotaxische locatie en beginnen met opnemen (fig. 8). Voor slechts elektrofysiologische opnamen kan verschillende elektroden worden gebruikt. De keuze van elektrode is afhankelijk van de plaats en vorm van de vereiste opnamen. De keuze van de elektrode voor de bewuste muis opnamen hetzelfde als wat een onderzoeker gebruikt in een verdoofde muis. Voor gecombineerde elektrofysiologische opnamen metkleurstof / tracer injecties wordt een micropipet elektrode gebruikt 10. De micropipet wordt gevuld met de kleurstof / tracer keuze zodat het iontophoretically worden geïnjecteerd aan het eind van elektrofysiologische experimenten. Multibarrel elektroden kan ook zodanig worden gebruikt dat farmacologische manipulaties kan worden. De multibarrel elektrode is bevestigd op een opname micropipet (Fig. 8). Deze technieken zijn standaard in de literatuur en niet verschillend voor anesthesie versus wakker opnamen.
- Opnames kunnen worden gemaakt voor 4-5 uur gedurende 3-4 opeenvolgende dagen.
- Aan het einde van de opnamesessie kan de kleurstof / tracer worden geïnjecteerd. Omdat er geen pijn receptoren in de hersenen, de iontoforetische injectie van de kleurstof of de tracer in de hersenen is het onwaarschijnlijk dat ongemak veroorzaken. Echter, zodra de elektrofysiologische respons-eigenschappen van de regio waar de injectie moet worden gemaakt worden gekenmerkt, kan het dier verdoofd met isofluraan fof injectie. Dat zou een einde eventuele ongewenste sensaties. Doordat de kleurstof / tracer is al in de micropipet, kan de actieve en massakabels omgeschakeld worden van de elektrofysiologische opname set-up van de huidige generator om iontophoretically injecteren de kleurstof / tracer. Gebruik geschikte protocol voor de kleurstof / tracer in de elektrode. Haal het dier uit de headpost terughoudendheid en lichaam beheersen en terug te keren naar zijn kooi.
- Aan het einde van het experiment, volg juiste protocol voor euthanasie en weefsel verwerking plaats van de injectie en de etikettering te herstellen.
7. Representatieve resultaten
Succesvolle installatie van het hoofd-post kan de experimentator moet enkel-en meervoudige antwoorden opnemen vanaf een unanesthetized, wakker muis over meerdere dagen. Het beveiligingssysteem zorgt voor een stabiele elektrofysiologische opnamen van enkele neuronen in de hersenen. Uitstekende isolatie van afzonderlijke eenheden en sterke reacties to stimuli worden opgenomen van dezelfde hersenstructuur over meerdere dagen, bijvoorbeeld in de muis lage colliculus (Fig. 9A, dag, Figuur 9B, dag twee). Met een goede kop-post installatie, zal elke muis steeds worden afgestemd op de stereotaxische apparatuur en de muis stereotaxische atlas, 13 wat resulteert in betrouwbare lokalisatie van bepaalde hersenkernen. Deze betrouwbare lokalisatie zorgt voor een injectie van kleurstoffen en tracers in specifieke structuren na meerdere opname dagen. Bijvoorbeeld, om te beoordelen aflopende projecties van de auditieve middenhersenen naar de auditieve hersenstam, gebiotinyleerd dextraan amine (gevisualiseerd met behulp van diaminobenzidine als chromageen) kan worden geïnjecteerd in de muis colliculus inferior (Fig. 10A) na elektrofysiologische het identificeren van neuronale respons-eigenschappen op de plaats van injectie (in Fig. 10A een neuron is opgenomen met een beste frequentie van 51 kHz) en na verwerking weefsel eennterograde etikettering in de contralaterale dorsale cochleaire nucleus kan zijn gevisualiseerd en uitgezet (Fig. 10B). Microfoto's met een hogere resolutie kan ook worden verkregen op anterogradely gelabeld axonen en terminals (Fig. 10C) te bekijken.
Figuur 1.
Figuur 2.
Figuur 3.
Figuur 4.
Figuur 5.
Figuur 7. 
Figuur 8. 
Figuur 9. 
Figuur 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het voordeel van het hoofd-post beveiligingssysteem voor elektrofysiologische en neuroanatomische experimenten in de muis is dat experimenten kunnen worden uitgevoerd met unanesthetized, wakker muizen, waardoor de potentiële reactie verontreiniging als gevolg van anesthetica. Bovendien is de opstelling kan worden over meerdere dagen een efficiëntere huisdieren.
De meeste onderdelen voor het hoofd-post zijn off-the-shelf. Alleen het hoofd-post en montage apparaten zijn op maat gemaakt, die beide zijn relatief eenvoudig te bouwen en zijn herbruikbaar. Als een machine winkel niet beschikbaar is in een instelling, kan de onderzoeker waarschijnlijk gebruik maken van http://www.emachineshop.com/ om de noodzakelijke componenten fabriceren.
