Summary
Une méthode pour visualiser les organes et immunocoloration chordotonaux chez les larves et des pupes de
Abstract
La proprioception est la capacité à détecter le mouvement ou la position des parties du corps en répondant à des stimuli qui se posent dans le corps. En drosophiles et autres insectes de la proprioception est assurée par des organes sensoriels spécialisés appelés organes chordotonaux (chos) 2. Comme beaucoup d'autres organes chez la drosophile, Chos développer deux fois au cours du cycle de vie de la mouche. Tout d'abord, les larves de développer Chos cours de l'embryogenèse. Puis, les adultes Chos commencent à se développer dans les disques imaginaux larvaires et de continuer à différencier les cours de la métamorphose.
Le développement de Chos larvaires cours de l'embryogenèse a été largement étudié 10,11,13,15,16. La pièce maîtresse de chaque Cho est une unité sensorielle composée d'un neurone et une cellule scolopale. L'unité sensorielle est tendu entre deux types de cellules accessoires qui se fixent à travers la cuticule des cellules spécialisées de fixation épidermiques 1,9,14. Lors d'un mouvement de larves de mouches, le déplacement relatif de l'ecellules de fixation pidermal conduit à l'étirement de l'unité sensorielle et l'ouverture conséquente de spécifiques transitoires récepteurs potentiels vanilloïdes (TRPV) canaux à le segment externe de l'8,12 dendrite. Le signal provoqué est ensuite transférée vers le circuit générateur de motif centrale locomotrice dans le système nerveux central.
Chos multiples ont été décrits chez la mouche adulte 7. Ceux-ci sont situés à proximité des articulations des appendices des mouches adultes (les jambes, les ailes et licols) et dans le thorax et l'abdomen. En outre, plusieurs centaines de Chos forment collectivement organe de Johnston dans l'antenne acoustique adulte qui transduisent en énergie mécanique 3,5,17,4.
Contrairement à la connaissance approfondie de l'évolution de Chos à l'état embryonnaire, on sait très peu sur la morphologie de ces organes au cours de stades larvaires. En outre, à l'exception de Chos fémorales 18 et l'organe de Johnston, notre knowledge sur le développement et la structure de Chos dans la mouche adulte est très fragmentaire.
Nous décrivons ici une méthode pour la coloration et la visualisation de Chos en stade larvaire troisième et pupes. Cette méthode peut être appliquée conjointement avec des outils génétiques afin de mieux caractériser la morphologie et de comprendre le développement des Chos divers chez la mouche.
Protocol
Avant de commencer
- Cultiver les cultures mouche souhaités. Conserver les flacons désertes (environ 30 mouches par flacon de 50 ml). Laissez les mouches pondent leurs œufs pour une seule journée dans chaque flacon. Cela permettra l'approvisionnement alimentaire suffisant et les larves de leur permettre d'atteindre une taille maximale avant de ramper hors de la nourriture. Conserver les flacons dans la température appropriée jusqu'au troisième stade larvaire commence à errer sur la paroi du flacon.
- Préparer une pâte fraîche de tampon phosphate salin (PBS) et PBT (0,1% de Tween dans du PBS). Gardez 10 ml de PBS sur la glace.
- Préparer 1-5 ml de fixateur frais (formaldéhyde 4% en PBT) et le garder sur la glace. Nous utilisons en bouteille 37-38% de formaldéhyde comme une solution stock.
1. Dissection et la fixation des larves du troisième
- Choisissez une errance larve du troisième stade larvaire de la paroi du flacon et le placer dans une chute de 50 ul de PBS glacé sur une plaque de dissection Sylgard (en Sylgard 184 kit élastomère de silicone, Dow Corning Corporation dans untissus boîte de culture).
- Tenez la larve, la face dorsale en place, à proximité des crochets buccaux, à l'aide de pinces fines (Dumont # 5 forceps), et coller une broche d'insectes (minutien, 0,1 mm, en acier inoxydable) dans le cerveau de la larve.
