Summary
תסיסנית melanogaster היא מערכת גנטית התנהגותית מודל צייתן, שבו נעשה שימוש כדי להבין את הבסיס המולקולרי התאי של תהליכים ביולוגיים רבים חשובים יותר ממאה שנים 1. תסיסנית נוצלה היטב כדי לקבל תובנות לתוך הבסיס הגנטי של ההתנהגות במהירות הבזק.
Abstract
תסיסנית melanogaster, זבוב פירות, נעשה שימוש כדי לחקור מנגנונים מולקולריים של מגוון רחב של מחלות כגון סרטן, מחלות לב וכלי דם ומחלות נוירולוגיות שונות 1. יש לנו אופטימיזציה מבחני התנהגות פשוטים ויציב לקביעת תנועה הזחל, יכולת טיפוס מבוגר (assay RING), והתנהגויות החיזור של דרוזופילה. אלה מבחני התנהגות חלים נרחב בחקר התפקיד של גורמים גנטיים וסביבתיים על התנהגות זבוב. יכולת זחילה הזחל ניתן להשתמש באופן אמין לקביעת שינויים בשלבים מוקדמים של יכולות סריקה של הזחלים תסיסנית וגם לבחינת השפעת סמים או גנים מחלות אנושיות (ב זבובים מהונדס) על תנועה שלהם. Assay זחילה הזחל הופך רלוונטי יותר אם ביטוי או ביטול של הגן גורמת הקטלניות בשלבים גלמי או מבוגר, כמו זבובים אלו אינם שורדים לבגרות שם אחרת ניתן היה להעריך. זה בסיסיssay יכול לשמש גם בשילוב עם אור בהיר מתח או לבדוק תגובות התנהגותיות נוספות הזחלים תסיסנית. התנהגות החיזור נעשה שימוש נרחב לחקור הבסיס הגנטי של ההתנהגות המינית, והוא יכול לשמש גם כדי לבחון את פעילות ותיאום, כמו גם למידה וזיכרון. התנהגות תסיסנית החיזור כרוך בהחלפה של גירויים חושיים שונים, כולל חזותית, שמיעתית, אותות chemosensory בין זכרים ונקבות להוביל סדרה מורכבת של התנהגויות מוטוריות מאופיין היטב ושיאה הזדווגות מוצלחת. מבחני הבוגרים המסורתית טיפוס (geotaxis שליליים) הם עבודה מייגעת, אינטנסיבית, זמן רב, עם וריאציה משמעותי בין ניסויים שונים 2-4. מהיר איטרטיבי geotaxis שליליות (טבעת) assay 5 יש יתרונות רבים על פני פרוטוקולים בשימוש זמן רב יותר, מתן גישה התפוקה לשחזור, רגיש, גבוה לכמת של תנועה מבוגרים שלילית geotaxis בehaviors. ב assay הטבעת, גנוטיפים שונים או טיפולים תרופתיים, ניתן לבדוק בו זמנית באמצעות מספר רב של בעלי חיים, עם גישה תפוקה גבוהה מה שהופך אותו נוח יותר עבור ניסויים ההקרנה.
Protocol
א הזחל Assay זחילה
1. הזחלים אוסף
- הגדר את הבקבוק 8 גרם של זבובים (10-15 + 10-15 זכרים ונקבות).
- בואו הזבובים להטיל את הביצים למשך 24 שעות, אז ברור בקבוק של זבובים. (העברת המבוגרים לתוך בקבוק חדש וחזור לפי הצורך).
- דגירה בקבוק 3-4 ימים, או עד 3 זחלים instar גלויים.
- הוסף 50-100 מ"ל של סוכרוז 20% על בקבוק עם הזחלים ולתת לשבת במשך 20 דקות. הזחלים יצוף למעלה.
- איסוף הזחלים בעזרת פיפטה 25 מ"ל סרולוגית עם קצה מנותק, מקום בסל רשת.
- לשטוף את הזחלים בסל רשת פעמיים עם deionized H 2 O. הזחלים מוכנים כעת עבור הניסויים.
