Summary
Der amperometrische Technik misst Dopamin-Freisetzung aus einer einzelnen Zelle durch Detektieren der aktuellen durch spontane oxidative Dopamin Oxidation produziert. Gleichzeitige Voltage-Clamp und Amperometrie Methodik zeigen die mechanistische Beziehung zwischen der Gesamt-Wertung "Aktivität" Dopamin-Transporter und die regulatorische Rolle dieser Aktivität auf den Rücktransport von Dopamin.
Abstract
Nach seiner Freilassung in den synaptischen Spalt, Dopamin übt seine biologischen Eigenschaften über seine Pre-und Post-synaptischen Ziele 1. Die Dopamin-Signal wird durch Diffusion 2-3, extrazelluläre Enzyme 4 und Membrantransportern 5 beendet. Die Dopamin-Transporter in der peri-synaptischen Spalt von Dopamin-Neuronen angeordnet löscht die freigesetzten Amine durch eine nach innen Dopamin Flusses (Uptake). Die Dopamin-Transporter kann auch in umgekehrter Richtung arbeiten, um Amine von innen nach außen freigeben in einem Prozess namens Abtransport oder Efflux von Dopamin 5. . Mehr als 20 Jahren Sulzer et al berichtete die Dopamin-Transporter kann in zwei Modi der Tätigkeit zu betreiben: forward (Aufnahme) und rückwärts (Efflux) 5. Der Neurotransmitter über Efflux durch den Transporteur freigesetzt werden eine große Menge an Dopamin in den extrazellulären Raum bewegen, und hat gezeigt, dass eine große regulatorische Rolle der extrazellulären Dopamin h spielenomeostasis 6. Hier beschreiben wir, wie die gleichzeitige Patch-Clamp-und Amperometrie Aufzeichnung verwendet werden, um veröffentlicht Dopamin über den Effluxmechanismen mit Millisekunden Zeitauflösung, wenn das Membranpotential gesteuert wird messen. Hierzu werden Ganzzell-Strom und oxidative (amperometrisch) Signale gleichzeitig unter Verwendung eines Axopatch 200B Verstärkers (Molecular Devices, mit einer Tiefpaß-Bessel-Filter Satz bei 1000 Hz für Ganzzell-Strom-Aufzeichnung) gemessen. Für Amperometrie Aufzeichnen eines Kohlenstofffaser-Elektrode ist mit einem zweiten Verstärker (Axopatch 200B) verbunden ist und angrenzend und in die Plasmamembran bei +700 mV gehalten. Die Ganzzell-und oxidativen (amperometrische) Ströme können aufgezeichnet werden und die Strom-Spannungs-Beziehung kann mit Hilfe einer Spannung Schritt-Protokoll. Im Gegensatz zu der üblichen amperometrischen Kalibrierung, die Umwandlung in Konzentration erfordert, wird der Strom direkt ohne Berücksichtigung des effektiven Volumens 7 berichtet. Somit werden die resultierenden Datenstellen eine untere Grenze zu Dopamin Efflux weil einige Sender zu dem Schüttgut-Lösung verloren geht.
Protocol
Ein. Ausstattung und Zubehör
- Montieren Sie einen Faraday-Käfig auf dem Anti-Vibrations-Tabelle (TMI), um die Hintergrundgeräusche zu verringern.
- Die gleichzeitige Patch-Clamp-Amperometrie Aufzeichnungssystem erfordert eine inverse Mikroskop mit exzellenter DIC Optik und einem langen Arbeitstag Abstand Linse. Schließen Sie das Mikroskop Leuchtturm an eine Autobatterie. Dieser DC-Lichtquelle für das System weiter sinken die elektrisches Rauschen.
- Hydraulische Mikromanipulatoren (Siskiyou) weiter den Geräuschpegel zu senken. In unserer Konfiguration verwenden wir einen Rechtshänder Manipulator für die gesamte Zelle Aufnahme, und die linke für Amperometrie übergeben.
2. Bereiten Elektroden für die Aufnahme
- Ziehen Patch-Elektroden unter Verwendung von Quarz Pipetten auf einem P-2000 Ziehvorrichtung (Sutter). Unser Zug dauert ca. 5 sec, mit zwei Wärmezyklen. Diese Wärme Zeit in konstanten Widerstand (3-4 MOhm) in unserem ganzen Zelle Patch-Pipetten geführt.
- Füllen Sie die Elektrode mit demPipette Lösung mit 2 mM Dopamin und montieren Sie ihn auf der rechten Manipulator. Wickeln Sie den Behälter mit der Pipette Lösung DA mit Aluminiumfolie. Halten Sie auf dem Eis. Dopamin ist oxidierbare. Halten Sie die Lösung auf Eis, vor Licht geschützt verringert die Oxidation von Dopamin.
