Summary
تقنية amperometric يقيس الإفراج الدوبامين من خلية واحدة عن طريق الكشف عن الأكسدة الحالية التي تنتجها أكسدة الدوبامين عفوية. في وقت واحد المشبك الجهد ومنهجية amperometry الكشف عن العلاقة بين الآلية "النشاط" الشاملة لنقل الدوبامين والدور التنظيمي لهذا النشاط على النقل العكسي للدوبامين.
Abstract
بعد صدوره في الدوبامين، المشقوق متشابك تمارس خصائصه البيولوجية عن طريق أهدافه قبل وبعد المشبكي-1. يتم إنهاء إشارة الدوبامين عن طريق الانتشار 2-3، الإنزيمات خارج الخلية 4، ونقل الغشاء 5. ونقل الدوبامين، وتقع في الشق شبه متشابك من الخلايا العصبية الدوبامين مسح صدر الأمينات من خلال تدفق الدوبامين الداخل (امتصاص). يمكن للنقل الدوبامين أيضا العمل في الاتجاه المعاكس للافراج عن الأمينات من الداخل الى الخارج في عملية تسمى النقل إلى الخارج أو هروب رأس المال من الدوبامين 5. أكثر من 20 عاما وذكرت سولزر آخرون على نقل الدوبامين يمكن أن تعمل في وضعين من النشاط: إلى الأمام (امتصاص) والعكس (هروب رأس المال) 5. يمكن للناقل عصبي صدر عن طريق هروب رأس المال من خلال نقل نقل كمية كبيرة من الدوبامين إلى الفضاء خارج الخلية، ولقد ثبت أن تلعب دورا رئيسيا في تنظيم الدوبامين خارج الخلية حomeostasis 6. نحن هنا تصف كيف يمكن استخدام المشبك التصحيح في وقت واحد وتسجيل amperometry لقياس الدوبامين صدر عبر آلية هروب رأس المال للقرار ميلي ثانية واحدة عندما الوقت يتم التحكم إمكانية الغشاء. لهذا، يتم قياس كامل الخلية الحالية والأكسدة (amperometric) إشارات في وقت واحد باستخدام مكبر للصوت Axopatch 200B (الأجهزة الجزيئية، مع مجموعة قليلة مرشح تمرير بسل في 1،000 هرتز لخلية كاملة تسجيل الحالي). لتوصيل amperometry تسجيل القطب الكهربائي لألياف الكربون مكبر للصوت الثاني (Axopatch 200B) ويتم وضعها بالقرب من غشاء البلازما والذي عقد في +700 بالسيارات. يمكن تسجيل خلية كاملة والأكسدة (amperometric) التيارات ويمكن أن تتولد العلاقة الحالية ذات الجهد باستخدام بروتوكول خطوة الجهد. على عكس المعتاد المعايرة وamperometric، الأمر الذي يتطلب التحول إلى التركيز، وتفيد التقارير الحالية مباشرة دون النظر في 7 حجم فعالة. وهكذا، فإن البيانات الناتجةتمثل الحد الأدنى لهروب رأس المال الدوبامين بسبب فقدان بعض الارسال في حل الجزء الأكبر.
Protocol
1. تجهيزات ومعدات
- جبل قفص فاراداي على رأس جدول الاهتزاز المضادة (TMI) لتقليل الضوضاء الخلفية.
- المشبك التصحيح في وقت واحد amperometry نظام التسجيل يتطلب مجهر مقلوب مع عدسات DIC ممتازة وطويلة المسافة عدسة العمل. الاتصال المجهر منارة لبطارية السيارة. وهذا مصدر للضوء لنظام DC مزيد من الانخفاض في الضوضاء الكهربائية.
- الهيدروليكية micromanipulators (Siskiyou) مزيد من الضوضاء انخفاض. في التكوين لدينا، ونحن نستخدم متلاعب الحق الوفاض لتسجيل خلية كاملة، واليسار سلم لamperometry.
2. إعداد أقطاب للتسجيل
- سحب أسلاك التصحيح باستخدام ماصات الكوارتز على مجتذب P-2000 (سوتر). سحب لدينا تستغرق حوالي 5 ثانية، مع دورات الحرارة اثنين. وقد أدى هذا الوقت الحرارة في المقاومة ثابت (3-4 MΩ) في منطقتنا كلها ماصات التصحيح الخلية.