2. הזחלים לטיפול בתרופה
- השתמשו במברשת כדי להעביר את המספר הרצוי של הזחלים כדי מבחנה 5 מ"ל מכיל סוכרוז פתרון 5% + תרופה.
- בואו להאכיל זחלים במשך לפחות 15 דקות.
- יוצקים תחת טיפול תרופתי הזחלים לתוך סל רשת ולשטוף. עכשיו הם מוכנים לשימוש.
3. Assay של תנועה (מדידת המרחק הכולל נסע או קיר התכווצויות הגוף)
- השתמשו במברשת כדי להעביר הזחל הפרט:
- 15 ס"מ צלחת פטרי שמכילה agarose 2% (שפכו קודם לכן מותר להקשות) על נייר מילימטרי עם רשת 0.2 ס"מ 2.
- ספירת מספר קווי הרשת שחצו דקה 1.
- היטב בכלי זכוכית לנתיחה המכיל פתרון לדלל הדבק שמרים.
- ספירת הצירים תנועה פריסטלטית (קדמית מלאה לתנועה האחורי = 1 התכווצות) בתוך דקה אחת תוך התבוננות במיקרוסקופ לנתיחה.
- 15 ס"מ צלחת פטרי שמכילה agarose 2% (שפכו קודם לכן מותר להקשות) על נייר מילימטרי עם רשת 0.2 ס"מ 2.
- חזור על הפעולה עד המספרים הרצויים של הזחלים נספרו.
ב ראפיד איטרטיבי geotaxis שליליות (טבעת) פרוטוקול
Assay זה דה במקורscribed ידי Gargano ואח' 5.
- איסוף שעלו לאחרונה זבובים זכרים בוגרים תחת הרדמה קלה CO 2 ומקום למזון המכיל בקבוקון רגיל (או מזון + תרופות).
- לשמור על זבובים בטמפרטורת החדר (על הספסל. ~ 22 מעלות צלזיוס) במשך 2-3 ימים, כדי לאפשר התאוששות של CO 2 (וצבירת היציב רמות התרופה במידת הצורך).
- העברת כ -25 זבובים ללא anesthetizing כדי צלוחיות קלקר מוכנים.
- להרכיב צלוחיות עם זבובים לתוך המנגנון טבעת (איור 1).
- אפשר זבובים להסתגל לסביבה, באין מפריע, למשך 15-20 דקות.
- במהלך מצלמה דיגיטלית מקום הזמן ~ 1 מ 'מול המנגנון (על פלטפורמת אם יש צורך ליישר את מרכז העדשה בגובה אמצע של צלוחיות), להתמקד זום המצלמה על המנגנון, ולהגדיר טיימר ל 3.0 שניות.
- בזהירות לאחוז מכשיר טבעת עם יד שמאל כדי לא distUrb הזבובים, והכילו את השעון ביד ימין.
- חד לנצל את המנגנון על פני הספסל שלוש פעמים, להבטיח כי ברז זה מספיק קשה כדי להפיל את כל הזבובים אל החלק התחתון של צלוחיות את.
- בד בבד עם השלמת ברז 3, להפעיל את הטיימר 3 2.
- בשלוש שניות לצלם.
- לאפס את שעון העצר לדקה 1 ולהתחיל. במהלך תקופה זו לאפס את המצלמה ולהתמקד המנגנון, ולהגדיר ערוץ אחר של טיימר למשך שלוש שניות.
- אחרי דקה 1, חזור על שלבים 1.7-1.10
- לאחר סכום כולל של 5-6 ניסויים, להעלות תמונות למחשב ולהשתמש הצופה תמונה האהוב עליך לפתוח, וציון ממוצע קומה טיפס על כל בקבוקון.
- בביצוע ניתוחים סטטיסטיים על קבוצות שונות שלך המשווים את הגובה הממוצע טיפס.
ג החיזור Assay הזדווגות
- דבר ראשון בבוקר, נקה היטב לייצור בקבוקי flies לשמש.
- במהלך היום (כל 3-4 שעות), לאסוף גברים תמימים מינית שעלו לאחרונה ונקבות:
- מניחים גברים בנפרד צלוחיות או צינורות עם המדיום.
