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Immunology and Infection

Um sistema de cultura primária Neuron para o Estudo da Herpes Simplex Virus latência e reativação

Published: April 2, 2012 doi: 10.3791/3823
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 2,4,5,6,7, 1, 1
1Department of Microbiology, New York University School of Medicine, 2Molecular Neurobiology Program, Skirball Institute for Biomolecular Medicine, New York University School of Medicine, 3Department of Otolaryngology, New York University School of Medicine, 4Department of Cell Biology, New York University School of Medicine, 5Department of Physiology and Neuroscience, New York University School of Medicine, 6Department of Psychiatry, New York University School of Medicine, 7Center for Neural Science, New York University School of Medicine

Summary

O protocolo descreve um sistema de modelo eficiente e reprodutível para estudar vírus herpes simplex tipo 1 (HSV-1) a latência e reactivação. O ensaio emprega homogéneos culturas de neurónios simpáticos e permite a dissecção molecular do vírus de neurónios-interacções usando uma variedade de ferramentas, incluindo a interferência de RNA e de expressão de proteínas recombinantes.

Abstract

Herpes simplex virus tipo-1 (HSV-1) estabelece uma infecção latente ao longo da vida em neurónios periféricos. Este reservatório latente é a fonte de eventos de reactivação recorrentes que assegurar a transmissão e contribuir para doença clínica. Antivirais atuais não impactar o reservatório latente e não existem vacinas. Embora os detalhes moleculares de replicação lítica são bem caracterizados, mecanismos de controle de latência nos neurônios permanecem ainda desconhecidos. A nossa compreensão actual de latência é derivado a partir de estudos in vivo utilizando modelos animais pequenos, que têm sido indispensáveis ​​para definir os requisitos de genes virais e do papel de respostas imunes. No entanto, é impossível distinguir efeitos específicos sobre a relação vírus neurónio-a partir de consequências mais gerais de infecção mediada por células de suporte imunes ou não-neuronais em animais vivos. Além disso, a experimentação animal é dispendiosa, morosa, e limitado em termos de opções disponíveis para a manipulação de acolhimentoprocessos. Para superar essas limitações, um sistema de neurônios-só é desesperadamente necessário que reproduz a características in vivo de latência e reativação, mas oferece os benefícios da cultura de tecidos em termos de homogeneidade e de acessibilidade.

Apresentamos aqui mais um modelo in vitro utilizando culturas de neurónios simpáticos primárias a partir de gânglios rato cervical superior (SCG) (Figura 1) para estudar o HSV-1 latência e reactivação que se encaixa se não de todos os critérios desejados. Depois de eliminar células não-neuronais, perto homogéneos TrkA culturas + de neurónios são infectadas com HSV-1 na presença de aciclovir (ACV) para suprimir a replicação lítica. Remoção ACV seguinte, não produtivos HSV-1 infecções que exibem características fielmente aceites de latência são eficientemente estabelecida. Notavelmente, os mRNAs líticas, proteínas, e vírus infeccioso tornar-se indetectável, mesmo na ausência de selecção, mas a latência associada transcrição (LAT) expressaion persiste em núcleos neuronal. Genomas virais são mantidas a um número de cópias médio de 25 por neurónio e podem ser induzidas a produtivamente replicar por interferir com PI3-quinase / sinalização Akt ou a retirada simples do factor de crescimento do nervo 1. Um recombinante HSV-1 EGFP codificação fundido com a proteína viral lítica US11 fornece um funcional, marcador de tempo real para a replicação resultante da reactivação que é facilmente quantificado. Além disso a tratamentos químicos, as metodologias genéticas tais como a entrega de RNA-interferência ou gene através lentivirais pode ser aplicado com sucesso para o sistema que permite estudos mecanísticos que são muito difíceis, se não impossível, em animais. Em resumo, a SCG baseado HSV-1 sistema de latência / reativação fornece uma poderosa ferramenta necessária para desvendar os mecanismos moleculares que controlam HSV1 latência e reativação de neurônios, um enigma de longa data em virologia cuja solução pode oferecer novas perspectivas no desenvolvimento de novas terapias que alvo tele latente reservatório herpesvírus.

Protocol

1. Isolamento e cultura de neurônios Scg de embriões de ratos

Para proporcionar um contexto útil para a compreensão deste protocolo, e para uma discussão exaustiva da literatura anteriormente que métodos estabelecidos de SCG cultura neurónio, incluindo a base para SCG cultura in vitro, a placa de revestimento de substrato, e os componentes de meios isentos de soro, o leitor é remetido para referências de 2-4.

