Summary
Amperometrik tekniği spontan dopamin oksitlenmeye tarafından üretilen oksidatif akımı algılayarak tek bir hücreden dopamin salınımını ölçer. Eşzamanlı gerilim kelepçe ve amperometri metodolojisi dopamin taşıyıcısı ve dopamin ters taşıma Bu faaliyetin düzenleyici rolünün genel "faaliyet" arasındaki mekanistik ilişki bulunmaktadır.
Abstract
Sinaptik aralıkta dopamin içine yayımlanmasından sonra onun öncesi ve post-sinaptik hedeflere 1 yoluyla biyolojik özelliklerini uygular. Dopamin sinyali difüzyon 2-3, ekstraselüler enzimler 4, ve membran taşıyıcıları 5 ile sonlandırılır. Dopamin nöronlarının peri-sinaptik aralıkta bulunan dopamin taşıyıcısı, bir içe dopamin akı (uptake) aracılığıyla serbest aminler temizler. Dopamin taşıyıcısı da dışa aktarım veya dopamin 5 efflux denilen bir süreçle içeriden dışarıya aminler serbest ters yönde çalışabilir. . Ileri (uptake) ve ters (effluks) 5: daha 20 yıl önce Sulzer ark dopamin taşıyıcısı iki faaliyet modlarında çalışabilir bildirdi. Taşıyıcı aracılığıyla akış üzerinden serbest nörotransmitter olan hücre dışı alanı için dopamin büyük bir miktarı hareket edebilir, ve hücre dışı dopamin saat içinde önemli düzenleyici bir rol oynadığı görülmüştüromeostasis 6. Burada simultane yama kelepçe ve amperometri kayıt membran potansiyeli denetlenir milisaniyelik zaman çözünürlüğü ile effluks mekanizması yoluyla serbest dopamin ölçmek için nasıl kullanılabileceğini açıklar. Bunun için, tüm-hücre akım ve oksidatif (amperometrik) sinyalleri bir Axopatch 200B amplifikatör (Moleküler Cihazlar, tam hücreli geçerli kayıt için 1.000 Hz bir alçak geçiren Bessel filtre seti ile) kullanılarak eş zamanlı olarak ölçülür. Bir karbon fiber elektrot kayıt amperometri, ikinci bir amplifikatör (Axopatch 200B) bağlı olan ve plazma zarına bitişik yerleştirilen ve +700 mV tutulur için. Tüm-hücre ve oksidatif (amperometrik) akımları kaydedilebilir ve akım-voltaj ilişkisi bir voltaj adımı protokol kullanılarak oluşturulabilir. Konsantrasyon ile dönüştürülmesini gerektirir olağan amperometrik kalibrasyon aksine, mevcut etkin hacmi 7 dikkate alınmadan hemen rapor edilir. Bu nedenle, sonuçta elde edilen verilerBazı verici toplu çözüm için kaybolur, çünkü dopamin efflux bir alt limit temsil eder.
Protocol
1. Ekipman ve Malzemeleri
- Arka plan gürültüsünü azaltmak için anti-vibrasyon tablosu (TMI) üstüne bir Faraday kafesi monte edin.
- Eşzamanlı yama klemp amperometri kayıt sistemi mükemmel DIC optik ve uzun bir çalışma mesafesi lensi ile bir inverted mikroskop gerektirir. Bir araba aküsüne feneri mikroskop bağlayın. Bu sistem için DC ışık kaynağı daha fazla elektriksel gürültüyü azaltır.
- Hidrolik mikromanipülatörler (Siskiyou) daha azalma gürültü. Bizim yapılandırmada, tüm hücre kayıt için sağ elle manipülatör ve amperometri için uzattı sol kullanın.
2. Kayıt için elektrotlar hazırlayın
- P-2000 çektirmesi (Sutter) üzerine kuvars pipetler kullanarak yama elektrotları çekin. Bizim çekme iki ısı döngüleri, yaklaşık 5 saniye sürer. Bu ısı zaman bizim bütün hücre yama pipetler tutarlı direnci (MΩ 3-4) sonuçlandı.