- ملء مع القطبماصة حل يحتوي على 2 ملم والدوبامين تركيبها على تتلاعب الحق. التفاف الحاوية عقد ماصة تحتوي على حل DA مع رقائق الألومنيوم. تبقي على الجليد. الدوبامين هو قابل للأكسدة. والحفاظ على الحل على الجليد، محمية من الضوء خفض معدل أكسدة الدوبامين.
- إزالة بلطف (داغان) ProCFE الكربون ضوضاء منخفضة الألياف القطب amperometric من مربع التخزين، وملء مع الزئبق، وجبل على محول amperometric (كما هو مبين في الشكل 1)، ثم جبل على maniupulator الحق. حماية غيض من ألياف الكربون من التلف من خلال عقد نهاية بكثير من ألياف الكربون. تفقد الكهربائي مع مختبر المجهر للتأكد من الطرف نظيفة وسليمة.
- فحص سلامة من القطب amperometric عن طريق وضع القطب الكهربائي في طبق بتري أسفل الزجاج تحتوي على حل خارجي. تسجيل خط الأساس الحالية في غياب الدوبامين. إضافة 10 ميكرولتر من حل DA 1mm إلى الطبق. وخير إعادة القطب amperometricالحبال زيادة في الأكسدة الحالية. كرر هذه الخطوة في بداية ونهاية كل تجربة للتأكد من القطب amperometric يعمل بشكل صحيح.
3. إعداد الثقافة الابتدائية العصبية الدوبامين من الخلايا العصبية أو خلايا المهندسة للتعبير عن نقل الدوبامين في أسفل الزجاج أطباق بتري
- يغسل بلطف الخلايا أو الخلايا العصبية الدوبامين ثلاث مرات بمحلول الخارجية الدافئة.
- تحميل طبق بتري الزجاج السفلي على خشبة المسرح المجهر.
4. تصور الخلية وإجراء التجربة
- العثور على نقطة اتصال لتصور الصحيح بوضوح الخلايا. ضغطا إيجابيا على القطب التصحيح. ثم، وجلب بلطف كل من الأقطاب الكهربائية أسفل إلى الحل، وعلى مقربة من الخلية.
- وضع القطب الكهربائي amperometric بجوار الخلية (على الجانب الأيسر)، والقطب التصحيح على اليمين.
- تحقيق ختم gigaohm على الخلية مع القطب التصحيح. تمزق الختم مع الشفط لتحقيق كامل التكوين الخلية.
- السماح 5-8 دقيقة لغسيل الكلى من الحل الداخلي التي تحتوي على الدوبامين في الخلية.
- استخدام الجهد المطلوب أو خطوة بروتوكول المنحدر. الحصول على البيانات في وقت واحد من كل من ماصة التصحيح والقطب amperometric لقياس التيارات خلية كاملة وعكس نقل الدوبامين من خلال نقل الدوبامين بينما يتم التحكم في غشاء المحتملة عن طريق ماصة التصحيح.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يمكن الجمع بين المشبك التصحيح مع amperometry قياس الجهد التي تعتمد على DAT بوساطة DA هروب رأس المال. الشكل 2A يظهر التكوين ممثل التجريبية وتسجيل هروب رأس المال DA DAT بوساطة عندما فرضت الوسط بين الخلايا وإمكانية الغشاء بواسطة ماصة التصحيح خلية كاملة. باستخدام هذه التقنية، معربا عن الخلايا YFP-DAT البروتينات هي الجهد فرضت مع ماصة التصحيح خلية كامل بينما يتم وضع القطب الكهربائي على amperometric غشاء البلازما (الشكل 2A). يتم تعبئة القطب خلية كاملة مع حل ماصة تحتوي على 2 ملي DA. يقام القطب amperometric لمس غشاء البلازما في بالسيارات +700، إمكانية أكبر من إمكانات الأكسدة من DA. يتم تسجيل DAT بوساطة التيارات (خلية كاملة-2C و 2D الشكل amperometric-الشكل) من خلال تكثيف ماصة خلية كاملة إلى الجهد غشاء بين -60 والمتوسط من المحتمل +100 عقد بالسيارات -40 (الشكل 2B الشكل 2D) في التيارات amperometric يتوافق مع تدفق نحو الخارج من DA. تحريك ألياف الكربون بعيدا عن التصحيح يؤدي التأكسدي للاستجابة تصبح أصغر وأبطأ. كما هو متوقع لأكسدة DA، استجابة الأكسدة يقلل عندما يتم تقليل الجهد ألياف الكربون ل+300 بالسيارات وسوف تختفي كليا على خفض آخر. الشكل 2E-2F تمثل التسجيلات المقبول وغير المقبول. 2E الشكل هو مثال على ضيق GΩ خلية كاملة وختم المقابلة إشارة amperometric. الشكل 2F تمثيلاTS على راشح خلية كاملة التصحيح. تسجيل المقابلة amperometric يقيس DA تسربت.