- Entfernen Sie vorsichtig eine ProCFE (Dagan) geräuscharm Kohlefaser amperometrischen Elektrode aus der Aufbewahrungsbox, füllen mit Quecksilber, mount auf die amperometrische Adapter (wie in Abbildung 1 dargestellt), und montieren Sie auf der rechten maniupulator. Schutz der Spitze der Kohlenstoff-Faser von Schäden durch Halten des anderen Ende des Kohlenstofffaser. Überprüfen Sie die Elektrode mit einem Labor-Mikroskop, um sicherzustellen, die Spitze ist sauber und intakt.
- Untersuchen der Integrität der amperometrischen Elektrode, indem die Elektrode in einem Glasboden Petrischale mit externen Lösung. Aufzeichnen einer Basislinienstrom in Abwesenheit von Dopamin. Fügen Sie 10 ul einer 1mM DA Lösung für das Gericht. Eine gute amperometrischen Elektrode reKorde eine Erhöhung des oxidativen Strom. Wiederholen Sie diesen Schritt am Anfang und am Ende jedes Experiments, um sicherzustellen, das amperometrischen Elektrode richtig funktioniert.
3. Bereiten Sie den primären neuronalen Kultur der Dopamin-Neuronen oder Zellen Entwickelt, um Dopamin Transporter in Glass Bottom Petrischalen Express
- Vorsichtig waschen die Zellen oder Dopamin-Neuronen dreimal mit warmem externe Lösung.
- Montieren Sie den Glasboden Petrischale auf den Mikroskoptisch.
4. Visualisieren Cell und Führen Experiment
- Finden Sie die richtige Anlaufstelle, klar zu visualisieren die Zellen. Platzieren positiven Druck auf die Flächenelektrode. Dann sanft bringen beide Elektroden nach unten in der Lösung und in der Nähe der Zelle.
- Positionieren des amperometrischen Elektrode neben der Zelle (auf der linken Seite), und der Patch-Elektrode auf der rechten Seite.
- Erreichen eine Gigaohm Dichtung auf der Zelle mit dem Patch-Elektrode. Rupture die Dichtung mit Absaugenzu erreichen Ganzzellkonfiguration.
- Lassen Sie 5-8 min für die Dialyse der internen Lösung mit Dopamin in die Zelle.
- Verwenden gewünschte Spannung Schritt oder Rampe Protokoll. Gleichzeitig erwerben Daten sowohl aus der Patch-Pipette und der amperometrischen Elektrode ganze Zelle Ströme messen und Rücktransport von Dopamin durch die Dopamin-Transporter während die Membran Potential über die Patch-Pipette gesteuert wird.
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Representative Results
Kombinierte Patch Clamp mit Amperometrie messen kann spannungsabhängigen DAT-vermittelte DA Efflux. 2A zeigt eine repräsentative experimentellen Konfiguration und Aufzeichnung der DAT-vermittelte DA Efflux wenn der intrazellulären Milieu und das Membranpotential durch ein Whole-Cell-Patch-Pipette eingespannt sind. Mit dieser Technik sind Zellen exprimieren YFP-DAT Proteine spannungsgesteuerten eingespannt mit einem Ganzzell Patch-Pipette, während eine amperometrische Elektrode auf der Plasmamembran (2A) gelegt wird. Die ganze Zelle Elektrode mit einer Pipette, enthaltend 2 mM DA gefüllt. Die amperometrischen Elektrode Berühren der Plasma-Membran bei 700 mV, ein Potential größer als das Redoxpotential von DA gehalten. DAT-vermittelten Ströme (whole-cell-2C und amperometrische-2D) werden durch Abstufung der Ganzzell-Pipette auf eine Membran Spannung zwischen -60 und +100 mV von einem Haltepotential von -40 mV (2B aufgezeichnete 2D) in den amperometrischen Ströme entspricht einer passiven Fluß von DA. Bewegen der Kohlenstoff-Faser vom Patch bewirkt die oxidative Reaktion auf kleiner werden und langsamer. Wie für DA Oxidation erwartet nimmt die oxidative Reaktion, wenn die Kohlenstofffaser Spannung 300 mV verringert ist und vollständig verschwinden auf weitere Reduzierung. 2E-2F sind repräsentativ für zulässige und unzulässige Aufnahmen. 2E ist ein Beispiel eines engen G &OHgr; whole-cell Dichtung und die entsprechende amperometrische Signal. 2F Vertreterts eine undichte whole-cell Patch. Die entsprechende amperometrische Aufnahme misst durchgesickert DA.
Abbildung 1. Vorbereitung und Montage von amperometrischen Elektrode. Entfernen Sie vorsichtig eine ProCFE geräuscharm Kohlefaser amperometrischen Elektrode aus der Aufbewahrungsbox, mit Quecksilber zu füllen. Bereiten Sie den Adapter durch Einfädeln der Silberdraht in den Patch-Clamp-Halter, fädeln Sie dann den Adapter auf die Patch-Clamp-Halterung und sanft montieren amperometrischen Elektrode. Die Spitze des Kohlefaser sollten nichts anfassen.