- Ile elektrot doldurun2 mM dopamin ve sağ manipülatör üzerine monte içeren pipet çözüm. Alüminyum folyo ile DA içeren pipet çözüm tutarak kapsayıcı sarın. Buz üzerinde tutun. Dopamin okside olduğunu. Işıktan korunmuş buz üzerinde çözelti tutulması dopamin oksidasyon oranını azaltır.
- Yavaşça, saklama kutusu bir ProCFE (Dagan) düşük gürültü karbon fiber amperometrik elektrot kaldırmak amperometrik adaptörü (Şekil 1'de gösterildiği gibi) üzerine civa, bağlama ile doldurmak ve ardından sağ maniupulator üzerine monte edin. Karbon fiber ucunda tutarak zarar karbon fiber ucu koruyun. Ucu temiz ve sağlam olduğundan emin olmak için bir laboratuvar mikroskop ile elektrot inceleyin.
- Harici bir çözüm içeren bir cam alt Petri kabındaki elektrot koyarak amperometrik elektrot bütünlüğünü inceleyin. Dopamin yokluğunda bir temel akım kaydedin. Yemek için bir 1mM DA solüsyonu 10 ul ekleyin. İyi bir amperometrik elektrot yenidenkordonlar oksidatif Geçerli bir artış. Belirli amperometrik elektrot düzgün çalışır hale getirmek için her deney başlangıcında ve sonunda bu adımı yineleyin.
3. Glass Bottom Petri Yemekleri Dopamin Transporter ifade için tasarlanan Dopamin Nöronlar veya Hücreleri İlköğretim Nöronal Kültür hazırlayın
- Yavaşça sıcak dış çözeltisi ile hücre veya dopamin nöronları üç kez yıkayın.
- Mikroskop sahneye cam alt Petri kabı monte edin.
4. Hücre görselleştirin ve Deney gerçekleştirin
- Açıkça hücreleri görselleştirmek için doğru odak noktasını bulun. Yama elektrot üzerinde pozitif basınç yerleştirin. Sonra, yavaşça çözelti içerisine iki elektrot aşağı getirmek ve hücreye kapatın.
- Hücre (sol tarafta) ve sağdaki yama elektrot yanındaki amperometrik elektrot yerleştirin.
- Yama elektrot ile hücre üzerinde bir gigaohm mühür ulaşmak. Emme ile Rüptürü mühürtüm hücre yapılandırma elde.
- Hücre içine dopamin içeren iç çözüm diyaliz için 5-8 dk bekleyin.
- İstenilen voltaj adım veya rampa protokolü kullanın. Membran potansiyeli yama pipet aracılığıyla kontrol edilirken aynı anda yama pipet ve tüm hücre akımları ölçmek ve dopamin taşıyıcısı vasıtasıyla dopamin transport ters amperometrik elektrot hem veri elde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Amperometri Kombine yama klemp voltaj bağımlı DAT-aracılı DA effluks. Şekil 2A intraselüler ortam ve membran potansiyeli tam hücreli yama pipet ile kenetlenir DAT-aracılı DA effluks temsilcisi deney yapılandırma ve kayıt gösterir ölçebilirsiniz. Bu tekniği kullanarak, YFP-DAT proteinleri ifade hücreleri olan gerilim-kenetlenmiş bir amperometrik elektrot plazma zarı (Şekil 2A) üzerine alınırken bir bütün hücre yama pipet ile. Bütün hücre elektrot 2 mM DA ihtiva eden bir çözelti pipet ile doldurulur. Plazma membranı dokunmadan amperometrik elektrot +700 mV, DA redoks potansiyeli daha büyük bir potansiyel tutulur. DAT-aracılı akımları (tam hücreli-Şekil 2C ve amperometrik-Şekil 2B) -40 mV tutarak potansiyeli (Şekil 2B den -60 ve +100 mV arasında bir zar gerilimine tam hücreli pipet atlama tarafından kaydedilen Şekil 2B) DA bir dışa akı karşılık gelir. Yama uzak karbon fiber Hareketli küçük ve yavaş olmak oksidatif cevabı neden olur. Gibi oksidasyon DA için beklenen cevap oksidatif gerilim karbon fiber +300 mV yapmak üzere indirgenir ve daha da azaltılması üzerinde tamamen ortadan kalkar azalır. 2E-2F Şekil kabul edilebilir veya edilemez kayıtlarının temsil etmektedir. Şekil 2E, sıkı bir GΩ bir örnektir tam hücreli mühür ve ilgili amperometrik sinyali. Şekil 2F temsilcisits sızdıran tam hücreli yama. İlgili amperometrik kayıt sızdırılmış DA ölçer.