الشكل 1. إعداد وتجميع القطب amperometric. إزالة بلطف ProCFE الكربون ضوضاء منخفضة الألياف القطب amperometric من مربع التخزين، وملء مع الزئبق. إعداد محول من خيوط الفضة في السلك التصحيح المشبك حامل، والخيط ثم المحول على التصحيح المشبك وجبل حامل بلطف القطب amperometric. يجب غيض من ألياف الكربون لا تلمس أي شيء.
الشكل 2. ممثل تسجيل خلية كاملة وamperometric في الفولتية متعددة عند ماصة التصحيح في خلية كاملة التكوين. (A) كارتون توضح التكوين التجريبية.والجهد الخلايا معربا عن نقل الدوبامين فرضت مع ماصة التصحيح خلية كاملة بينما وضعت بالقرب من إلكترود amperometric غشاء الخلية. أكسدة نتائج DA في تيار amperometric إيجابية. (B) توضيحات من الجهد المشبك الموجي البروتوكول. (C) DAT بوساطة التيارات التي سجلتها يخطو الجهد غشاء بين -60 و +100 بالسيارات من المحتمل عقد بالسيارات -40 مع ماصة خلية كاملة. الحل الوارد ماصة 2 ملي الدوبامين، كما هو موضح سابقا 7-9. (D) اكتسبت الحالي amperometric في وقت واحد مع التيار خلية كاملة ممثلة في لوحة C (أعلاه). في بداية الخطوة الجهد، لالفولتية أعلى من +20 بالسيارات، سجلات القطب amperometric أكسدة الحالي (إيجابية) زيادة أنه خلال كامل مدة الخطوة الجهد. (E) و (F) هي ممثل المقبول وغير المقبول خلية كاملة التجارب المشبك التصحيح، على التوالي. 2E الشكل هو مثال ث GΩ ضيقثقب الخلايا وختم المقابلة إشارة amperometric. الشكل 2F يمثل راشح خلية كاملة التصحيح. وصلت إلى المقاومة ختم نطاق MΩ بدلا من GΩ قبل أو بعد اقتحام الخلية لتحقيق خلية كاملة واسطة. تسجيل المقابلة amperomtric يقيس DA تسربت. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في وقت واحد والجهد المشبك amperometry والفوائد التالية. جميع أنواع الخلايا يمكن الوصول إليها، ويمكن استخدامها للتسجيل. تحديد الخلايا العصبية أو حيث تتم التسجيلات هو بسيط ومباشر. على وجه الخصوص، إذا تم fluorescently المسمى الخلية عن طريق إضافة علامة الفلورية للبروتين من الفائدة يمكن بسهولة تحديد المجرب الخلية الهدف أو الخلايا العصبية. التكوين التجريبية يسمح للرقابة موحدة وتسليم من وكلاء الدوائية إما عن طريق ماصة التصحيح، أو عن طريق إضافة هذه العوامل في حل حمام 10. المشبك التصحيح في وقت واحد يسمح تقنية amperometry التحقيق في دور قنوات مختلفة ونقل على الافراج عن الارسال لقرار قابل للأكسدة الوقت ميلي ثانية واحدة في حين أن الغشاء يتم التحكم المحتملة. لا يمكن نفس المعلومات يمكن الحصول عليها من خلال وسائل البيوكيميائية 8. واحد من الجوانب الفريدة لهذا approacح هو أنه يتيح التلاعب في البيئة داخل الخلايا بواسطة غسيل الكلى عن طريق ماصة التصحيح 7،11. ومع ذلك، هذه التقنية لديه عيب والقطب amperometric يمكن الكشف عن أجهزة الإرسال فقط قابل للأكسدة. وبالإضافة إلى ذلك، حساسية القطب يقلل amperometric في وجود كبير الإصدار، القاعدية عفوية من مركب قابل للأكسدة، وبالتالي فإن قياس الإفراج بعد، على سبيل المثال، من تحميلها مسبقا مركب قابل للأكسدة التي يتم تحريرها بشكل عفوي يمكن أن يؤدي إلى انخفاض في الأكسدة الحالية. والعيب الرئيسي لهذا الأسلوب هو شرط الخبرة التقنية ومعدات باهظة الثمن.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر الدكتور Sanika شيروا لمراجعة نقدية لهذه المخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (DA026947، DA021471، وNS071122).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Anti-vibration table w/faraday cage | Technical Manufacturing Corporation | 63-500 series | we use model 63-543 |
