Udarbejdelse af en vågen Mouse til optagelse Neurale svarene og Injektion Lysspor

Summary

Elektrofysiologisk karakterisering af neuronale reaktioner er vigtig for at forstå hjernens funktion og for at lede placeringen af ​​farvestoffer til vej sporing. Imidlertid er mange undersøgelser udført i bedøvede dyr. For at forstå hjernens funktion uden bedøvelse, har vi udviklet en metode til at registrere neuronale respons egenskaber og injicere farvestoffer i vågen mus.

Abstract

Det er velkendt, at anæstesi ændrer neurale respons egenskaber i forskellige områder af hjernen. ^13. I den auditive system er fundamentale reaktioner egenskaber hjernestamme neuroner, herunder tærskelværdi, frekvens specificitet og inhiberende sidebånd ændres i signifikante måder under anæstesi ^1-2. Disse observationer bedt fysiologer at finde måder til at optage fra enkelte neuroner uden de forurenende virkninger af anæstesi. Et resultat var decerebrate præparat, hvor hjernestammen blev fuldstændigt transected på niveauet af midterhjernen ^4. Ulemperne ved dette præparat er et formidabelt operation, fjernelse af faldende fremskrivninger fra forhjernen, og en manglende evne til at bruge sensorisk stimulation til at undersøge strukturer over midthjernen. En anden strategi har været at implantere elektrode arrays kronisk til at optage fra enkelte neuroner og multiunit klynger, mens dyret er vågen og / eller opfører sig ^5,6 7-9 til mus ^10-12. Ved hjælp af denne metode, er vi i stand til at udføre elektrofysiologiske optagelser over flere dage i den ikke-bedøvede mus. I slutningen af ​​indspilningerne, kan vi så injicere et farvestof til at rekonstruere elektrode positioner og optagelse steder eller indsprøjte et sporstof, så veje til og fra optagelse loci kan bestemmes. Denne metode giver mulighed for både isolerede enkelt neuron optagelser over flere dage uden brug bedøvelsesmidler.

Protocol

1. Head-tilbageholdenhed Oversigt

1. At samle en specialbygget head-post, indsætte en 1/16 "rustfri stål roll-pin vinkelret ind i et hul boret i en 3/32" rustfri stål stang til at danne et kors. Den lodrette del af hoved-stillingen skal være omkring 20 mm og en horisontal tværstykket omkring 15 mm. Tryk ene ende af den lodrette stang til at acceptere en # 1-72 skrue. (Fig. 1).
2. Under operationen og optagelse, er hoved-post sikret i en specialbygget messing eller aluminium montering bar med en # 1-72 skruen (fig. 2). Den lange stykke af monteringsstangen være omkring 90 mm lang og 5-10 mm bred. Hoved-stilling passer ind i en rille skåret til en 15 mm forlængelse ud lange stang, der er vinklet ved 45 °. For at forhindre rotation, tværstykket af hovedet post putter i en lille rille på bunden af ​​monteringsstangen.
3. Monteringen bar derefter fastgjort til en skræddersyet aluminium montering blokk (fig. 3). Monteringsblokken er ca 30 mm x 30 mm x 25 mm. Dette monteringsblok er fastgjort til en mikromanipulator, således at positionen af ​​hovedets stilling kan nøjagtigt placeret langs midterlinien og Bregma. Monteringsblokken er fremstillet af to stykker er forsynet med skruer. En udskæring i blokken giver monteringsstokken at glide i og fastgøres med skruer. Den monteringsstang er parallel med bordpladen. Under optagelse, sikre bar i en brugerdefineret stereotaktisk ramme (fig. 4). Den stereotax er designet til at montere bar i samme position som i monteringsblokken under operationen. Dette arrangement sikrer, at musen altid vil blive tilpasset til stereotaktisk ramme på tværs af eksperimentelle sessioner.
4. Skær en wolfram stang (diameter 0,010 ") til omkring 5 mm længde med ca 1 mm bøjet ved 45 °. Denne stang tjener som stedet stiften (fig. 1).