Şekil 1. Hazırlanması ve amperometrik elektrot düzeneği. Yavaşça saklama kutusundan bir ProCFE düşük gürültü karbon fiber amperometrik elektrot kaldırmak, civa ile doldurun. Yama kelepçe tutucu içine gümüş tel parçacığı tarafından adaptörünü hazırlayın, sonra yama kelepçe tutucuya adaptörü iplik ve yavaşça amperometrik elektrot monte. Karbon fiber ucu şey temas etmemelidir.
Şekil 2. Birden gerilimlerde Temsilcisi tam hücreli ve amperometrik kayıt yama pipet tam hücreli yapılandırma olduğunda. (A) Karikatür deneysel konfigürasyonunu gösteren.Bir amperometrik elektrot hücre zarı yakınındaki yerleştirilen iken dopamin taşıyıcısı salgılayan hücrelerin gerilimi tam hücreli yama pipet ile klempe edildi. Pozitif bir amperometrik akım DA sonuç oksidasyonu. Gerilim kelepçe dalga protokol (B) Çizim. (C) DAT-aracılı akımları -60 ve tam hücreli pipet ile -40 mV tutarak potansiyelinden +100 mV arasında membran gerilimi artırıyor tarafından kaydedildi. Daha önce tarif edildiği gibi 7-9 pipet çözelti, 2 mM dopamin içeriyordu. (D) amperometrik mevcut panel C (yukarıda) temsil tam hücre akımı ile aynı anda satın aldı. Gerilim adım başında, +20 mV daha yüksek gerilimler için, amperometrik elektrot kayıtları bir oksidasyon (pozitif) olduğu gerilim adım tüm süresi boyunca geçerli arttı. (E) ve (F), sırasıyla, kabul edilebilir ve kabul edilemez tüm-hücre yama kelepçe deneyler temsil etmektedir. Şekil 2E, sıkı bir GΩ w bir örnektirdelik-hücre mühür ve ilgili amperometrik sinyali. Şekil 2F sızdıran tam hücreli yama temsil eder. Mühür direnci GΩ önceki veya tam hücreli moduna ulaşmak için hücreye girmesini sonra yerine MΩ yelpazesine ulaşmıştır. İlgili amperomtric kayıt sızdırılmış DA ölçer. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eşzamanlı voltaj-klemp ve amperometri aşağıdaki faydaları vardır. Tüm hücre tipleri tarafından erişilebilir ve kayıt için kullanılabilir. Kayıtları yapılır hücreleri veya nöronun tespiti basit ve anlaşılırdır. Hücre floresan ilgili proteini ile bir floresan etiket ekleyerek işaretli olarak, özellikle deneyi kolaylıkla hedef hücre ya da nöron seçebilir. Konfigürasyonu deneysel yama pipet yoluyla, veya banyo solüsyonu 10, bu ajanların ilave edilerek ya da farmakolojik ajanlar ile muntazam ve kontrollü bir dağıtımını sağlamaktadır. Eşzamanlı yama klemp amperometri tekniği milisaniyelik zaman çözünürlüğü ile okside verici sürümü farklı kanalları ve nakliyecilerin rolünün araştırılması verir iken membran Potansiyel olarak kontrol edilir. Aynı bilgileri biyokimyasal yöntemler 8 elde edilemez. Bu yaklaşımların en özgün yanlarından birih bu yama pipet 7,11 ile diyaliz ile hücre içi ortamın manipülasyonu izin vermesidir. Ancak, bu teknik amperometrik elektrot sadece okside vericiler algılayabilir dezavantajı vardır. Kendiliğinden serbest bir oksitlenebilir bileşiğinin ön yükleme, örneğin, sonra, serbest bırakma ölçülmesi, ve böylece de bir azalmaya neden olabilir, ek olarak, amperometrik elektrot duyarlılığını bir oksitlenebilir bileşiğin önemli bazal, spontan salıverme varlığında azalır Geçerli oksidatif. Bu tekniğin temel dezavantajı teknik uzmanlık ve pahalı ekipman gerekliliktir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz bu elyazmasının eleştirel yaklaşım Dr Sanika Chirwa ederim. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (DA026947, DA021471 ve NS071122) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Anti-vibration table w/faraday cage | Technical Manufacturing Corporation | 63-500 series | we use model 63-543 |