- Prenez l'extrémité postérieure de la larve avec la pince, tirez-le doucement et étirez doucement la larve de la longueur. Tenez-vous un autre axe d'insectes entre les deux stigmates postérieurs.
- Ressort à l'aide de ciseaux couper deux incisions horizontales dans la paroi du corps (perpendiculaire à l'axe antéro-postérieur), à proximité des broches antérieures et postérieures.
- L'aide des ciseaux à ressort couper la paroi du corps larvaire le long de la ligne médiane dorsale de la partie antérieure de l'incision postérieure.
- Retirer les organes internes (intestin, les glandes salivaires, tubes de Malpighi etc) et de la trachée à l'aide de pinces fines. Laver doucement une ou deux fois avec du PBS.
- Prenez les deux volets paroi du corps avec des pinces, les étirer et les épingler à la plaque aide de deux broches d'insectes pour chaque côté.
- Retirez le PBS et ajouter 50 ul d'une solution de fixation (formaldéhyde à 4% en PBT). Incuber 20 minutes à température ambiante.
- Retirer le fixateur. Laver deux fois avec du PBS. Tirez sur les broches d'insectes. Ressort à l'aide de ciseaux couper la tête et la queue des larves en laissant un filet rectangulaire. Transférer le tissu fixé à un tube Eppendorf réfrigérées avec du PBS.
- Une fois un nombre suffisant de larves sont fixés, on peut continuer directement à la coloration d'anticorps. Si une coloration immédiate n'est pas souhaitée, les larves fixe doit être lavé par 3 fois, 5 minutes chacun, avec de l'éthanol 95% et stockés dans de l'éthanol à 95% à -20 ° C.
2. Dissection et la fixation des pupes
Partie I
- Assister aux flacons que pour la fixation des larves, jusqu'au troisième stade larvaire commence à pupariate. Examiner les flacons tous les larves heure et la marque qui ont pupariated. Autoriser les nymphes marquée de développer 30-40 heures à 24 ° C, ou 24-27 heures à 29 ° C.
- En utilisant des pinces fines ramasser 20-30 nymphes de el'âge e approprié et les mettre dans une porcelaine multi-puits plat foncé dissection. Veillez à ne pas endommager les tissus d'intérêt.
- Extrait les nymphes de la coque de nymphose. Commencez par décoller l'opercule et continuer jusqu'à ce que la nymphe est libre. Mettez la nymphe dans un puits rempli de PBT. Continuer l'extraction de tous les nymphes. Étapes 2.4-2.6 devrait être fait en petits lots de cinq nymphes à la fois.
- Lieu cinq nymphes sur une surface plane entre le puits de la boîte de dissection. Avec un couteau de dissection micro couper l'extrémité de la tête et l'extrémité postérieure de l'abdomen (alternativement, il est possible d'utiliser deux paires de pinces pour arracher les trous aux deux extrémités de la pupe).
- Maintenez la nymphe en place à l'aide de pinces fines et d'utiliser une seringue de 1 ml pour laver les organes internes de la pupe, en injectant PBT à travers l'ouverture antérieure.
- Lavez brièvement disséqué nymphe en le plongeant dans un puits rempli de PBS et de le déplacer dans le fixateur froid dans un tube Eppendorf conservé dans la glace.
- Incuber une nuit (ON) à 4 ° C.
Partie II
- Jeter le fixateur et laver les trois nymphes fois, 5 minutes chacun, avec PBT. Gardez les nymphes lavé sur la glace.
- Remplir deux puits de la boîte de dissection avec PBT. L'utilisation d'un polyéthylène pupes Pasteur pipette de transfert de plusieurs à l'un des puits.
