Summary
Амперометрического Техника меры высвобождение дофамина из одной клетки путем определения окислительной ток, создаваемый спонтанной окисления дофамина. Одновременное зажим напряжения и амперометрии методологии выявления механистической взаимосвязи между общим «деятельность» переносчика дофамина и регулирующей роли этой деятельности на обратный транспорт дофамина.
Abstract
После его выхода в синаптическую щель, допамин оказывает своим биологическим свойствам через своих пред-и пост-синаптические цели 1. Дофамина сигнал прекращается путем диффузии 2-3, внеклеточных ферментов 4, и мембраны перевозчики 5. Переносчика дофамина, расположенных в пригородных синаптическую щель дофаминовых нейронов очищает выпустила аминов через внутренний поток дофамина (поглощение). Переносчика дофамина может работать и в обратном направлении, чтобы освободить аминов изнутри наружу в процессе, называемом внешним транспортом или истечение допамин 5. . Более 20 лет назад Sulzer и др. сообщили переносчика дофамина может работать в двух режимах деятельности: вперед (поглощение) и обратный (отток) 5. Нейромедиатора выпущен через истечение через транспортер может перемещать большое количество допамина в межклеточное пространство, и было показано, играют важную регулирующую роль в внеклеточный дофамин чomeostasis 6. Здесь мы расскажем, как одновременный зажим патч и амперометрии запись может быть использована для измерения выпущен допамина через отток механизм с временным разрешением миллисекунду, когда мембранный потенциал находится под контролем. Для этого цельноклеточной текущих и окислительного (амперометрического) сигналы измеряются одновременно, используя Axopatch 200B усилителя (Molecular Devices, с низкочастотный фильтр Бесселя набор на 1000 Гц для целой клетки текущей записи). Для амперометрии записи электрод из углеродного волокна подключен к второму усилителю (Axopatch 200B) и находится рядом с плазматической мембраной и выдерживают при +700 мВ. Целых клеток и окислительный (амперометрического) токи могут быть записаны и вольт-амперные отношения могут быть получены с использованием протокола напряжения шага. В отличие от обычных амперометрических калибровки, которая требует преобразования в концентрации, ток сообщил напрямую, без рассмотрения в силу 7 объеме. Таким образом, полученные данныепредставляют собой нижний предел дофамина истечения потому, что некоторые передатчика теряется в объеме раствора.
Protocol
1. Оборудование и материалы
- Установите клетку Фарадея в верхней части таблицы анти вибрации (TMI), чтобы уменьшить фоновый шум.
- Одновременное патч зажим амперометрии записи системы требуется инвертированный микроскоп с превосходной оптикой и DIC большим рабочим расстоянием объектива. Подключите микроскоп маяком для автомобильного аккумулятора. Этот источник постоянного света для системы будет способствовать дальнейшему снижению электрических помех.
- Гидравлические микроманипуляторами (Siskiyou) дальнейшего снижения шума. В нашей конфигурации мы используем правую руку манипулятора для всей записи ячейки, а левши для амперометрии.
2. Подготовка электродов для записи
- Потяните патч электродов при использовании кварцевых пипетки на P-2000 съемник (Саттер). Наша тяга длится около 5 сек, с двумя циклами тепла. Это тепло временем привело к последовательным сопротивлением (3-4 МОм) во всей нашей патч пипетки клетки.
- Заполнить электрод спипетки раствор, содержащий 2 мМ дофамина и смонтировать его на правый манипулятор. Оберните контейнер с пипеткой раствор, содержащий DA с алюминиевой фольгой. Держите на льду. Допамин является окисляемых. Ведение решения на льду, защищенном от света уменьшится скорость окисления дофамина.
- Аккуратно удалите ProCFE (Даган), низкий уровень шума углеродного волокна амперометрического электрода с ящиком, заполнить ртутью, крепление на амперометрического адаптера (как показано на рисунке 1), а затем установите на право maniupulator. Защита кончика углеродного волокна от повреждения путем проведения дальнем конце углеродного волокна. Проверьте электрод с лабораторией микроскоп, чтобы обеспечить кончик чистым и неповрежденным.
- Проверьте целостность амперометрического электрода, поставив электроды в стеклянной нижней чашке Петри содержащие внешние решения. Запись базовый ток в отсутствие дофамина. Добавить 10 мкл раствора 1 мМ DA к блюду. Хороший амперометрического повторного электродаШнуры увеличение окислительного тока. Повторите этот шаг в начале и в конце каждого эксперимента, чтобы убедиться, амперометрического электрода работает должным образом.
3. Подготовка первичных нейронов культуры дофамин нейроны или клетки инженерии с целью экспрессии переносчика дофамина в стеклянным дном чашки Петри
- Осторожно промыть клеток или нейронов допамина в три раза теплой внешним решением.