  1. O uso de ratos como uma fonte para os neurônios Scg foi conduzido de acordo com as diretrizes do NIH no âmbito de um protocolo ativo aprovada pelo Institutional Animal Care & Use Committee (IACUC).
  2. Antes de iniciar a dissecção, preparar colágeno e laminina revestido 96 pratos de cultura de tecidos. Utilizando um dispositivo de pipetagem multi-canal, preencher todos os 96 poços com uma solução contendo 0,66 mg / ml de colagénio da cauda de rato. Imediatamente remover o colagénio, a qual pode ser recuperado e utilizado para até 8 dissecações. Após a remoção tele colagénio, que é muito importante para permitir que os poços seco sob um fluxo laminar. A quantidade de tempo que leva para secar depende do número de poços no prato. Por exemplo, que normalmente demora cerca de 5-10 min. para poços em um prato de 96 cavidades para secar, mas pode demorar até 30-40 min se um formato maior 24 prato bem é usado. Deixar de secar os poços resultados em anexo SCG pobres. Em seguida, repetir o procedimento utilizando uma solução de 2 ug / ml de laminina. Incubar a solução laminina de pelo menos 2 horas a 37 ° C numa atmosfera húmida incubadora de CO 2 até estar pronto para a chapa seus neurónios (passo 1,14).
  3. Comercialmente obtidos ratas grávidas são sacrificados usando CO 2. Após a pulverização do cadáver com etanol a 70%, de uma incisão em forma de U é feita em torno do abdómen. Depois de descascar a pele, uma incisão em forma de U segundo é feita através da parede do músculo abdominal. O útero é visível quando se levantando a camada muscular abdominal. Remover o útero e coloque em um 15prato cm. Abra cuidadosamente o útero usando uma tesoura sem corte, para evitar danificar os filhotes dentro. Cada filhote deve ser liberado a partir do seu saco embrionário, o cordão umbilical cortado, e que o filhote limpo com etanol 70% e Kimwipes.
  4. Trabalhar em uma capa de dissecação, sacrificar nascer filhotes de ratos E21 por corte a cabeça do tronco. Objectivo da tesoura na base do pescoço, um pouco acima dos ombros. Para expor os gânglios, fixar para baixo a cabeça (pescoço virado para cima), utilizando agulhas 23 G em três locais: i cabo) espinhal; ii) da pele anterior puxado para cima o nariz e preso, e iii) esôfago / traquéia deve ser fixado fora a partir da base do pescoço.
  5. Olhar para o * SCG dois posicionados em ambos os lados da bifurcação da artéria carótida (dois por embrião SCGs). A SCG está localizado logo abaixo do ramo. Separa-se a SCG das artérias, puxando a bifurcação separados. Colocar os gânglios em 12 ml de L15-média (suplementado com 0,4% de D (+)-glucose) em 15 ml tubo cónico em gelo.

* O SCG é translúcida e incolor em comparação com o tecido adiposo opaco, amarelado que rodeia a bifurcação. Tente remover o máximo dos vasos adiposo residuais dos tecidos e do sangue, antes de recolher os gânglios.

  1. Repita 1,4 e 1,5 até que todos os SCGs são colhidas a partir dos embriões.
  2. Suavemente centrifugar o gânglio durante 1 min a 600 rpm e aspirar os meios de comunicação em excesso.
  3. Ressuspender o gânglios em 1 ml de L15-media contendo tripsina (0,25%, sem EDTA) e colagenase (1 mg / ml). Incubar durante 30 min a 37 ° C, agitar a cada 10 min.
  4. Adicionar 10 ml de C-media (1x MEM, 0,4% de D (+)-glucose, 2 mM de L-glutamina, FBS 10%) para inactivar a tripsina e centrifuga-se durante 1 min a 600 rpm.
  5. Remover o máximo dos meios de comunicação de tripsina / colagenase como possível * e lave os gânglios com 10ml de C-media. Centrifugar durante 1 min a 600 rpm. Repita este passo uma vez.

* Colagenase residual interferindore com o substrato de colagénio necessária para ligação de células na placa de cultura.

  1. Remover os meios de lavagem e re-suspender o gânglios em 1 ml de C-media e tritura-se utilizando 21 agulha G ligada a uma seringa de 5 ml para dissociar grandes aglomerações de células *. Concluir trituração com 23 agulha G até que os grumos visíveis são dissociados.

* Tenha cuidado para não sobre-triturado, pois isso irá danificar as células. Se a tripsina e colagenase tratamento foi bem sucedida, um máximo de 15 ciclos de cima e para baixo com a agulha 21 G, e três ciclos com a agulha 23 G deve ser suficiente.