| Inverted microscope Nikon TE-2000 | Nikon | discontinued | now Eclipse Ti |
| Two low noise amplifiers axopatch 200b | Molecular Devices | 800-635-5577 | |
| 1-CV 203 BU headstage | Molecular Devices | 800-635-5578 | |
| 1-HL-U pipette holder | Molecular Devices | 800-635-5579 | |
| Digidata 1440A A/D converter | Molecular Devices | 800-635-5580 | |
| Two manipulators Siskyou, left and right handed | Siskiyou | MX6600R MX6600L | 877-313-6418 |
| Laser pipette puller | Sutter Instruments | P-2000 | 888-883-0128 |
| Low noise carbon fiber amperometric electrode | ProCFE | www.dagan.com | |
| Low noise quartz pipette | Sutter Instruments | QF100-70-7.5 | 888-883-0128 |
| 12-volt car battery | widely available | ||
| Car battery charger | widely available | ||
| Reagent | |||
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Dextrose | Sigma | G7528 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma | M2643 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma | P5655 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2∙2H20) | Sigma | 223506 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2∙6H20) | Sigma | M2670 | |
| EGTA | Sigma | E0396 | |
References
- Michael, A. C., Ikeda, M., Justice, J. B. Jr Mechanisms contributing to the recovery of striatal releasable dopamine following MFB stimulation. Brain Res. 421, 325-335 (1987).
- Gonon, F. Prolonged and extrasynaptic excitatory action of dopamine mediated by D1 receptors in the rat striatum in vivo. J. Neurosci. 17, 5972-5978 (1997).
- Sulzer, D., Pothos, E. N. Regulation of quantal size by presynaptic mechanisms. Rev. Neurosci. 11, 159-212 (2000).
- Napolitano, A., Cesura, A. M., Da Prada, M. The role of monoamine oxidase and catechol O-methyltransferase in dopaminergic neurotransmission. J. Neural. Transm. Suppl. 45, 35-45 (1995).
- Sulzer, D., Maidment, N. T., Rayport, S. Amphetamine and other weak bases act to promote reverse transport of dopamine in ventral midbrain neurons. J. Neurochem. 60, 527-535 (1993).
- Salahpour, A., et al. Increased amphetamine-induced hyperactivity and reward in mice overexpressing the dopamine transporter. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4405-4410 (2008).
- Khoshbouei, H., Wang, H., Lechleiter, J. D., Javitch, J. A., Galli, A. Amphetamine-induced dopamine efflux. A voltage-sensitive and intracellular Na+-dependent mechanism. J. Biol. Chem. 278, 12070-12077 (2003).
- Goodwin, J. S., et al. Amphetamine and methamphetamine differentially affect dopamine transporters in vitro and in. , 284-2978 (2009).
- Kahlig, K. M., et al. Amphetamine induces dopamine efflux through a dopamine transporter channel. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3495-3500 (2005).
- Swant, J., Chirwa, S., Stanwood, G., Khoshbouei, H. Methamphetamine reduces LTP and increases baseline synaptic transmission in the CA1 region of mouse hippocampus. PLoS One. 5, e11382 (2010).
- Gnegy, M. E., et al. Intracellular Ca2+ regulates amphetamine-induced dopamine efflux and currents mediated by the human dopamine transporter. Mol. Pharmacol. 66, 137-143 (2004).