- Установите стеклянным дном чашки Петри на столик микроскопа.
4. Визуализируйте сотовый и выполнить эксперимент
- Найти правильный фокус четко визуализировать клетки. Поместите положительное давление на патч электрода. Затем, осторожно довести оба электрода вниз в раствор, и близко к клетке.
- Установите амперометрических электродов рядом с клеткой (на левой стороне), и патч электрода справа.
- Достичь гигаом печать на клетке с патчем электрода. Разрыв печать с всасываниядостижения всей конфигурации ячейки.
- Разрешить 5-8 мин для диализа внутренних раствор, содержащий дофамин в клетку.
- Используйте требуемое напряжение шага или рампы протокол. Одновременно получать данные как из пипетки патч и амперометрического электрода для измерения токов целые клетки и обратного транспорта дофамина через переносчика дофамина в то время как мембранный потенциал контролируется через патч пипетки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Комбинированный зажим патч с амперометрии может измерить потенциал-зависимых DAT-опосредованной DA оттока. Рисунок 2А показывает, представитель экспериментальной конфигурации и записи DAT-опосредованной DA отток, когда внутриклеточный среды и мембранный потенциал зажаты цельноклеточной патч пипетки. Используя эту технику, клетки, экспрессирующие YFP-DAT белки напряжения зажат с целой пипетке патч ячейки при токовой электрод помещается на мембране (рис. 2A). Весь электродов ячейки заполнены с помощью пипетки раствор, содержащий 2 мМ DA. Амперометрического электрода касания плазматическую мембрану проходит на +700 мВ, потенциал больше, чем окислительно-восстановительный потенциал DA. DAT-опосредованные токи (цельноклеточной-Рис 2С и амперометрического-рис. 2D), отражаются путем активизации цельноклеточной пипетки с мембраной напряжения от -60 до +100 мВ от проведения потенциал -40 мВ (рис. 2В рис 2D) в амперометрического токов соответствует внешнему потоку DA. Перемещение из углеродного волокна от патча приводит к окислительному ответ становиться все меньше и медленнее. Как и ожидалось, для окисления Д.А., окислительного ответа уменьшается, когда напряжение углеродного волокна снижается до +300 мВ и исчезнет полностью на дальнейшее снижение. Рис. 2E-2F являются репрезентативными для приемлемого и неприемлемого записи. Рис 2E является примером жесткой ГОм цельноклеточной печать и соответствующие амперометрического сигнала. рис. 2F представленийTS вытекающей цельноклеточной патч. Соответствующая запись амперометрического меры утечка DA.
Рисунок 1. Подготовка и сборка амперометрического электрода. Аккуратно удалите ProCFE низкий уровень шума углеродного волокна амперометрического электрода с ящиком, заполнить с ртутью. Подготовить адаптер резьбы серебряной проволоки в держатель зажим патч, затем поток адаптер на держатель зажим патч и аккуратно смонтировать амперометрического электрода. Кончик углеродного волокна не должны трогать.
Рисунок 2. Представитель целых клеток и амперометрического записи на нескольких напряжений, когда патч пипетки в цельноклеточной конфигурации. (A) Мультфильм иллюстрирующие экспериментальной конфигурации.Клетки, экспрессирующие переносчика дофамина были зажаты напряжения с цельноклеточной патч пипетки в то время как токовой электрод был помещен рядом с клеточной мембраной. Окисление результаты DA в положительном амперометрического тока. (B) Иллюстрация напряжение протокол зажим сигнала. (C) DAT-опосредованные токи записаны путем активизации мембранных напряжений от -60 до +100 мВ от проведения потенциал -40 мВ с цельноклеточной пипетки. Решение пипетки, содержащейся 2 мМ допамина, как описано выше 7-9. (D) амперометрического текущего приобрел одновременно с целой клетки текущего представлена в панели C (выше). В начале напряжением шага, для напряжения выше +20 мВ, амперометрического записи электрода тока окисления (положительные), которые увеличились в течение всего срока действия напряжения шага. (Е) и (F) являются представительными приемлемым и неприемлемым цельноклеточной экспериментов патч зажим, соответственно. Рис 2E является примером жесткой ГОм WОтверстие клеток печать и соответствующие амперометрического сигнала. рис 2F представляет собой вытекающей цельноклеточной патч. Уплотнение сопротивление достигло МОм диапазоне, а ГОм до или после разрыва в клетку для достижения цельноклеточной режиме. Соответствующая запись amperomtric меры утечка DA. