单细胞的多巴胺释放，同时电压钳和电流分析法测量
Summary
电化学技术措施，通过检测自发多巴胺的氧化产生的氧化电流从一个单细胞多巴胺的释放。同时钳位电压和安培的方法揭示了整体的“活动”，这种活动对多巴胺的反向运输的多巴胺转运体的调节作用机理之间的关系。
Abstract
其释放到突触间隙，多巴胺后发挥其生物学特性，通过其前和突触后的目标1。的多巴胺信号被终止通过扩散2-3，胞外酶4，和膜转运5。位于周边的多巴胺神经元的突触间隙的多巴胺转运蛋白，清除释放的胺通过向内多巴胺通量（吸收）。多巴胺转运蛋白也可以在相反的方向，在这个过程被称为向外输送或流出的多巴胺5从内到外释放胺。 20余年前，苏尔寿等。报道，多巴胺转运可以工作在两种模式的活动：向前（吸收）和反向（流出）5。通过外排通过释放神经递质转运到细胞外空间移动大量的多巴胺，并已被证明发挥重要的调控作用，在细胞外多巴胺Ĥomeostasis 6。在这里，我们描述了如何同时膜片钳和安培法记录膜电位被控制以毫秒的时间分辨率时，通过外排机制，可用于测量释放多巴胺。对于这一点，使用Axopatch 200B中放大器（Molecular Devices公司，用一个低通贝塞尔滤波器组在1,000 Hz的全细胞电流记录），全细胞电流和氧化（电流）信号是同时测量的。对于记录的碳纤维电极的安培法连接到第二放大器（Axopatch 200B中），被置于相邻的质膜，并保持在700毫伏。可以被记录的全细胞和氧化的电流（安培），可以使用一个电压阶跃协议生成的电流 – 电压关系。不同于通常安培校准，需要转换为浓度，电流被直接报告，而不考虑的有效容积7。因此，所得到的数据代表一个下限多巴胺流出，因为有些发射机失去本体溶液。
Protocol
1。设备和用品安装一个法拉第笼顶部的抗振动台（TMI），以减少背景噪音。 的同时膜片钳安培的记录系统需要一个倒置显微镜具有优良的DIC的光学元件和长工作距离镜头。连接到汽车电池的显微镜灯塔。这个直流系统的光源，用于将进一步降低的电噪声。 液压的微操纵（锡斯基尤）进一步降低噪音。在我们的配置中，我们使用的全细胞记录，用右手的机械手和左手为安培?…
Representative Results
组合膜片钳与安培法可以测量电压依赖性DAT介导的DA流出。 图2A示出有代表性的实验配置和记录DAT介导的DA流出当细胞内以及独特的膜电位，通过全细胞膜片移液器夹紧。使用这种技术，细胞表达YFP-DAT蛋白的电压钳位与全细胞膜片移液器而安培电极被放置到质膜（ 图2A）。整个电池用电极的填充用移液管溶液含有2mM DA。安培触摸质膜的电极被保持在700毫伏，大于DA的氧化?…
Discussion
同时电压钳位和安培法有以下好处。所有类型的细胞都可以访问的，并且可以被用于记录。录音完成后的细胞或神经元的鉴定是简单明了的。特别是，如果该信元被加入荧光标记的兴趣蛋白质的荧光标记的实验者可以很容易地选择目标细胞或神经元。的实验配置允许的药物制剂的均匀和受控的交付，通过修补程序移液管，或通过加入这些试剂的浴溶液10。在同时膜片钳安培的技术允许…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们博士Sanika奇鲁瓦的严格审查本手稿。这项工作是由美国国立卫生研究院（DA026947，DA021471，NS071122）的支持。
Materials
| Equipment | |||
| Anti-vibration table w/faraday cage | Technical Manufacturing Corporation | 63-500 series | we use model 63-543 |
| Inverted microscope Nikon TE-2000 | Nikon | discontinued | now Eclipse Ti |
| Two low noise amplifiers axopatch 200b | Molecular Devices | 800-635-5577 | |
| 1-CV 203 BU headstage | Molecular Devices | 800-635-5578 | |
| 1-HL-U pipette holder | Molecular Devices | 800-635-5579 | |
| Digidata 1440A A/D converter | Molecular Devices | 800-635-5580 | |
| Two manipulators Siskyou, left and right handed | Siskiyou | MX6600R MX6600L | 877-313-6418 |
| Laser pipette puller | Sutter Instruments | P-2000 | 888-883-0128 |
| Low noise carbon fiber amperometric electrode | ProCFE | www.dagan.com | |
| Low noise quartz pipette | Sutter Instruments | QF100-70-7.5 | 888-883-0128 |
| 12-volt car battery | widely available | ||
| Car battery charger | widely available | ||
| Reagent | |||
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Dextrose | Sigma | G7528 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma | M2643 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma | P5655 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2•2H20) | Sigma | 223506 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2•6H20) | Sigma | M2670 | |
| EGTA | Sigma | E0396 |
References
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Tags
Single Cell MeasurementDopamine ReleaseVoltage-clampAmperometrySynaptic CleftPre-synaptic TargetsPost-synaptic TargetsDiffusionExtracellular EnzymesMembrane TransportersDopamine TransporterPeri-synaptic CleftInward Dopamine FluxUptakeOutward TransportEfflux Of DopamineSulzer Et Al.Forward ActivityReverse ActivityExtracellular Dopamine HomeostasisPatch Clamp RecordingAmperometric RecordingMillisecond Time ResolutionMembrane Potential Control
Cite This Article
Saha, K., Swant, J., Khoshbouei, H. Single Cell Measurement of Dopamine Release with Simultaneous Voltage-clamp and Amperometry. J. Vis. Exp. (69), e3798, doi:10.3791/3798 (2012).