Vaardige chirurgische vaardigheden zijn noodzakelijk. Chirurgen moeten bedreven met fijne chirurgische technieken, waarvan best worden uitgevoerd onder een microscoop. De operatie moet worden uitgevoerd onder aseptische omstandigheden. Het verwijderen van de schedel flap is het meest delicate punt van de procedure. Door het zorgvuldig en voorzichtig het maken van meerdere scores met een scalpel langs de 4 zijden van de rechthoek terwijl u door een operatiemicroscoop, kan de schedel flap worden "popped off" met minimale bloedingen, het verlaten van de dura mater intact. Bekendheid met de onderliggende bloedvaten is essentieel, evenals het maken van een snede boven een groot bloedvat een risico op ongewenste bloedingen ontstaan. Omdat ons onderzoek richt zich op het auditieve systeem, hebben we vermijden het gebruik van boren voor het uitvoeren van craniotomies om de kans op bot-uitgevoerd binnenoor trauma te minimaliseren.
Het is belangrijk om de anterior-posterior vlak niveau in stereotaxisch aanpassing voor het bevestigen van de kop-post. Deze voorzorgsmaatregel zorgt ervoor dat de kop blijft niveau in experimentele proeven en vergemakkelijkt de locatie van de hersenen van loci met behulp van een brain atlas.
tent "> Voor de opname, is het nuttig om de muis te behandelen op een dagelijkse basis voor een paar dagen voor de operatie. Gewoon om de muis blootgesteld aan de behandeling en terughoudendheid in het schuim apparaat met langere opnamesessies met veel minder stress en beweging van de muis. De sleutel is om de muis goed passen in het schuim sandwich. Als het dier kan overmatig bewegen, heeft het de neiging om continu te worstelen. Als de muis begint te worstelen om, is het het beste om de opname-sessie te beëindigen en weer ophalen de komende dag. beweging van de muis resulteert in grote biopotentials in de, nog niet worden opgeroepen door de stimuli. zijn algemeen grotere amplitude die actiepotentialen en intermitterende zijn. Bewegingsartefacten kan ook worden opgewekt door de opname draden raken de dieren. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat er geen draden aanraken van het dier het algemeen., heeft deze techniek konden we meerdere studies uit te voeren op de auditieve verwerking en anatomie zonder het gebruik van anesthetica.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Wij hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Ondersteund door NSF subsidie 0920060, NIH-subsidie DC004395, NHMRC subsidie 1.009.482, Zuid-Holland Office of Science and Medical Research, en de Garnett Passe en Rodney Williams Memorial Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Etch gel for cleaning skull prior to dental cement | Henry Schein | 101-5396 | 12/pk with 1.2 mL syringes |
| Primer for dental cement | Kerr Optibond | 25881 | 8 mL bottle |
| Adhesive for dental cement | Kerr Optibond | 25882 | 8 mL bottle |
| Applicators for dental cement | Kerr Optibond | 24680 | 200/pk |
| Dental Cement | Charisma, Heraeus Kulzer | 66000085 | 4gm Syringe Refill |
| Tungsten Rod (Ground Pin) | A-M Systems | 717200 | 0.010" diameter |
| Economy UV Curing Light | Henry Schein | CU-80 | |
| Head-post | Built in-house | ||
| Mounting bar | Built in-house | ||
| Mounting block | Built in-house | ||
| Stereotaxic Frame | David Kopf Instruments | 902 | |
| Mouse and Neonatal Rat Adaptor | Stoelting Co. | 51625 | |
| Deltaphase Isothermal Pad | Braintree Scientific, Inc. | 39DP |
References
- Evans, E. F., Nelson, P. G. The responses of single neurones in the cochlear nucleus of the cat as a function of their location and the anaesthetic state. Exp. Brain Res. 17, 402-427 (1973).
- Joris, P. X. Response classes in the dorsal cochlear nucleus and its output tract in the chloralose-anesthetized cat. J. Neurosci. 18, 3955-3966 (1998).
- Populin, L. C. Anesthetics change the excitation/inhibition balance that governs sensory processing in the cat superior colliculus. J. Neurosci. 25, 5903-5914 (2005).
- Young, E. D., Brownell, W. E. Responses to tones and noise of single cells in dorsal cochlear nucleus of unanesthetized cats. J. Neurophysiol. 39, 282-300 (1976).
- Donoghue, J. P. Contrasting properties of neurons in two parts of the primary motor cortex of the awake rat. Brain Res. , 333-3173 (1985).
- Westby, G. W., Wang, H. A floating microwire technique for multichannel chronic neural recording and stimulation in the awake freely moving rat. J. Neurosci. Methods. 76, 123-133 (1997).
- Suga, N., O'Neill, W. E., Manabe, T. Cortical neurons sensitive to combinations of information-bearing elements of biosonar signals in the mustache bat. Science. 200, 778-781 (1978).
- O'Neill, W. E., Suga, N. Target range-sensitive neurons in the auditory cortex of the mustache bat. Science. 203, 69-73 (1979).
- Suga, N., O'Neill, W. E., Manabe, T. Harmonic-sensitive neurons in the auditory cortex of the mustache bat. Science. 203, 270-274 (1979).
- Portfors, C. V., Felix, R. A. 2nd Spectral integration in the inferior colliculus of the CBA/CaJ mouse. Neuroscience. , 136-1159 (2005).
- Felix, R. A. 2nd, Portfors, C. V. Excitatory, inhibitory and facilitatory frequency response areas in the inferior colliculus of hearing impaired mice. Hear Res. 228, 212-229 (2007).
- Portfors, C. V., Jonson, K. G., Roberts, P. D. Over-representation of species-specific vocalizations in the awake mouse inferior colliculus. Neuroscience. 162, 486-500 (2009).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , 3rd edn, Academic Press. NY. (2007).
