Kolesterol Utflöde Analys
Summary
Kolesterol-analys är utformad för att kvantifiera graden av kolesterol utflöde från odlade celler och förmågan hos plasma-acceptorer att acceptera kolesterol utlösts från celler. Analysen består av märka celler med kolesterol, jämviktning av kolesterol hos intracellulära pooler och frisättning av kolesterol till en extracellulär acceptor.
Abstract
Kolesterolhalten i celler måste upprätthållas inom mycket snäva gränser, för mycket eller för lite kolesterol i en cell resulterar i avbrott av cellmembran, apoptos och nekros 1. Celler kan källan kolesterol från intracellulär syntes och från plasma lipoproteiner, båda källorna är tillräckliga för att helt tillgodose cellernas krav på kolesterol. Processerna för kolesterolsyntes och upptag är hårt reglerad och bristerna hos kolesterol är sällsynta 2. Överdriven kolesterol är vanligare problem 3. Med undantag av hepatocyter och i viss utsträckning adrenokortikala celler, celler inte kan brytas ned kolesterol. Celler har två alternativ för att minska sin kolesterolhalt: att omvandla kolesterol till kolesterylestrar, ett alternativ med begränsad kapacitet som överbelasta cellerna med kolesterylestrar är också giftig, och kolesterol utflöde, ett alternativ med potentiellt obegränsad kapacitet. Kolesterol efflux är en specific process som regleras av ett antal intracellulära transportörer, såsom ATP-bindande kassett transportör proteiner A1 (ABCA1) och G1 (ABCG1) och elimineringsmedel receptortyp B1. Den naturliga acceptor av kolesterol i plasma är högdensitetslipoprotein (HDL) och apolipoprotein AI.
Kolesterol utflöde analys är utformad för att kvantifiera graden av kolesterol utflöde från odlade celler. Den mäter kapaciteten hos celler att upprätthålla kolesterol utflöde och / eller kapaciteten hos plasmat acceptorer att acceptera kolesterol utlösts från celler. Analysen består av följande steg. Steg 1: märkning cellulär kolesterol genom att tillsätta märkt kolesterol till serum-innehållande medium och inkubera med cellerna under 24-48 timmar. Detta steg kan kombineras med lastning av celler med kolesterol. Steg 2: inkubation av celler i serumfritt medium till jämvikt märkt kolesterol hos alla intracellulära kolesterol pooler. Detta steg kan kombineras med aktivering av cellulära cholesterol transportörer. Steg 3: inkubation av celler med extracellulär acceptor och kvantifiering av flödet av märkt kolesterol från celler till acceptorn. Om kolesterol prekursorer användes för att märka nyligen syntetiserade kolesterol,, ett fjärde steg, rening av kolesterol kan erfordras.
Analysen innehåller följande information: (i) hur en viss behandling (en mutation, en knock-down, ett överuttryck eller en behandling) påverkar förmågan hos cellen att utflöde kolesterol och (ii) hur kapaciteten av plasma acceptorer att acceptera kolesterol påverkas av en sjukdom eller en behandling. Denna metod används ofta i samband med kardiovaskulär forskning, metabola och neurodegenerativa sjukdomar, infektionssjukdomar och reproduktiva sjukdomar.
Protocol
Discussion
Den beskrivna metoden för att mäta kolesterol utflöde är utformad för att mäta förflyttning av kolesterol ur celler till en extracellulär kolesterol-acceptor. Det finns flera viktiga faktorer för att förstå denna metod.
Märkning och jämvikt
I den beskrivna metoden märkt kolesterol tillsättes till serum-innehållande serum. Dock aldrig undersökts i detalj, antas det att kolesterol ingår i serum lipoproteiner och de tas upp av celler. Det är viktigt …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har finansierats med bidrag från National hälso-och Medical Research Council of Australia (NHMRC) (526.615 och 545.906) och dels av den viktorianska regeringens OIS Program. DS är en karl på NHMRC.