- מניחים 5-6 נקבות יחד לכל בקבוקון / צינור.
- לבודד את זבובים שנאספו על 25 מעלות צלזיוס מתחת לפנס שעה 12 / כהה במשך 5 ימים.
- מעבירים 1 נקבה החדרה של גלגל החיזור.
- העברת זכר אחד לתוך תא של גלגל החיזור.
- שימו לב זוג תחת מיקרוסקופ לנתיחה על הפעולה הבאים:
- האוריינטציה (את מכוונת כלפי זכרים ונקבה)
- הקשה (זכר ונקבה הברזים)
- השיר כנף (זכר מרחיב רוטט כנף אחת)
- ליקוק (מלקק את איבר המין הנשי גברים)
- קרלינג (זכר תלתלים הבטן שלה תחת עצמה)
- ניסיון הזדווגות (מתפתל פעילות בעת שניסה לעלות על הנקבה)
- שימו לב ל 10 דקות או עד להזדווגות מוצלחת, תוך ציון המועד שבו התנהגות זו מתרחשת (latency), את סך כל הזמן עוסקת בהתנהגות החיזור עד ההזדווגות (כדי לחשב את המדד חיזור), כמו גם את מספר הזוגות בהצלחה לבצע התנהגות מסוימת ( תדר). 100% של זוגות מסוג בר בדרך כלל להזדווג תוך 5 דקות.
- לחשב ראשי חיזור (CI) על ידי חלוקת משך הזמן החיזור חלקי הזמן הכולל עד ההזדווגות. עבור זוגות מסוג בר זה בדרך כלל נע בין 0.6-0.8.
ד נציג תוצאות
זחילה assay
סוג רגיל הזחל בר ינדדו ~ 3 ס"מ לדקה, ולהציג ~~~HEAD=NNS 40-50 קיר הגוף התכווצויות בתוך דקה אחת. פיתחנו לאחרונה מודל תסיסנית של טרשת FUS / TLS הקשור לרוחב amyotrophic המציגה פגם זחילה הזחל, תוחלת החיים נמוכה ומבוגרים טיפוס ליקוי 6. אנו ממוקדים ביטוי OF סוג פראי צורות משתנות של FUS / TLS לתאי העצב המוטוריים (OK-371-gal4 הנהג) וביצע assay זחילה הזחל. כפי שנראה להלן, זחלים מסוג בר לזחול עד 12 ס"מ, ואילו הביטוי של FUS סוג בר ירד היכולת לזחול הזחל של כ 6 ס"מ. בעלי חיים המבטאים R521C מחא גורמי מוטציה FUS / TLS להוכיח פגיעה חמורה מאוד בתנועת זחילה שלהם (איור 1), זוחל רק על 1 ס"מ לדקה.
Geotaxis שלילית טבעת assay
צעירים wild-type זבובים בוגרים צריך לטפס לגובה הממוצע של ~ 4-5 ס"מ בתקופה 3-2 (הזמן יכול להיות מותאם מ 3 שניות כדי להתאים זנים שונים או רמת הפעילות להגדיר גובה הממוצע שניתן על נתון להתאמץ / טיפול). זבובים שנותרו בתחתית מוקצים הערך 0. לא מומלץ להשתמש ביותר מ -25 זבובים בכל בקבוקון כי זה הופך להיות קשה לקבוע את המיקום של זבוב בנפרד למדוד גובה. לא זמין הפחתת רגישות o נצפתה במהירות של עד 6 משפטים רצופים במרווחים 1 דקה זה מזה, כי השתמשנו. זה קריטי, לא לעשות שימוש חוזר הבדיקה פוליסטירן בקבוקונים ב assay זה אחרי סטים הראשונים של הנתונים נאספים כי זבובים חדשים להציב לתוך צלוחיות בשימוש לא יטפס באותה מידה כמו צלוחיות טריים.
באיור 1. תוכנית ההתקנה של Assay הטבעת. המצלמה ממוקמת ~ 1 מ 'לפני מתקן המכיל זבובים של צלוחיות קלקר, להתמקד זום המצלמה על המנגנון, ולהגדיר טיימר ל -3.0 שניות.