  1. Filtre os neurônios dissociados através de um filtro de nylon 70 mM [BD Biosciences célula filtro] em um tubo de 50 ml para descartar qualquer aglomerados restantes.
  2. Retirar uma alíquota de 10 uL da suspensão de células filtrada e misturar com azul de tripano para determinar o número de células vivas. Contar o número de células que activamente exclude o corante utilizando um hemocitómetro.
  3. Remover a solução laminina a partir dos 96 pratos bem em espera na incubadora a 37 ° C (ver PASSO 1.2). Não secar o prato, ele pode ser usado imediatamente para as células de revestimento, uma vez a laminina é removido. Pipetar * Os 5.000-6.000 total de células vivas (50 - 100 uL por poço) para o colagénio ea laminina pré-revestidas 96 prato de cultura de tecidos. Incluir 50 ng / ml factor de crescimento do nervo (NGF) no C-media.

* É fundamental empregar técnica de cultura de tecido bom estéril porque os antibióticos são omitidos os meios de crescimento. Além disso, pode haver variação significativa entre o colagénio proveniente de diferentes fornecedores. Temos tido resultados consistentes em lotes usando colágeno da cauda de rato da Millipore.

  1. No DIV (dias in vitro) 1, substituir os C-meios usados ​​para as células da placa com 50 NBM uL (0,4% de D (+) - glucose, 2 mM de L-glutamina, B-27 suplemento contendo 50 ng / mL de NGF, 5afidicolina iM e 20 uM de 5-fluorouracilo [5-fluoro-2'-desoxiuridina]. Incubar as culturas durante 5 dias *. Neste ponto, trypsinizing e contando as células restantes em vários poços pode determinar o número de neurónios sobreviventes após o tratamento com o agente anti-mitótico. Tipicamente, cerca de 1.000 neurónios permanecem por poço numa placa de 96 poços.

* Os problemas de contaminação por fungos ou bactérias são geralmente evidente dentro das primeiras 24 horas de cultura. Examine cuidadosamente cada poço para o crescimento microbiano antes de substitui placas. Se apenas um número limitado de poços são afectados, eles podem ser tratados com uma solução de lixívia diluída, enxaguadas com PBS e secou-se, a fim de prosseguir com a experiência. Recomendamos repetir qualquer experimento onde até mesmo um número limitado de poços tiveram a contaminação microbiana. Se a contaminação microbiana extensa é observado no prato de 96 cavidades, o teste deve ser terminada.

2. Infecção da SCG CultUres com HSV-1 US11-EGFP e Estabelecimento de Latência

Para o fundo útil em técnicas de virológicos, incluindo a propagação de vírus de base, título de vírus, que determina, e multiplicidade de infecção (MOI), o leitor é remetido para fazer referência a 5. Para uma discussão da biologia herpesvírus, o leitor é remetido para fazer referência 6. Finalmente, o leitor é remetido para referências 7-10 de exemplos anteriores, outros protocolos, e fundo adicional sobre alfa-herpesvírus infecção lítica de neurônios SCG e para comparação com as adaptações nosso protocolo para estudar a latência e reativação.

  1. No DIV 6, adicione o aciclovir (ACV), concentração final de 100 mM para os meios de comunicação existentes em cada * bem. Por exemplo, se cada poço contém 50 ul, adicionar 25 ul de um estoque de 300 mM ACV. Tipicamente, é adicionado ACV a noite antes da infecção, mas também pode ser adicionado 6-8 horas antes da infecção.

* É exceedingly importante para minimizar a manipulação física desnecessária do neurónio em todos os momentos. Basta remover e substituir mídia ou infectar com stocks de vírus deve ser feito com muito cuidado e lentamente. Caso contrário, o estresse resultante mecânica pode ter um impacto negativo sobre a viabilidade dos neurônios.

  1. No DIV 7, infectar as culturas Scg com HSV-1 US11-EGFP (descrito na ref 11) a uma multiplicidade de infecção (MOI) entre 1 -2 (ver abaixo observação importante na determinação MOI óptima) *. Adicionar o vírus diluído directamente para os meios já existentes no poço. Incluir um controlo de mock-infectados e um controle de infecção lítica positiva na mídia falta ACV. Permitir que a infecção para prosseguir durante 2-3 horas a 37 ° C.