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Одновременное напряжение зажим и амперометрии имеет следующие преимущества. Все типы клеток, которые доступны и могут быть использованы для записи. Идентификация клеток или нейронов, где записи делаются просто и понятно. В частности, если ячейка флуоресцентно меченые, добавив флуоресцентной метки в белок экспериментатор может легко выбрать клетку-мишень или нейронов. Экспериментальные конфигурация позволяет равномерно и контролируемой доставки фармакологических препаратов либо через патч пипетки, или путем добавления этих агентов в ванну решения 10. Одновременное патч зажим амперометрии техника позволяет исследовать роль различных каналов и перевозчиков на освобождение окисляемых передатчик с временным разрешением миллисекунды то время как мембрана потенциал находится под контролем. Эта же информация не может быть получена с помощью биохимических методов 8. Одним из уникальных аспектов этой approacч, что она позволяет манипуляции с внутриклеточной среды путем диализа через патч пипетки 7,11. Однако, этот метод имеет тот недостаток, что амперометрических электродов можно обнаружить только окисляемых передатчиков. Кроме того, чувствительность амперометрического электрода уменьшается в присутствии существенного базальную, спонтанное освобождение окисляющихся соединений, таким образом, измерение выпуска после, например, предварительной из окисляющихся соединений, которые спонтанно выпустил может привести к снижению окислительного тока. Основным недостатком этого метода является необходимость технической экспертизы и дорогостоящего оборудования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарим доктора Sanika Чирва для критического обзора этой рукописи. Эта работа была поддержана Национальным институтом здоровья (DA026947, DA021471, и NS071122).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Anti-vibration table w/faraday cage | Technical Manufacturing Corporation | 63-500 series | we use model 63-543 |
| Inverted microscope Nikon TE-2000 | Nikon | discontinued | now Eclipse Ti |
| Two low noise amplifiers axopatch 200b | Molecular Devices | 800-635-5577 | |
| 1-CV 203 BU headstage | Molecular Devices | 800-635-5578 | |
| 1-HL-U pipette holder | Molecular Devices | 800-635-5579 | |
| Digidata 1440A A/D converter | Molecular Devices | 800-635-5580 | |
| Two manipulators Siskyou, left and right handed | Siskiyou | MX6600R MX6600L | 877-313-6418 |
| Laser pipette puller | Sutter Instruments | P-2000 | 888-883-0128 |
| Low noise carbon fiber amperometric electrode | ProCFE | www.dagan.com | |
| Low noise quartz pipette | Sutter Instruments | QF100-70-7.5 | 888-883-0128 |
| 12-volt car battery | widely available | ||
| Car battery charger | widely available | ||
| Reagent | |||
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Dextrose | Sigma | G7528 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma | M2643 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma | P5655 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2∙2H20) | Sigma | 223506 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2∙6H20) | Sigma | M2670 | |
| EGTA | Sigma | E0396 | |
References
- Michael, A. C., Ikeda, M., Justice, J. B. Jr Mechanisms contributing to the recovery of striatal releasable dopamine following MFB stimulation. Brain Res. 421, 325-335 (1987).
- Gonon, F. Prolonged and extrasynaptic excitatory action of dopamine mediated by D1 receptors in the rat striatum in vivo. J. Neurosci. 17, 5972-5978 (1997).
- Sulzer, D., Pothos, E. N. Regulation of quantal size by presynaptic mechanisms. Rev. Neurosci. 11, 159-212 (2000).
- Napolitano, A., Cesura, A. M., Da Prada, M. The role of monoamine oxidase and catechol O-methyltransferase in dopaminergic neurotransmission. J. Neural. Transm. Suppl. 45, 35-45 (1995).
- Sulzer, D., Maidment, N. T., Rayport, S. Amphetamine and other weak bases act to promote reverse transport of dopamine in ventral midbrain neurons. J. Neurochem. 60, 527-535 (1993).
- Salahpour, A., et al. Increased amphetamine-induced hyperactivity and reward in mice overexpressing the dopamine transporter. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4405-4410 (2008).
- Khoshbouei, H., Wang, H., Lechleiter, J. D., Javitch, J. A., Galli, A. Amphetamine-induced dopamine efflux. A voltage-sensitive and intracellular Na+-dependent mechanism. J. Biol. Chem. 278, 12070-12077 (2003).
- Goodwin, J. S., et al. Amphetamine and methamphetamine differentially affect dopamine transporters in vitro and in. , 284-2978 (2009).
- Kahlig, K. M., et al. Amphetamine induces dopamine efflux through a dopamine transporter channel. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3495-3500 (2005).
- Swant, J., Chirwa, S., Stanwood, G., Khoshbouei, H. Methamphetamine reduces LTP and increases baseline synaptic transmission in the CA1 region of mouse hippocampus. PLoS One. 5, e11382 (2010).
- Gnegy, M. E., et al. Intracellular Ca2+ regulates amphetamine-induced dopamine efflux and currents mediated by the human dopamine transporter. Mol. Pharmacol. 66, 137-143 (2004).