2. Stereotaktisk Alignment for kraniotomi

Bemærk: Alle procedurer er skitseret nedenfor følger standardprocedurer aseptiske kirurgiske teknikker og er blevet godkendt af Washington State University Animal Care og brug Udvalg og dyreetik Udvalg Garvan Institute.

1. Bedøve mus ved anbringelse i en induktion kammer med 5% isofluran. Manglen på en reaktion hale og / eller tå klemme sikrer, at dyret er fuldt bedøvet.
2. Placer musen i en gnaver stereotaktisk ramme udstyret med en mus adapter (Stoelting). For at orientere musen korrekt, tænderne placeres inde i hullet for bid bar og stram næse klemme, så den sidder stramt. Placer musen så lige som muligt i biddet bar og næse klemme. Placer en ansigtsmaske lavet af et stykke latex handske over musens næse, og holde isofluran ved 5%, indtil musens respirationsfrekvensen er cirka 1 åndedrag / sek. Drej isofluran til 1,5 - 2,0%. Fastgør hovedet ved hjælp af tHan øre-barer være omhyggelig med ikke at punktere trommehinden. Barer skal være lunt, men ikke trænger for dybt ind i øregangen.
3. Placere en varmepude under musen.
4. Anvendelse ophthalmisk salve for at forhindre øjnene mod udtørring.
5. Barber hovedbunden fra mellem ørerne op til øjnene med en lille shaver eller fine-punkt saks.
6. Rengøre og sterilisere hovedbunden ved aftørring med chlor-hexidine (eller betadin) skrubning efterfulgt af alkoholen skylning gentaget 3 gange.
7. At fjerne huden over toppen af ​​kraniet lave et snit langs midterlinien fra bagsiden af ​​hovedet til øjnene.
8. Skrabe periosteum til kanterne af snittet med en skalpel. Hvis det er nødvendigt (afhængigt eksperimentel target), forsigtigt trække muskulaturen på bagsiden af ​​halsen med pincet, så musklen at rive langs hæfter til at minimere blødning. Anvendelse Gelfoam nedenunder hovedbunden væv for at minimere fugt og forhindrer huden i at bevæge sig hen over kraniet.
9. Tør kraniet overfladen med en bomuld spids applikator fugtet med isopropylalkohol for at forbedre visualiseringen af ​​kraniet vartegn.
10. Juster kraniet til standard stereotaxisk koordinater ^13. Indsæt en fin-point sonde i elektroden holderen, og fastgør den til stereotaktisk mikromanipulator. En tilspidset metalstang fungerer godt til dette formål (fig. 5).
11. Anvende det punkt at identificere Bregma (fig. 5A) og lambda (fig. 5B) på kraniet. Flyt sonden frem-og-tilbage mellem disse punkter, kontrollere, at den laterale-mediale koordinat for hver lokalitet adskiller sig ved ikke mere end 50 um. Flyt hovedet efter behov ved forsigtigt at løsne øre-barer, flytte hovedet og øre-barer sideværts, og stramme øre-barer.
12. Kontroller, at dorsal-ventral højde på hver lokalitet adskiller sig ved ikke mere end 50 um. Justere højden af ​​næse-klemme, som vil rotere i kraniet omkring aksen af ​​den Øre-stængerne,til niveau stigningen af ​​skallen, om nødvendigt. Højden af ​​den Øre-stangen kan også være nødvendigt at justere.
13. Brug et atlas ¹³ at identificere koordinaterne for målet af interesse (Fig. 5C) i forhold til Bregma. Markerer kraniet over målet (fx et "X" eller brug tusch til dot fire hjørner af en firkant), hvor en kraniotomi vil blive (fig. 5D).