- Se déplacer d'un nymphe à la fois dans le second puits. L'utilisation de deux paires de pinces pointues avec des conseils parfaitement alignés, décoller la cuticule transparente des pupes de l'aile: sécuriser la nymphe au fond du puits à l'aide d'une paire de pince, et doucement déchirer le cuticules en utilisant la seconde paire de pinces. Une fois la cuticule est déchiré, le retirer de l'aile. Veillez à ne pas déconnecter l'aile de la pupe. Après avoir enlevé la cuticule de la lame aile, continuera peler la cuticule de la charnière aile (où les Chos latéraux se trouvent).
- Après avoir enlevé la cuticule aile, on peut tenter décoller la cuticule jambe d'une manière similaire.Beaucoup de jambes sont susceptibles d'être perdus dans le processus, mais en dépit de la faible rendement, cette étape est fortement recommandé car il améliore considérablement la coloration de Chos jambes. Les Chos du haltères et de l'abdomen peut être visualisée sans plus décollement de la cuticule.
- Placez le «pelées» nymphe dans un tube Eppendorf rempli avec du méthanol et de garder à la température ambiante. Continuer décollement de la cuticule de tous les nymphes, et les ajouter dans le même tube. Au moins 10 pupes bien pelées doivent être collectées pour chaque coloration.
- Retirez le méthanol et laver trois fois, à 5 minutes chacune, avec de l'éthanol à 95%. Pupes fixe peuvent être conservés pendant de longues périodes de temps dans l'éthanol 95% à -20 ° C.
3. Immunomarquage de larves et pupes
- Laver le tissu fixe avec PBT trois fois, à 30 minutes chacune, à température ambiante. Les larves peuvent être lavés avec agitation douce sur un plateau tournant. Les chrysalides sont lavés sans agitation.
- Remplacer le PBT avec le tampon de blocage (PBT + 5% ndu sérum de chèvre ormal) et incuber SUR à 4 ° C.
- Retirer le tampon de blocage et incuber avec des anticorps primaires (dilué dans un tampon de blocage) ON à 4 ° C.
- Laver quatre fois avec PBT comme décrit dans l'étape 3.1.
- Retirez le PBT et incuber avec des anticorps secondaires (dilué dans un tampon de blocage) ON à 4 ° C.
- Laver deux fois avec PBT et une fois avec du PBS comme décrit dans l'étape 3.1.
- Remplacer le PBS par le milieu de montage (Dako Fluorescent Mounting Medium (Dako Cytomation, Glostrup, Danemark) et incuber à 4 ° C sur ON.
4. Montage des larves
- Larves sont montés sur une lame de microscope dans une goutte de milieu de montage avec leur cuticule vers le bas et muscles de la paroi du corps vers le haut. Mettez une petite goutte de milieu de montage sur une lamelle propre et l'utiliser pour couvrir la préparation. Ne pas appliquer de pression sur les larves monté.
5. Montage de pupes
- Préparer deux lames de microscopeavec une goutte de milieu de montage, un pour la dissection et la seconde pour le montage.
- Mettez les pupes de plusieurs sur une des diapositives.
- Ressort à l'aide des ciseaux enlever la tête et la partie postérieure de l'abdomen.
- Séparer la moitié dorsale du thorax de la moitié ventrale en coupant entre les ailes et les jambes.
- Placez les parties du corps disséqués de la nymphe sur la lame de microscope deuxième une goutte de solution de montage. Veiller à ce que les ailes et les pattes sont tendues et essayer de minimiser la superposition des tissus, autant que possible.
- Déposer une goutte de milieu de montage sur une lamelle et placez-le sur l'échantillon. Ne pas appliquer de pression sur l'échantillon monté.
6. Les résultats représentatifs
Un exemple de l'immuno-tachées Chos de stade larvaire troisième montre la figure 1. Cet exemple montre un segment bien tendu abdominale dans laquelle sept des huit Chos sont clairement visibles. Les neurones sont de laboratoireELED avec MAb22C10 (1:20, obtenu de la Banque de développement des études d'hybridomes à l'Université de l'Iowa), le plafond, les ligaments, Cap-attachement et les cellules de fixation ligamentaires sont étiquetés avec des anti-αTub85E (1:10, Klein et al,. 2010). Anticorps secondaires pour la coloration fluorescente étaient Cy3, Cy5 ou conjugué anti-mouse/rabbit (1:200, Jackson Immunoresearch Laboratories). Les échantillons ont été consultés en utilisant la microscopie confocale (LSM 510, Zeiss).