* MOI é calculado utilizando título de vírus determinada através da realização de um ensaio de placa em células Vero 12 eo número de células vivas chapeado, semeadas por poço no passo 1,14. Este cálculo é útil somente no sentido operacional,como o número total de células seeded contém neurónios em conjunto com a glia contaminante, e fibroblastos. Como estas células contaminantes divisórias são mortas por tratamento com anti-mitóticas agentes, a MOI eficaz para os neurónios sobreviventes é realmente maior. A partir da quantidade inicial de partida de 5000 - 6000 células vivas, a cerca de 1.000 neurónios permanecem após o tratamento com agentes anti-mitóticos (como avaliado por contagem de células trypsinizing e directa). O ideal MOI para usar quando infectar culturas neuronais pode variar um pouco de uma preparação de estoque de vírus para o próximo. Com cada nova preparação de vírus, sugerimos que teste uma gama limitada de diferente MOI de 1-2. O objetivo aqui é identificar o que tem menos efeitos sobre a viabilidade dos neurônios e os resultados no maior número de eventos induzíveis reativação (definido na seção 3). O vírus US11-EGFP é particularmente útil para rapidamente otimizando as condições, mas pode-se usar outras leituras, como ensaio de placa ou quantitativo PCR. Ela pode ajudar a utilizar vírus purificado através de uma almofada de sacarose para remover as impurezas que reduzem a viabilidade das células, apesar de isto não é essencial e não realizada rotineiramente.

  1. Cuidadosamente substituir o meio de infecção com NBM fresco contendo 50 ng / mL de NGF e 100 * ACV uM.

* É extremamente importante a ser extremamente suave ao mudar os meios de comunicação de infecção. Objectivo da ponta da pipeta na parede do poço, em vez de na parte inferior do poço, e permitir que os meios de comunicação para deslize suavemente para baixo sobre as células. Mesmo ejecção rápida dos meios de comunicação a partir da pipeta pode gerar uma força suficiente para separar os axónios a partir do substrato e fazer com que as células para desprender e tipicamente como uma folha de células. Se apenas um número limitado de neurónios detach (20-30%), as consequências são mínimas, desde que as células parecem saudável. Os neurónios destacadas são susceptíveis de recolocar ao longo do tempo, no entanto, os axónios não será mais bem estendida umaaxônios d novos irá regredir. Embora não seja ideal, a experiência pode prosseguir se apenas um número limitado de poços são afetados. Se houver descolamento extensa de neurónios (70-80%), não é recomendável incluindo o bem afectado (s) na experiência. Se a maioria dos poços contêm 70-80% de neurônios destacados, recomendamos que encerra o experimento. Enquanto os neurônios ainda pode recolocar, que normalmente vai formar grumos grandes. Isso dificulta a avaliação adequada de cada um dos neurônios reativados. Sugerimos repetir qualquer experiência onde poços com neurónios destacadas foram observadas para garantir que as taxas de reactivação não foram influenciados pela adesão diferencial de neurónios aos poços.

Além disso, é fundamental para lidar com as culturas sempre tão delicadamente quanto possível. O estresse mecânico de desnecessários, movimentos bruscos (incluindo a abertura e fechamento repetido de uma porta da câmara incubadora) ou forte mídia aplicação ccompromisso ould a capacidade culturas para apoiar HSV-1 latência, possivelmente resultando em taxas inaceitavelmente altos de reativação espontânea em um determinado experimento.

  1. Manter as culturas durante 6 dias durante os quais o vírus vai estabelecer latência. Durante este período, usar um microscópio fluorescente para monitorar neurónio saúde e US11-EGFP expressão como um indicador da replicação lítica. US11-EGFP deve ser detectada apenas na poços de controlo falta de tratamento ACV, indicando infecção primária de sucesso e replicação lítica produtivo. Neurónios podem mostrar efeitos citopáticos, mesmo na ausência de crescimento virai produtiva. As culturas infectadas devem ser cuidadosamente monitorizados e comparados com mock-infectados neurônios.

3. Reativação e Avaliação

  1. No DIV 14, substitua cuidadosamente a mídia contendo ACV por meio fresco falta ACV. Se for caso disso, incluir farmacológicos (ou biológico) variáveis ​​neste momento. Ser sure seguir as precauções indicadas em 2.3.
  2. Ao longo de um período de dias 5 a 6, monitorar as culturas vivas utilizando um microscópio de fluorescência para detectar neurónios submetidos a reactivação. Alternativamente recolher amostras para outros tipos de análises (proteína, ácido nucleico, etc ensaio de placa).
  3. Calcula-se a frequência de reactivação por contagem do número de poços que contêm EGFP-positivas neurónios e expressar esta como uma proporção do número total de poços de amostra. Observe que a expressão EGFP em um indivíduo bem, não faz distinção entre um evento de reativação primária e subseqüente infecção devido a propagação viral. Uma vez que propagação infecciosa está contido a uma cultura único poço, um ou mais EGFP-positivas neurónios em um poço é operacionalmente definida como um evento de reactivação sob estas condições.