3. Hoved-post og Ground Pin installation

1. Anvende etch gel til at rense skallen. Brug applikatoren til at skrubbe og sprede etch gel over overfladen (10 sek). Vask med vand og tørre helt. Anvendelse af primer til dental cement til kraniet overfladen ved hjælp af applikatoren. Fordel lim med nye applikator. Hærde klæbemidlet med en UV-lys-gun (1 cyklus).
2. Vælg en placering til jorden ben, der er distalt for målområdet. Forsigtigt bore et lille hul i kraniet ved spidsen af ​​en # 65 miniblade skalpel lige bred nok til den korte ende af jorden pi at komme ind og hvile på de meninges. Det formalede stift bør være orienteret således, at den peger bort fra Bregma og fremtiden hoved-stilling (fig. 6A).
3. Fastgør head-post til montering bar og blokere og tillægger mikromanipulator. Ved at flytte mikromanipulator i tre dimensioner, placering hoved-post i løbet af Bregma, bare røre kraniet (Fig. 6B). Bunden af hoved-post skal ligge fladt på kraniet.
4. Ved hjælp af dissektion prober, en lille mængde af dentalcement anvendelse omkring hovedet-stillingen og formalet stift (fig. 6C). Tryk på cement ned for at sikre god kontakt med kraniet. Bemærk: Brug ikke for meget cement eller det vil ikke hærde jævnt. Kurere cement med en UV-lys-gun (3-4 cyklusser fra flere forskellige vinkler).
5. Anvende det andet trin af cement og opbygge basen omkring hovedet-stillingen, og omfatter rillerne i hovedet-stillingen (fig. 6D).

4. Kraniotomi

1. Lokalisere kraniotomi referencemærket, som vil blive delvist skjult af primeren. Brug en # 65 skalpel for at markere en 3 mm x 3 mm firkant rundt om dette websted og anvende en dråbe af lidocain at reducere følsomheden og for at minimere blødning.
2. Lav flere point på hver side af pladsen (så mange som 10), pas på ikke at skære igennem knoglen og ind i hjernen (Fig. 7A).
3. Når knoglen flappen går løs, med spidsen af skalpellen at lirke op, hvilket efterlader dura mater intakt (fig. 7B).
4. Dæk med ben voks.

5. Efter kirurgi

1. Slukke gas anæstesi og fjerne musen fra den stereotaxiske ramme.
2. Brug en bomuld spids applikator til at anvende lidocainsalve rundt udsat hud for døve fornemmelse omkring såret. Brug en anden bomuld tippes applikator til at anvende Neosporin på udsat hud. Injicér ketoprofen (5 mg / kg IM eller IP baseret på præference for individuelle IACUC dyrlæger), somen post-kirurgi analgetikum. Mus vil generelt være op og bevæger sig inden for få minutter af gas ophør.
3. Placer musen i en varm bur og monitoren, indtil den er klar til at vende tilbage til stalde.
4. Dyret skal kontrolleres på mindst én gang om dagen efter, den har inddrevet fra kirurgi. Hold øje med tegn på dårlig kost og / eller drikke og sløv adfærd. Hvis smerten er mistanke tilvejebringe ketoprofen hver 24 timer (samme dosis som ved afslutningen af ​​post-kirurgi), indtil lindres. Lidocain kan påføres lokalt på såret, hvis dyret er ridser eller viser tegn på ubehag. Dyr typisk komme fra kirurgi uden komplikationer eller smerter.