Abbildung 2. Vertreter whole-cell und amperometrische Aufnahme in mehrere Spannungen, wenn der Patch-Pipette in whole-cell-Konfiguration ist. (A) Cartoon Darstellung der experimentellen Konfiguration.Zellen, die Dopamin-Transporter wurden geklemmt mit einer whole-cell Patch-Pipette, während ein amperometrischen Elektrode nahe der Zellmembran platziert wurde. Die Oxidation von DA führt zu einer positiven amperometrischen Strom. (B) Darstellung der Voltage-Clamp-Wellenform-Protokoll. (C) DAT-vermittelten Ströme durch Abstufung der Membran Spannung zwischen -60 und +100 mV von einem Haltepotential von -40 mV mit dem Ganzzell-Pipette aufgenommen. Die Pipette Lösung enthielt 2 mM Dopamin, wie zuvor beschrieben 7-9. (D) Der amperometrische aktuellen erworbenen gleichzeitig mit dem Ganzzell-Strom in Feld C (oben) dargestellt. Zu Beginn der Spannung Schritt für Spannungen höher als 20 mV, wobei die Datensätze einer amperometrischen Elektrode Oxidationsstrom (positiv), erhöht während der gesamten Dauer der Spannungsschritt. (E) und (F) sind repräsentativ für zulässige und unzulässige Ganzzell-Patch-Clamp-Experimenten sind. 2E ist ein Beispiel eines engen G &OHgr; wLoch-Zell-Siegel und das entsprechende amperometrische Signal. 2F stellt eine undichte whole-cell Patch. Die Dichtung Widerstand erreichte MOhm Bereich statt G &OHgr; vor oder nach dem Brechen in die Zelle zu Ganzzell-Modus zu erzielen. Die entsprechende amperomtric Aufnahme misst durchgesickert DA. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
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Discussion
Gleichzeitige Voltage-Clamp und Amperometrie hat die folgenden Vorteile. Alle Zelltypen sind zugänglich und können zur Aufzeichnung verwendet werden. Die Identifizierung der Zellen oder Neuronen, wo die Aufnahmen gemacht ist einfach und unkompliziert. Insbesondere, wenn die Zelle durch Hinzufügen eines fluoreszenzmarkierten fluoreszierende Markierung auf das Protein von Interesse markiert der Experimentator kann problemlos das Zielzelle oder Neurons. Der experimentelle Aufbau ermöglicht eine gleichmäßige und kontrollierte Abgabe von pharmakologischen Wirkstoffen entweder über die Patch-Pipette, oder durch Anlagerung dieser Mittel zu der Badlösung 10. Die gleichzeitige Patch-Clamp-Amperometrie Technik erlaubt Untersuchung der Rolle der verschiedenen Kanäle und Transporter auf die Freisetzung von oxidierbaren Sender mit Millisekunden Auflösung, während die Membran Potenzial kontrolliert wird. Die gleichen Informationen können nicht durch biochemische Methoden 8 erhalten werden. Einer der einzigartigen Aspekte dieser approach ist, dass es Manipulation der intrazellulären Umgebung ermöglicht durch Dialyse über die Patch-Pipette 7,11. Jedoch weist diese Technik den Nachteil, dass der amperometrischen Elektrode kann nur oxidierbaren Sender erkennen. Darüber hinaus sinkt die Empfindlichkeit des amperometrischen Elektrode in Gegenwart von erheblichen basale, spontane Freisetzung einer oxidierbaren Verbindung, so die Messung der Freisetzung nach beispielsweise Vorspannung einer oxidierbaren Verbindung, die spontan freigesetzt wird, kann eine Abnahme der produzieren oxidative Strom. Der größte Nachteil dieser Technik ist das Erfordernis der technischen Kompetenz und teure Ausrüstung.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Sanika Chirwa für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (DA026947, DA021471 und NS071122) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Anti-vibration table w/faraday cage | Technical Manufacturing Corporation | 63-500 series | we use model 63-543 |
| Inverted microscope Nikon TE-2000 | Nikon | discontinued | now Eclipse Ti |
| Two low noise amplifiers axopatch 200b | Molecular Devices | 800-635-5577 | |
| 1-CV 203 BU headstage | Molecular Devices | 800-635-5578 | |
| 1-HL-U pipette holder | Molecular Devices | 800-635-5579 | |
| Digidata 1440A A/D converter | Molecular Devices | 800-635-5580 | |
| Two manipulators Siskyou, left and right handed | Siskiyou | MX6600R MX6600L | 877-313-6418 |
| Laser pipette puller | Sutter Instruments | P-2000 | 888-883-0128 |
| Low noise carbon fiber amperometric electrode | ProCFE | www.dagan.com | |
| Low noise quartz pipette | Sutter Instruments | QF100-70-7.5 | 888-883-0128 |
| 12-volt car battery | widely available | ||
| Car battery charger | widely available | ||
| Reagent | |||
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Dextrose | Sigma | G7528 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma | M2643 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma | P5655 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2∙2H20) | Sigma | 223506 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2∙6H20) | Sigma | M2670 | |
| EGTA | Sigma | E0396 | |
References
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