* Eventos reactivação múltiplos podem ocorrer em uma cultura, como descrito em 1. Para distinguir um evento de reactivação primária a partir de propagação virai resultante da reacção vação, o inibidor de encapsidação WAY-150.138 podem ser adicionados. Ao bloquear encapsidação, vírus infeccioso não é produzido e espalhar resultante da reactivação não é possível. Assim, o sinal de EGFP detectada na presença de WAY-150.138 reflecte o número de eventos independentes de reactivação dentro de uma cultura singe bem 1,13-15. Note-se que WAY-150.138 é apenas eficaz contra o HSV-1 estirpe Patton e não está disponível comercialmente. Como uma alternativa para WAY-150.138, considerar a utilização de qualquer dos seguintes: i) um vírus mutante deficiente na sua capacidade de se espalhar para as células vizinhas pode ser utilizado; ii) um vírus repórter onde EGFP é expressa a partir de um promotor IE na presença contínua de ACV; iii) tratamento com PAA ou ACV para prevenir a expressão do gene tardio (e produção de vírus infecciosos) seguido por imunofluorescência utilizando anticorpos dirigidos contra um produto de gene IE.

4. Métodos Alternativos para avaliar reativação utilizando o ensaio de

ONTEÚDO "> Os resultados de uma experiência, único indivíduo deve ser obtido a partir de uma única preparação de SCG. experiências duplicadas pode ser realizada com preparações SCG independentes, enquanto cada repetição foi conduzido utilizando um lote SCG único.

  1. Avaliação de HSV-1 transcripts líticas. Recolher o RNA às vezes desejado após remoção ACV na presença ou ausência de diferentes indutores experimentais de reactivação. Quando se utiliza 96 placas de cultura assim, é recomendável pooling pelo menos 20 poços em conjunto para cada amostra (cerca de 10 5 células por amostra de RNA). Alternativamente, pode ser SCGs plaqueadas em poços de maiores (por exemplo, para uma placa de 24 poços, utilizar 4-5 x10 4 células / poço). Embora seja certamente possível detectar RNA de menos de 20 poços, os pequenos volumes de resultado envolvidos na variabilidade da amostra para amostra injustificada.
  2. Detecção de HSV-1 proteínas líticas. Collect lisados ​​em um tempo desejado após a indução da reactivação. Adicionar 7,5 ul de tampão de lise a cada um de 10 wells em uma placa de 96 poços e analisar por SDS-PAGE e imunotransferência. Alternativamente, as proteínas virais podem ser detectados por microscopia de imunofluorescência indirecta. O revestimento inicial deve ser feito sobre um substrato montável para imagiologia, tais como uma lamela de vidro estéril que tenha sido pré-revestido com poli-D-lisina (0,2 mg / ml, Sigma), antes da aplicação do colagénio e laminina (ver 1,10) .
  3. Detecção de partículas infecciosas. Recolher o sobrenadante da cultura sobre a reativação. Executar um ensaio de placa em monocamadas de células Vero, utilizando diluições em série do sobrenadante. Além disso, ensaios de placa pode ser realizada utilizando lisados ​​de congelamento-descongelamento culturas para incluir associados a células partículas para determinar título.

5. Os resultados representativos

A Figura 2A ilustra um exemplo em que 1 uM tricostatina A (TSA), um indutor conhecido de reactivação 16-18, é aplicado a SCG culturas infectadas de forma latente com a H do tipo selvagemSV1 estirpe repórter EGFP-US11. Com TSA, a reactivação atinge 50% do máximo dentro de 2 dias, e por 5 dias a planaltos reactivação em cerca de 60% dos poços. Linha de base de reactivação ('espontânea') é de aproximadamente 10% nesta experiência e varia tipicamente de 10-20% usando este sistema in vitro. Níveis máximos de reactivação variar dependendo de qual indutor reactivação é utilizada. Os indutores de reactivação pode ser aplicado para a duração da experiência em que não interferem com a replicação virai produtiva, mas isto tem de ser determinada empiricamente. Outros indutores, incluindo qualquer reagente que afecte a viabilidade dos neurónios ou dificulta a conclusão do ciclo de vida virai produtiva, pode necessitar de uma aplicação pulso transiente para provocar a reactivação.