6. Optagelse og Dye Injection

1. Vent mindst én dag efter hoved-postoperativt, før du bruger musen til optagelser.
2. Sted mus i en skum-fikseringsindretningen indstøbt musens krop. Mus er allerede blevet tilpasset til denne enhed, hvorved dens angst. Typisk tilpasning erat håndtere mus hver dag efter fravænning og omkring en uge før kirurgi og eksperimenter, den placeres i skummet indretningen i 1-5 minutter. Suspender anordning i stereotaktisk ramme (fig. 4).
3. Sikker hoved-post til monteringsstang, som nu fastgjort til stereotaktisk ramme (fig. 4).
4. Tilslutning til jorden ben med en ledning afsluttet med en stump 22-gauge kanyle spids.
5. Fjernelse af knogleaffald voks over kraniotomi. Fjern dura hvis det er nødvendigt at bruge spidsen af ​​en miniblade skalpel.
6. Kør elektrode til korrekt stereotaxic sted og starte optagelsen (fig. 8). For kun elektrofysiologiske optagelser, kan en række elektroder anvendes. Valget af elektroden er afhængig af placeringen og typen af ​​nødvendige optagelser. Valget af elektroden til den vågne muse optagelser vil være den samme som det forsker bruger på en bedøvet mus. For kombinerede elektrofysiologiske optagelser medfarvestof / tracer injektioner, en mikropipette elektrode anvendes ^10. Mikropipetten fyldes med farvestof / tracer valg, således at den kan iontoforetisk injiceres ved afslutningen af ​​elektrofysiologiske forsøg. Multibarrel elektroder kan også anvendes således, at farmakologiske manipulationer kan udføres. Den multibarrel elektroden er monteret på en enkelt optagelse mikropipette (fig. 8). Disse teknikker er standard i litteraturen og er ikke forskellig for bedøvede versus vågen optagelser.
7. Optagelser kan foretages i 4-5 timer i løbet af 3-4 dage i træk.
8. Ved afslutningen af ​​optagelse, kan farvestoffet / tracer injiceres. Fordi der ikke er nogen smerte receptorer i hjernen, den iontoforetiske injektion af farvestoffet eller sporstof i hjernen er usandsynligt at forårsage ubehag. Men når de elektrofysiologiske respons egenskaber region, hvor injektionen skal foretages, er karakteriseret, kan dyret være bedøvet med isofluran feller injektion. Dette ville fjerne eventuelle uønskede fornemmelser. Idet farvestoffet / tracer allerede er i mikropipetten, kan de aktive og jordledere skiftes fra den elektrofysiologiske optagelse opsætning til strømgeneratoren til iontophoretisk injicere farvestof / tracer. Brug en passende protokol for farvestoffet / sporstof i elektroden. Fjernes dyret fra headpost fastholdelse og kroppen tilbageholdenhed og vende tilbage til dets hjembur.
9. Ved slutningen af ​​eksperimentet følge passende protokol for eutanasi, og vævsbehandling at genvinde injektionsstedet og mærkning.

7. Repræsentative resultater

Vellykket installation af hoved-post tillader forsøgslederen at optage enkelt-og multiunit svar fra en ikke-bedøvede, vågen musen over flere dage. Fastholdelsessystemet muliggør stabil elektrofysiologiske optagelser af enkelte neuroner i hjernen. Fremragende isolering af enkelte enheder og stærke reaktioner to stimuli kan optages fra den samme hjernens struktur over flere dage, for eksempel i mus inferior colliculus (fig. 9A, dag et; figur 9B, dag to). Med et godt hoved-post installation, vil hver mus konsekvent linje til stereotaktisk apparat og musen stereotaksiske atlas, ¹³ resulterer i pålidelige lokalisering af særlig hjernekerner. Denne pålidelige lokalisering giver mulighed for injektion af farvestoffer og sporstoffer i specifikke strukturer, efter flere optagelser dage. For eksempel, for at vurdere nedad fremspring fra det auditive midthjernen til Auditory Brainstem biotinylerede dextran amin (visualiseret under anvendelse af diaminobenzidin som chromagen) kan injiceres i mus inferior colliculus (Fig. 10A) efter elektrofysiologisk identificere neuronale reaktioner egenskaber ved injektionsstedet (i fig. 10A blev en neuron optaget med en bedste frekvens på 51 kHz), og efter behandling af væv, ennterograde mærkning i den kontralaterale dorsale cochleare nucleus kan blevet visualiseret og afbildet (Fig. 10B). Mikrofotografier i højere opløsning kan rekvireres til at se anterogradely mærkede axoner og terminaler (Fig. 10C).

Figur 1.

Figur 2.