| Inverted microscope Nikon TE-2000 | Nikon | discontinued | now Eclipse Ti |
| Two low noise amplifiers axopatch 200b | Molecular Devices | 800-635-5577 | |
| 1-CV 203 BU headstage | Molecular Devices | 800-635-5578 | |
| 1-HL-U pipette holder | Molecular Devices | 800-635-5579 | |
| Digidata 1440A A/D converter | Molecular Devices | 800-635-5580 | |
| Two manipulators Siskyou, left and right handed | Siskiyou | MX6600R MX6600L | 877-313-6418 |
| Laser pipette puller | Sutter Instruments | P-2000 | 888-883-0128 |
| Low noise carbon fiber amperometric electrode | ProCFE | www.dagan.com | |
| Low noise quartz pipette | Sutter Instruments | QF100-70-7.5 | 888-883-0128 |
| 12-volt car battery | widely available | ||
| Car battery charger | widely available | ||
| Reagent | |||
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Dextrose | Sigma | G7528 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma | M2643 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma | P5655 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2∙2H20) | Sigma | 223506 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2∙6H20) | Sigma | M2670 | |
| EGTA | Sigma | E0396 | |
References
- Michael, A. C., Ikeda, M., Justice, J. B. Jr Mechanisms contributing to the recovery of striatal releasable dopamine following MFB stimulation. Brain Res. 421, 325-335 (1987).
- Gonon, F. Prolonged and extrasynaptic excitatory action of dopamine mediated by D1 receptors in the rat striatum in vivo. J. Neurosci. 17, 5972-5978 (1997).
- Sulzer, D., Pothos, E. N. Regulation of quantal size by presynaptic mechanisms. Rev. Neurosci. 11, 159-212 (2000).
- Napolitano, A., Cesura, A. M., Da Prada, M. The role of monoamine oxidase and catechol O-methyltransferase in dopaminergic neurotransmission. J. Neural. Transm. Suppl. 45, 35-45 (1995).
- Sulzer, D., Maidment, N. T., Rayport, S. Amphetamine and other weak bases act to promote reverse transport of dopamine in ventral midbrain neurons. J. Neurochem. 60, 527-535 (1993).
- Salahpour, A., et al. Increased amphetamine-induced hyperactivity and reward in mice overexpressing the dopamine transporter. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4405-4410 (2008).
- Khoshbouei, H., Wang, H., Lechleiter, J. D., Javitch, J. A., Galli, A. Amphetamine-induced dopamine efflux. A voltage-sensitive and intracellular Na+-dependent mechanism. J. Biol. Chem. 278, 12070-12077 (2003).
- Goodwin, J. S., et al. Amphetamine and methamphetamine differentially affect dopamine transporters in vitro and in. , 284-2978 (2009).
- Kahlig, K. M., et al. Amphetamine induces dopamine efflux through a dopamine transporter channel. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3495-3500 (2005).
- Swant, J., Chirwa, S., Stanwood, G., Khoshbouei, H. Methamphetamine reduces LTP and increases baseline synaptic transmission in the CA1 region of mouse hippocampus. PLoS One. 5, e11382 (2010).
- Gnegy, M. E., et al. Intracellular Ca2+ regulates amphetamine-induced dopamine efflux and currents mediated by the human dopamine transporter. Mol. Pharmacol. 66, 137-143 (2004).