Embora a acumulação de EGFP-US11 em cada poço da experiência representada na Figura 2A é indicativo de reactivação de latência, não distingue se oUS11-EGFP sinal em neurónios individuais é derivado de um evento de reactivação independente, ou a propagação de um vírus reactivada através da cultura. Para avaliar o número de neurónios submetidos a eventos independentes de reactivação em cada poço, as culturas foram pré-tratados com WAY-150.138, um composto que bloqueia especificamente propagação virai através da prevenção de encapsidação do DNA viral genoma 13-15. Infectados culturas de neurônios simpáticos foram tratados com WAY 150138 e reativação induzida com TSA. Um número significativo de EGFP-positivas neurónios foram detectadas apenas em poços de TSA-tratados, em comparação com culturas de controlo tratados com DMSO, demonstrando que um número de eventos independentes de reactivação ocorrer por cultura individual (Figura 2B).

No nosso ensaio, o repórter US11-EGFP é expresso a partir do promotor endógeno US11 11. Desde US11 é um "verdadeiro-tarde" ou γ 2 gene viral lítica, a replicação do DNA viral é necessária para a expressividade robustapor diante. Isto é ilustrado na Figura 3, como EGFP-US11 acumulação é prejudicada pela DNA polimerase virai inibidor de ácido fosfonoacético (PAA) em culturas induzidas para reactivar com o inibidor de LY294002 PI3-quinase.

A Figura 1
Figura 1. Esquemático que ilustra um protocolo experimental típico usando o neurónio cultivadas sistema in vitro para estudar o HSV-1 e latência de reactivação. 1) Após dissecação dos gânglios cervicais superiores (SCG) de ratos E21, os neurónios dissociadas são plaqueadas em 96 pratos de poços e tratadas com anti-mitótico agentes para remover células não neuronais. 2) Após 6 dias in vitro (DIV), as culturas são infectadas com HSV-1 recombinante que contém EGFP fundido com o vírus-encoded US11 gene tardio (EGFP-HSV-1) na presença aciclovir (ACV), uma droga antiviral que blocos de replicação lítica. 3) Por dia 14 (DIV 14), o aciclovir é removido e EGFP-expressãonão é detectado. Culturas pode ser mantida de forma estável dessa maneira por um mês ou mais, ou uma variável de teste podem ser adicionados para avaliar a sua capacidade para provocar a reactivação da latência. A variável pode estar na forma de um inibidor de pequena molécula química, um anticorpo contra uma neurotrofina solúvel ou proteína da superfície celular, ou um lentivírus expressando quer shRNA um gene específico ou uma proteína ectopicamente expressa. A reativação é então monitorada marcando EGFP positivos poços em tempo real.

A Figura 2
Figura 2. TSA reactiva HSV-1 em culturas de GCS. Culturas Scg foram infectadas de forma latente, tal como descrito na Figura 1. No DIV 14, ACV foi removido e substituído com meio contendo 1 mM tricostatina A. (TSA) (A) As culturas foram visualizados e registados com microscopia de fluorescência de cada dia após o tratamento de droga durante um período de 5 dias. A percentagem de poços submetidos reactivatião ao longo da experiência é apresentado em relação ao controlo DMSO-tratados culturas. Percentagem de reactivação foi calculado pelo número de EGFP-positivo poços de 20 poços de uma placa de cultura de 96 poços. As barras de erro indicam o erro padrão da média. (B) As culturas infectadas de forma latente foram tratados com TSA e um inibidor de encapsidação do DNA virai, WAY-150.138 (20 ug / ml). O número de EGFP + neurónios foi comparado 48 horas após o tratamento com os medicamentos para o controlo tratado com DMSO e WAY-150.138. Cada ponto de dados representa a proporção de EGFP + de neurónios em 1.000 neurónios em cultura bem. Bar mostra o percentual médio da EGFP + de neurônios em um poço.

A Figura 3
Figura 3. Detecion EGFP é dependente de replicação do DNA virai. Culturas Scg foram infectadas de forma latente, em seguida, tratados com 10 mM de LY29004, um indutor conhecido de reactivação 1. Reativação induzida por LY (azul) was em comparação com os tratados com inibidor da síntese de ADN virai, ácido phophonoacetic, PAA (300μg/ml, vermelho) e os dois compostos em conjunto (verde).