Figur 3.

Figur 4.

Figur 5.

Figur 7.

Figur 8.

Figur 9.

Figur 10.

Discussion

Fordelen af ​​hoved-post fastspændingssystem til elektrofysiologiske og neuroanatomiske eksperimenter i mus er, at forsøgene kan udføres med ikke-bedøvede, vågen mus, eliminerer potentiel respons forurening på grund af anæstetika. Endvidere op sættet kan anvendes over flere dage for at muliggøre en mere effektiv brug af dyr.

De fleste komponenter til hoved-post er til rådighed off-the-shelf. Kun hoved-stillingen og monteringsapparatur er skræddersyet, som begge er relativt ligetil at fremstille og kan genbruges. Hvis en maskine butik ikke er tilgængelig på en institution, kan forskeren sandsynligvis bruge http://www.emachineshop.com/ at fremstille de nødvendige komponenter.

Dygtige kirurgiske færdigheder er nødvendige. Kirurger skal være dygtige med fine kirurgiske teknikker, hvoraf nogle er bedst udføres under et mikroskop. Den operationen skal foregå under aseptiske forhold. Fjernelse af kraniet flappen er den mest følsomme punkt i proceduren. Ved omhyggeligt og forsigtigt at gøre flere scorer med en skalpel langs de 4 sider af rektanglet, mens du kigger gennem et operationsmikroskop, kan kraniet flap "poppet ud" med minimal blødning, forlader dura mater intakt. Kendskab til den underliggende vaskulatur er vigtig, for at yde et snit over et større blodkar medfører en risiko for uønsket blødning. Fordi vores forskning fokuserer på det auditive system, har vi undgået brug af øvelser for at udføre craniotomies for at minimere risikoen for knogle-udført indre øre traumer.

Det er vigtigt at få den anteriore-posteriore planet og i stereotaksiske linie forud for fastgørelse af hovedet-stillingen. Denne forholdsregel sikrer, at hovedet vil forblive niveau på tværs af eksperimentelle forsøg og letter placeringen af ​​hjernen loci ved hjælp af en hjerne atlas.

telt "> For optagelse, er det nyttigt at håndtere musen på en daglig basis for et par dage før operationen. bare få musen udsat for håndtering og tilbageholdenhed i skumindretning letter længere indspilningerne med meget mindre stress og bevægelse mus. Nøglen er at have musen passe stramt i skummet sandwich. Hvis dyret kan bevæge sig meget, det har en tendens til at kæmpe hele tiden. Hvis musen begynder at kæmpe, er det bedst at afslutte indspilningen og afhente igen næste dag. af mus resulterer i store biopotentialer i optagelser, der ikke fremkaldes af stimuli. Disse er generelt større amplitude, der virkningspotentialer og er intermitterende. bevægelse artefakter kan også frembringes ved hjælp af kontrolapparatet trådene rører dyret. Det er vigtigt at sikre, at der er ingen ledninger rører dyret. Generelt har denne teknik muligt for os at udføre flere undersøgelser auditive behandling og anatomi uden brug af anæstetika.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Etch gel for cleaning skull prior to dental cement	Henry Schein	101-5396	12/pk with 1.2 mL syringes
Primer for dental cement	Kerr Optibond	25881	8 mL bottle
Adhesive for dental cement	Kerr Optibond	25882	8 mL bottle
Applicators for dental cement	Kerr Optibond	24680	200/pk
Dental Cement	Charisma, Heraeus Kulzer	66000085	4gm Syringe Refill
Tungsten Rod (Ground Pin)	A-M Systems	717200	0.010" diameter
Economy UV Curing Light	Henry Schein	CU-80
Head-post	Built in-house
Mounting bar	Built in-house
Mounting block	Built in-house
Stereotaxic Frame	David Kopf Instruments	902
Mouse and Neonatal Rat Adaptor	Stoelting Co.	51625
Deltaphase Isothermal Pad	Braintree Scientific, Inc.	39DP