באיור 2. נתונים מייצגים של assay זחילה הזחל באמצעות זבובים ectopically להביע כטב"מ FUS-WT, ו-כטב"מ FUS R521C תחת שליטה של נהג רכב נוירון (OK371-gal4).
class = "jove_content">
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
התנהגות תסיסנית מוסדר היטב על ידי גורמים גנטיים וסביבתיים. אנחנו, ואחרים, השתמשו בעבר את מבחני המתוארים כאן כדי לאסוף נתונים כדי לבחון גנים הקשורים לטוס התנהגויות למחלות ניווניות אנושיות המודל ב תסיסנית 5-19. עבור assay זחילה, בחירה זהירה של הזחלים 3 instar השלישי הוא שלב קריטי. אם בטיפול בתרופה, זה ייקח 10-15 דקות (או יותר בהתאם לסוג ואופי התרופה) כדי להשיג אפקט מקסימלי אם יש לו מסיסות טובה. לכן, אנו שגרתי להאכיל טס את התרופה במשך 15 דקות ולאחר מכן לחכות תוספת של 15 דקות לפני הבדיקה. חשוב, עם זאת, כדי לשמור על ריכוז התרופה בתמיסה, ופעמים חשיפה, בין קבוצות הטיפול זהה עבור השוואה מדויקת. מערכת העצבים המרכזית תרופות פעילים בדרך כלל יש השפעה מירבית לאורך זמן ~ 45 דקות. הזחלים יש לשטוף היטב לאחר הבחירה (או חפר האכלה) להסיר את האוכל זבובמותר התאקלם דקה 1 לפני תחילת assay זחילה. צלחת אגר יש לשמור בטמפרטורת החדר (~ 22 מעלות צלזיוס) במשך שעה, כמו טמפרטורה נמוכה יכולה להשפיע על יכולת זחילה הזחל. למרות assay זחילה הזחל יכול לספק מידע חשוב לגבי רמת הפעילות, זה לא מתאים לניתוח של גירעונות תיאום עדין. לכן, כפלטפורמה ההקרנה היא המתאימה ביותר עבור כרטיס 1 בחינת הגירעונות פעילות ברוטו.
ההתנהגות הבוגרת הכרוך בתיאום מוטוריקה עדינה היא חיזור והזדווגות. אופן פעולה זה נעשה שימוש כדי לבחון את ההיבטים של התנהגויות רלוונטיות מחלות אנושיות, והיא כרוכה בעיבוד החושי (חוש הריח, אקוסטית חזותית,) נוסף שליטה מוטורית עדינה 18. כאשר זכר ונקבה שם לב, הוא יוזם את טקס החיזור כי התקדמות בתחילת הסטריאוטיפ דפוס התנהגות עם אוריינטציה (מפנה כלפי ואת רודף נשים). זה מלווה wingsong, פליקיםז הקשה של genetalia נקבה, מסתלסל של הבטן כלפי נשים, ומסתיים בהזדווגות, אשר יכול להימשך כמה עשרות דקות 20-22. כי רבים מן ההיבטים של החיזור לערב רמזים חזותיים, בתנאי חושך לגרום לזילות של ביצועים ההזדווגות, ואת מבחני יש לבצע עם מספיק אור כדי זבובים יכולים לראות זה את זה. בהתאם לכך, לבן עיניים זבובים בדרך כלל יש ביצועים ירודים מאוד assay תיאר שלנו, הקוראים, מומלץ על תכנון ניסויים ניצול אותם עם פרוטוקול זה. אם טיפול זבובים עם התרופה, את התרופה לתוך המדיום הזבובים מבודדים על (למשל 1% סוכרוז agarose + 10% + תרופה במקום מזון רגיל בטיפול עם התרופה כדי למנוע הידרדרות אפשרית של התרופה על ידי מיקרואורגניזמים מזון). בדרך כלל הזבובים מבודדים לתוך צינורות 5 מ"ל הבדיקה כי יש 300-500 מ"ל של מזון בהם, מחובר עם כותנה. אל להרדים את הזבובים להעברת לגלגל החיזור. זה אניזה קריטי לשטוף את הגלגל ההזדווגות היטב בין משתמש ולהסיר כל שאריות פרומונים (מים חמים עם מעט סבון על alconox הלילה עם רועדת, ואז לשטוף עם רעד במשך כמה מינימום 48 שעות במים deionized, ושינויים רבים של מים) . שיקול נוסף בעת ביצוע assay אנו מתארים הוא מזג האוויר. אצל זבובי הניסיון שלנו לא לחזר אם יורד גשם או נראה כמו יירד גשם. הם מבצעים הכי טוב בימי שמש בהירים, ללא קשר אם במעבדה יש חלונות או לא. התיאוריה הנוכחית שלנו היא כי תופעה זו קשורה בלחץ אטמוספרי, אבל אנחנו לא חקרו את זה.