Un groupe de Chos aile à la veine ventrale radiale d'un 35 h, âgé de pupe est montré dans la figure 2.
La figure 1 (A) Représentation schématique des six types de cellules qui constituent un organe Ch. simple:. De fixation plafond (CA), le bouchon (C), scolopale (S), neurone (N), le ligament (L) et de l'attachement du ligament (LA ). L'organe LCh5, dans lequel cinq Chos sont regroupés, est étendu à travers le groupe de muscles latéraux transversaux (LT1-4). Le muscle longitudinal latéral (LV1), ventrales muscles longitudinaux (VL1-4) et latéral du muscle oblique (LO1) sont également illustrées. Cellules tendineuses sont illustrés sous forme de sphères brunes (tiré de Klein et al., 2010). (B) Un segment abdominal d'une larve du troisième stade larvaire vu à un grossissement de 10X. Sept des huit Chos présents dans chaque segment abdominal sont évidents: cinq organes latéraux qui forment ensemble l'organe pentascolopidial (LCh5), un seul organe latéral (LCh1) et l'un des deux Chos ventrales (VChB). Les neurones (N) des Chos sont étiquetés avec le marqueur neuronal AcM 22C10 (rouge). Le ligament (L), bouchon (C) et les cellules de fixation (Los Angeles, CA) sont étiquetés avec des anti-αTub-85E (bleu). Les cellules de la coiffe et le ligament sont en outre marquée par un rapporteur GFP Cho-spécifique abritant un élément de régulation du locus dei (Nachman et al, données non publiées).
Figure 2. et al, données non publiées).
Discussion
Le protocole décrit dans cette vidéo est un moyen de visualiser Chos proprioceptives pendant les stades larvaires et la nymphe. Les études sur la structure et le développement de Chos proprioceptifs ont été jusqu'à présent essentiellement limitée aux stades embryonnaire et larvaire de disques imaginaux. Ainsi, de nombreux aspects de phases ultérieures de développement, de Chos fois les larves et les adultes, restent encore largement inconnus. Le protocole décrit, combiné avec des outils communs génétiques chez la drosophile, peut être utilisé pour identifier et étudier de nouveaux gènes et les voies qui jouent un rôle dans les étapes ultérieures du développement Chos. Ce protocole a été optimisé pour la visualisation de Cho, mais il peut être adapté pour la coloration des autres tissus, tels que les ailes des pupes 6.
Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier le développement des études d'hybridome de la Banque à l'Université de l'Iowa pour nous envoyer des anticorps. Ce travail a été soutenu par une subvention (n ° 29/08) de la Fondation des sciences d'Israël. AS est également soutenue par une subvention de recherche de la DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 (or #55) forceps, biologie tip | F.S.T. | 11252-20 or 11252-10 (or similar forceps) | |
| Austerlitz stainless steel insect pins, minutiens 0.1mm | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6083-10 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | 240.4019862 | |
| Vannas micro scissors (straight, 7.5 cm, blade 3mm) | AS Mdeizintechnik GmbH | 11-590-00 | Vannas Spring Scissors with identical specifications can be purchased from Roboz Surgical Instrument Co. |
| Orbital shaker - Rotamax-120 | Heidolph | N/A | |
| Dako Fluorescent Mounting Medium | Dako | ||
| X10 PBS formulation | The quality of PBS is critical for the success of this protocol | 2 gr/lit KCl, 2 gr/lit KH2PO4, 80 gr/lit NaCl, 21.7 gr/lit Na2HPO4.7H2O |
|
| PBT | X1 PBS + 0.1% Tween 20 |
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