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Discussion

Esta cultura neurônio primário e sistema de infecção fornece um método simples e eficaz para explorar os mecanismos moleculares subjacentes HSV-1 latência e reativação. O sistema fielmente recapitula as características aceitas de latência definidos em ambas as infecções humanas e em modelos de animais vivos. Quando o vírus é latente nas culturas SCG, partículas virais infecciosas e produtos de genes líticas não pode ser detectado. O produto do gene virai detectado apenas em neurónios latentemente infectadas é o não-codificante transcrição LAT, que se acumula dentro dos núcleos. Reactivação coincide com a expressão de genes virais líticas e culmina na produção de partículas infecciosas. Além disso, este primário neurónio modelo de cultura de células é responsivo a indutores reactivação aceites, tais como TSA, que induz eficazmente a replicação viral lítico.

Indutores químicos diferentes estimular a reativação em diversos graus e com cinética característicos. Por exemplo, o TSA reprodutivelmente induz reactivação em 60-70% das culturas durante um período de observação 5 d. Níveis similares de TSA induzida reativação foram relatados usando latentemente infectados, feocromocitoma de rato diferenciada células PC12 17 ou murino culturas de neurônios trigeminais 18. A cinética da reactivação observamos ea incapacidade de TSA para reactivar 100% das culturas podem reflectir heterogeneidade na capacidade dos genomas latentes para ser derepressed. Consistente com esta proposta, a eficácia do TSA induzida por reactivação alegadamente diminui em função do tempo em cultura 18. Em contraste com TSA, LY29004 induz reactivação em 80-90% das culturas dentro de 2-3 d. Diferenças no estabelecimento de latência ou MOI não são susceptíveis de explicar as diferenças de reativação induzida entre TSA e LY29004, como as nossas condições para o estabelecimento de latência reprodutível resultar em aproximadamente 20% dos neurônios que expressam o rabo de latência do vírus codificadatranscrição ociated LAT 1. No entanto, ainda não foram medidos a fracção de virais genoma células positivas, levantando a possibilidade de que LY29004 induz reactivação em um maior número de neurónios que TSA. Embora as razões subjacentes à capacidade diferencial da TSA e LY20004 a reativação ainda não foram determinados, é claro agentes indutores diferentes pode promover a reativação com eficiência característicos e cinética.

Um aspecto poderoso do sistema é a capacidade de utilização de estirpes do tipo selvagem de vírus ou repórter que se comportam de forma indiferenciada a partir de um vírus de tipo selvagem. Ao contrário dos sistemas anteriores de cultura de células para estudar HSV-1 de latência, que contou com variantes mutantes HSV que foram incapazes de se replicar de forma produtiva 16,18,19, revisado em 20, o nosso sistema modelo incorpora uma cepa EGFP-repórter que é indistinguível do tipo selvagem vírus em termos de eficiência de replicação lítica em células em cultura 11. A utilização de um repórter EGFP vIrus permite uma avaliação sensível e direta visual de latência e reativação. Em contraste com outros repórteres tais como β-galactosidase, o que exige a fixação e lise de células para análise, EGFP permite que o pesquisador para monitorar o estado virai durante todo o curso de uma experiência, proporcionando uma fácil, a avaliação em tempo real de espontânea e induzida reativação. Outros métodos, como PCR quantitativo, também pode ser utilizada para analisar os padrões de expressão de genes virais, que precedem EGFP-expressão, uma vez que EGFP é expresso como um "verdadeiro-tardia" gene, ou para as estirpes de vírus que não possuem um gene repórter. Por outro lado, vírus repórter EGFP outros onde é fundido a imediata-precoces (IE) ou precoce (E) os genes poderiam ser desenvolvidas. Uma vantagem de usar o "verdadeiro-tardia" EGFP-repórter descrito é que EGFP-expressão é rigorosamente dependente síntese de ADN virai, indicando que o ciclo de vida do vírus procedeu para a fase final do gene expressão associado com o crescimento lítico. Indeed, "true-tarde" expressão EGFP para níveis detectáveis ​​por inspeção visual se correlaciona bem com a produção de vírus infeccioso, um indicador biológico que a reativação produtiva ocorreu. No entanto, continua a ser visto se cada neurónio que começa a reactivação, como medido por ciclo de produção (lítico) a expressão do gene, é capaz de progredir através do programa completo lítica para produzir vírus infecciosos. Talvez os vírus têm ampla oportunidade de abortar o programa lítica e restabelecer a latência. Assim, os vírus que expressam repórter EGFP fundido com IE ou proteínas E pode resultar em leituras de reactivação menos fiáveis. Desta perspectiva, comparar a eficiência de reactivação medido utilizando EGFP de repórteres expressas a partir de IE, E, ou promotores de atraso, ou mesmo um repórter combinado com diferentes proteínas repórter fluorescente fundidos com um produto de gene a partir de cada classe de cinética (IE vs E vs ) tarde seria útil. Além disso, o nosso sistema de cultura de célula neuronal pode também ser usado com r HSV-1 diferentechuvas, independentemente do seu potencial neuroinvasive ou capacidade de regular a resposta imune do hospedeiro 21-24. Finalmente, o sistema de cultura in vitro aqui descritos podem ser aplicados a outros tipos de células neuronais e ex vivo culturas gânglios periféricos obtidos a partir de espécies de ordem superior, incluindo seres humanos 25-27.