Assay המסורתית geotaxis שלילית מסתמך על מדידת כמה זבובים רבים לטפס מעל לגובה שנקבע מראש תוך 10 שניות (המתואר http://www.jove.com/details.php?id=2504 ). אנו מאמינים כי assay טבעת יש יתרונות מסוימים על פני assay המסורתית. אחת מהן היא לאhroughput, כמו 6 עצמאית משכפל ניתן למדוד בו זמנית לעומת 1 של assay רגיל, והמערכת בדרך כלל הוא ניתן להרחבה. אחרת היא הרגישות, כי הגובה הממוצע עלה בפרק זמן מוגדר הוא לכימות, ולא עובר / נכשל מספר על גובה מוחלט. באמצעות גישה זו, גירעונות עדינים יותר אפשר לראות. בשל רמת התפוקה, assay מתאימה יותר מאשר מסכי assay geotaxis המסורתית מייגע יותר שלילי. יתר על כן, Garagano et al. (2005) לתאר את שיטת הניקוד הממוחשבת שאם היה מועסק להגביר עוד יותר את התפוקה. השיקולים העיקריים assay זה הם, כי זוהי חובתו של הזבובים הם לא הרדים לפני הבדיקה, וכי צלוחיות טריים משמשים לאחר סדרה של ניסויים לפני שניתן קבוצה חדשה של זבובים נבדקים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין לנו מה למסור.
Acknowledgments
אנו רוצים להודות Astha Maltare להפקת הנתונים זוחלים הזחל. ברצוננו להודות לד"ר ניקולס Lanson הבן למתן את דבריו על כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי רוברט פקארד מרכז ALS באוניברסיטת ג'ונס הופקינס (כדי UBP) ו amyotrophic לרוחב טרשת האגודה (UBP) ו R01MH083689 מן המכון הלאומי לבריאות הנפש (CDN).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| 6 oz Drosophila bottle | Genesee Scientific | 32-130 | |
| Paint Brush (#1) | Ted Pella, Inc. | 11859 | |
| Cornmeal | Fisher Scientific | NC9109741 | |
| Agar | Genesee Scientific | 66-104 | |
| Molasses | Fisher Scientific | NC9349176 | |
| Propionic acid | Acros Organics | 14930-0010 | |
| Tegosept | Apex | 20-258 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-4 | |
| Yeast | Genesee Scientific | 62-107 |
References
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol. Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
- Feany, M. B., Bender, W. W. A Drosophila model of Parkinson's disease. Nature Mar. 23 (6776), 394-398 (2000).
- Auluck, P. K., Bonini, N. M. Pharmacological prevention of Parkinson disease in Drosophila. Nat. Med. 8 (11), 1185-1186 (2000).
- Whitworth, A. J., Theodore, D. A., Greene, J. C., Benes, H., Wes, P. D., Pallanck, L. J. Increased glutathione Stransferase activity rescues dopaminergic neuron loss in a Drosophila model of Parkinson's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (22), 8024-8029 (2005).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp. Gerontol. 40 (5), 386-395 (2005).