Materials
| ReagentsCells | HeLa | THP-1 | RAW | HUVEC | BHK-21 | HFF |
| Complete Media | RPMI – 10% FCS – 1% L-glutamine – 0.2% Pen strep |
M199 – 5% FCS – 1% L-glutamine – 1% Pen strep – 2% HEPES (1M) – 7% Endothelial cell growth supplement (ECGS) |
DMEM – 10% FCS – 1% L-glutamine – 0.2% Pen strep |
|||
| Serum Free Media | RPMI – 1% L-glutamine – 0.2% Pen strep |
M199 – 1% L-glutamine – 1% Pen strep – 2% HEPES (1M) – 7% Endothelial cell growth supplement (ECGS) |
DMEM – 1% L-glutamine – 0.2% Pen strep |
|||
| Passage Method | 1 x Trypsin | Suspension | Scrape | 1 x Trypsin | ||
| Passage Ratio | 3:10 | 1:3 | 1:20 | 1:3 | 1:3 | |
| Cell Activation (optional) | TO-901317 – LXR-agonist – Final conc. 4 μM |
|||||
| Other Reagents | phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) – Cell differentiation – Final conc. 0.1μg/ml |
|||||
References
- Tabas, I. Cholesterol in health and disease. J. Clin. Invest. 110, 583-590 (2002).
- Brown, M. S., Goldstein, J. L. Cholesterol feedback: from Schoenheimer’s bottle to Scap’s MELADL. J. Lipid Res. 50, 15-27 (2009).
- Tabas, I. Consequences of cellular cholesterol accumulation: basic concepts and physiological implications. J. Clin. Invest. 110, 905-911 (2002).
- Murphy, A. J. High-Density Lipoprotein Reduces the Human Monocyte Inflammatory Response. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 2071-2077 (2008).
- Mujawar, Z. Human Immunodeficiency Virus Impairs Reverse Cholesterol Transport from Macrophages. PLoS Biology. 4, 365-36 (2006).
- Patel, S. Reconstituted High-Density Lipoprotein Increases Plasma High-Density Lipoprotein Anti-Inflammatory Properties and Cholesterol Efflux Capacity in Patients With Type 2 Diabetes. J. Am. Coll. Cardiol. 53, 962-971 (2009).
- Shaw, J. A. Infusion of reconstituted high-density lipoprotein leads to acute changes in human atherosclerotic plaque. Circ. Res. 103, 1084-1091 (2008).
- Kekulawala, R. J. Impact of freezing on high-density lipoprotein functionality. Anal. Biochem. 379, 75-77 (2008).
- D’Souza, W. Structure/Function Relationships of Apolipoprotein A-I Mimetic Peptides: Implications for Antiatherogenic Activities of High-Density Lipoprotein. Circ. Res. 107, 217-227 (2010).
- Tchoua, U. The effect of cholesteryl ester transfer protein overexpression and inhibition on reverse cholesterol transport. Cardiovasc Res. 77, 732-739 (2008).
- Mukhamedova, N. Enhancing apolipoprotein A-I-dependent cholesterol efflux elevates cholesterol export from macrophages in vivo. J. Lipid Res. 49, 2312-2322 (2008).
- Mukhamedova, N., Fu, Y., Bukrinsky, M., Remaley, A. T., Sviridov, D. The Role of Different Regions of ATP-Binding Cassette Transporter A1 in Cholesterol Efflux. Biochemistry. 46, 9388-9398 (2007).
- Sviridov, D., Fidge, N., Beaumier-Gallon, G., Fielding, C. Apolipoprotein A-I stimulates the transport of intracellular cholesterol to cell-surface cholesterol-rich domains (caveolae. Biochem. J. 358, 79-86 (2001).
- Smyth, I. A mouse model of harlequin ichthyosis delineates a key role for abca12 in lipid homeostasis. PLoS Genet. 4, e1000192-e1000192 (2008).
- Fu, Y. Expression of Caveolin-1 Enhances Cholesterol Efflux in Hepatic Cells. J. Biol. Chem. 279, 14140-14146 (2004).
- Calkin, A. C. Reconstituted High-Density Lipoprotein Attenuates Platelet Function in Individuals With Type 2 Diabetes Mellitus by Promoting Cholesterol Efflux. Circulation. 120, 2095-2104 (2009).