Usando uma população pura de neurônios, estudos detalhados sobre as interações entre HSV1 e seu hospedeiro neuronal a nível molecular são agora possíveis. Significativamente, este modelo de sistema evita muitas questões complexas associadas a latência e reativação estudar em animais imunocompetentes, onde os níveis adicionais de controle estão no topo das camadas fundamentais vírus neurônio interações. Além disso, o trabalho neste sistema demonstra claramente que há de fato uma relação estável entre vírus e neurônio host que pode ser estabelecida e mantida sem o apoio de uma resposta imune adquirida. Enquanto inata e adaptivimunidade e desempenham claramente um papel importante na biologia de infecções latentes de HSV, o vírus tem a capacidade intrínseca i) para estabelecer uma infecção não produtiva semelhante latência em neurónios, e ii) para mudar para um programa de replicação lítica, produtiva em resposta a ambiental e sinais neuronais aplicadas aos neurônios sozinho. Importante, a base molecular para esta relação única entre HSV e do neurónio pode agora ser dissecado usando células biológicas, silenciamento do gene farmacológica, e ferramentas de entrega de genes 1. Estudos desse tipo que são voltadas para o neurônio e vírus isoladamente não são possíveis em modelos animais, onde vários tipos de células ocupam o compartimento ganglionar. Esperamos que, ao utilizar este sistema modelo, uma compreensão abrangente do circuito complexo molecular que regula HSV-1 latência em neurônios pode finalmente ser alcançado. Sempre que possível, os princípios recolhidos a partir deste sistema de neurónios cultivados podem então ser testados in vivo utilizando estabelecido animais models, ilustrando a natureza complementar destas duas abordagens para o estudo geral do HSV-1 latência.

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Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

Agradecemos aos revisores por suas sugestões inteligentes que ajudaram a melhorar este manuscrito. Este trabalho foi suportado por concessões para MVC (NS21072, HD23315), ACW (GM61139, S10RR017970) e IM (AI073898, GM056927) do NIH. MK foi apoiado em parte por um treinamento NIH subvenção (5T32 AI007180).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70μm nylon filter( cell strainer) BD Biosciences 352350
1x Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS-/-) Invitrogen 14175 w/o CaCl2 and MgCl2
1x Minimum Essential Media (MEM) Invitrogen 11095-080
5-Fluoro-2’-deoxyuridine Sigma-Aldrich F0503 prepare 20 mM stock in 1x MEM; store at -20°C
96-well flat well bottom TC plates Corning 3599
Acyclovir Calbiochem 114798 prepare 31 mM stock in DMSO; store at -20°C
Aphidicolin Calbiochem 178273 prepare 10 mM stock in DMSO; store at -20°C
B-27 Supplement Invitrogen 17504-44
Collagenase Sigma-Aldrich C2674 prepare 10 mg/ml stock in HBSS-/-; store at -20°C
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G6152 prepare 40% stock in H2O; filter sterilize & store at 4°C
L-Glutamine Invitrogen 25030-081
Laminin Sigma-Aldrich L2020 prepare 1 mg/ml stock in H2O; quick-freeze 20 μl aliquats & store at -80°C; dilute to 2 μg/ml working conc. in sterile H2O
Leibovit’z L-15 media Invitrogen 11415
Nerve Growth Factor Harlan Laboratories BT.5017 prepare 50 μg/ml stock in HBSS-/-; store at -80°C
Neurobasal medium Invitrogen 12348
Phosphonoacetic acid (PAA) Sigma-Aldrich P6909 prepare 75 mg/ml stock in H2O; store at -20°C
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma-Aldrich P0899 prepare 20 mg/ml stock in H2O; store at -20°C
Rat-tail collagen EMD Millipore 08-115 Concentration varies with supply lot; store at 4°C and dilute to 0.66 mg/ml working conc. in sterile H2O
Trichostatin A Sigma-Aldrich T8552 prepare 1 mM stock in DMSO; store at -20°C
Trypsin 2.5% Invitrogen 15090-04

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References

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