- Lanson, N. A., Maltare, A., King, H., Smith, R., Kim, J. H., Taylor, J. P., Lloyd, T. E., Pandey, U. B. A Drosophila model of FUS-related neurodegeneration reveals genetic interaction between FUS and TDP-43. Hum. Mol. Genet. 20 (13), 2510-2523 (2011).
- Batlevi, Y., Martin, D. N., Pandey, U. B., Simon, C. R., Powers, C. M., Taylor, J. P., Baehrecke, E. H. Dynein light chain 1 is required for autophagy, protein clearance, and cell death in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (2), 742-747 (2010).
- Sang, T. K., Chang, H. Y., Lawless, G. M., Ratnaparkhi, A., Mee, L., Ackerson, L. C., Maidment, N. T., Krantz, D. E., Jackson, G. R. A Drosophila model of mutant human parkin-induced toxicity demonstrates selective loss of dopaminergic neurons and dependence on cellular dopamine. J. Neurosci. 27 (5), 981-992 (2007).
- Stacey, S. M., Muraro, N. I., Peco, E., Labbé, A., Thomas, G. B., Baines, R. A., van Meyel, D. J. Drosophila glial glutamate transporter Eaat1 is regulated by fringe-mediated notch signaling and is essential for larval locomotion. J. Neurosci. 30 (43), 14446-14457 (2010).
- Repnikova, E., Koles, K., Nakamura, M., Pitts, J., Li, H., Ambavane, A., Zoran, M. J., Panin, V. M. Sialyltransferase regulates nervous system function in Drosophila. J. Neurosci. 30 (18), 6466-6476 (2010).
- Repnikova, E., Koles, K., Nakamura, M., Pitts, J., Li, H., Ambavane, A., Zoran, M. J., Panin, V. M. Sialyltransferase regulates nervous system function in Drosophila. J. Neurosci. 30 (18), 6466-6476 (2010).
- Nedelsky, N. B., Pennuto, M., Smith, R. B., Palazzolo, I., Moore, J., Nie, Z., Neale, G., Taylor, J. P. Native functions of the androgen receptor are essential to pathogenesis in a Drosophila model of spinobulbar muscular atrophy. Neuron. 67 (6), 936-952 (2010).
- Lorenzo, D. N., Li, M. G., Mische, S. E., Armbrust, K. R., Ranum, L. P., Hays, T. S. Spectrin mutations that cause spinocerebellar ataxia type 5 impair axonal transport and induce neurodegeneration in Drosophila. J. Cell Biol. 189 (1), 143-158 (2010).
- Wang, J. W., Brent, J. R., Tomlinson, A., Shneider, N. A., McCabe, B. D. The ALS-associated proteins FUS and TDP-43 function together to affect Drosophila locomotion and life span. J. Clin. Invest. , (2011).
- Choi, J. K., Jeon, Y. C., Lee, D. W., Oh, J. M., Lee, H. P., Jeong, B. H., Carp, R. I., Koh, Y. H., Kim, Y. S. A Drosophila model of GSS syndrome suggests defects in active zones are responsible for pathogenesis of GSS syndrome. Hum. Mol. Genet. 19 (22), 4474-4489 (2010).
- Ruan, H., Wu, C. F. Social interaction-mediated lifespan extension of Drosophila Cu/Zn superoxide dismutase mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (21), (2008).
- Slawson, J. B., Kim, E. Z., Griffith, L. C. High-resolution video tracking of locomotion in adult Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (24), (2009).
- Becnel, J., Johnson, O., Luo, J., Nässel, D. R., Nichols, C. D. The serotonin 5-HT7 Dro receptor is expressed in the brain of Drosophila, and is essential for normal courtship and mating. PLoS One. 6 (6), e20800 (2011).
- Johnson, O., Becnel, J., Nichols, C. D. Serotonin 5-HT(2) and 5-HT(1A)-like receptors differentially modulate aggressive behaviors in Drosophila melanoga- ster. Neuroscience. 158 (2), 1292-1300 (2009).
- Bastock, M., Manning, A.
- Greenspan, R. J., Ferveur, J. F.
- Villella, A., Hall, J. C. Neurogenetics of courtship and mating in Drosophila. Adv. Genet. 62, 67-184 (2008).
