Summary
Eine Methode zur Immunfärbung und visualisieren Chordotonalorganen in Larven und Puppen von
Abstract
Propriozeption ist die Fähigkeit, die Bewegung oder Position von Körperteilen, indem sie auf Reize, die sich innerhalb des Körpers zu erfassen. In Fruchtfliegen und andere Insekten Propriozeption wird von spezialisierten Sinnesorgane bezeichnet Chordotonalorganen (chos) 2 zur Verfügung gestellt. Wie viele andere Organe in Drosophila, entwickeln Chos zweimal während des Lebenszyklus der Fliege. Zuerst entwickeln sich die Larven Chos während der Embryogenese. Starten Sie dann die erwachsenen Chos in den larvalen Imaginalscheiben entwickeln und auch weiterhin während der Metamorphose zu unterscheiden.
Die Entwicklung der Larven Chos während der Embryogenese wurde ausgiebig studiert 10,11,13,15,16. Das Herzstück eines jeden Cho ist eine sinnliche Einheit eines Neurons und einem scolopale Zelle zusammen. Die sensorische Einheit wird zwischen zwei Arten von akzessorischen Zellen, die an der Kutikula über spezialisierte epidermalen Zellen 1,9,14 Befestigung anbringen gestreckt. Wenn ein Larve bewegt, die relative Verschiebung der Epidermal Anlage Zellen führt zu einer Dehnung des sensorische Einheit und damit Öffnung bestimmter transient receptor potential vanilloid (TRPV) Kanäle an der äußeren Segment des Dendriten 8,12. Die ausgelöste Signal wird dann an den Bewegungsapparat CPG Schaltung in das zentrale Nervensystem übertragen.
Mehrere Chos in der erwachsenen Fliege 7 beschrieben. Diese werden in der Nähe der Gelenke der erwachsenen Fliege Ansätze (Beine, die Flügel und Halfter) und in der Brust und Bauch liegt. Darüber hinaus wurden mehrere hundert Chos bilden gemeinsam die Johnston Organ beim Erwachsenen Antenne, transduzieren akustische, mechanische Energie 3,5,17,4.
Im Gegensatz zu dem umfangreichen Wissen über die Entwicklung der Chos in embryonalen Stadien, wird sehr wenig über die Morphologie dieser Organe während der Larvenstadien bekannt. Darüber hinaus, mit Ausnahme der femoralen Chos 18 und Johnston Organ, unseren KenntnissenGE über die Entwicklung und Struktur der Chos in der erwachsenen Fliege ist sehr lückenhaft.
Hier beschreiben wir eine Methode zur Färbung und Visualisierung in Chos dritten Larvenstadium Larven und Puppen. Diese Methode kann zusammen mit genetischen Werkzeugen aufgetragen werden, um besser zu charakterisieren und zu verstehen, die Morphologie, die Entwicklung der verschiedenen Chos in-the-fly.
Protocol
Bevor Sie beginnen
- Wachsen Sie die gewünschten fly Kulturen. Die Durchstechflaschen nicht überfüllt (ca. 30 Fliegen pro 50 ml Fläschchen). Lassen Sie die Fliegen legen ihre Eier nur für einen Tag in jedem Fläschchen. Dies wird den Larven ausreichende Versorgung mit Lebensmitteln und ihnen zu ermöglichen maximale Größe vor kriecht aus der Nahrung in Kontakt kommen. Die Durchstechflaschen im entsprechenden Temperatur bis zum dritten Larvenstadium, um auf dem Fläschchen Wand wandern beginnen.
- Bereiten Sie einen frischen Vorrat an Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) und PBT (0,1% Tween in PBS). Halten 10 ml PBS auf Eis.
- Bereiten Sie 1-5 ml frisches Fixativ (4% Formaldehyd in PBT) und halten Sie sie auf Eis. Wir verwenden in Flaschen 37-38% Formaldehyd als Stammlösung.
1. Dissection und Fixierung von Dritten Larvenstadium
- Wählen Sie einen wandernden dritten Larvenstadium aus dem Fläschchen Wand und legen Sie sie in einem 50 ul Tropfen eiskaltem PBS auf einer Platte Sylgard Dissektion (aus Sylgard 184 Silikon-Elastomer-Kit, Dow Corning Corporation in einGewebekulturschale).
- Halten Sie die Larve, dorsal oben, nahe der Mündung Haken, mit feinen Pinzetten (Dumont Nr. 5 Zangen), und kleben Sie ein Insekt Stift (minutien, 0,1 mm, Edelstahl) durch die Larve des Gehirns.
- Besorgen Sie sich die hintere Ende der Larve mit der Zange, ziehen Sie vorsichtig und sanft dehnen die Larve der Länge nach. Kleben Sie ein anderes Insekt Stift zwischen den beiden hinteren Luftlöcher.
- Mit Feder Schere zwei horizontale Schnitte in der Körperwand (senkrecht zu der Vorwärts-Rückwärts-Achse), in der Nähe der vorderen und hinteren Stiften.
- Mit den Frühling Schere die larvalen Körper Mauer entlang der dorsalen Mittellinie von der vorderen bis zum hinteren Einschnitt.
- Entfernen der inneren Organe (Darm, Speicheldrüsen, Malpighischen Gefäße etc.) und die Luftröhre mit einer feinen Pinzette. Waschen Sie sanft ein-oder zweimal mit PBS.
- Besorgen Sie sich die zwei Karosserievarianten Wandklappen mit einer Pinzette, strecken sie aus und hänge sie an der Platte mit Hilfe von zwei Insektennadeln für jede Seite.
- Entfernen Sie den PBS und 50 ul der Fixierlösung (4% Formaldehyd in PBT). Inkubieren 20 min bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie das Fixativ. Zweimal mit PBS waschen. Ziehen Sie die Insektennadeln. Mit einer Schere geschnitten Frühjahr die Larven Kopf und Schwanz Verlassen eines rechteckigen Filet. Übertragen Sie das feste Gewebe auf ein gekühltes Eppendorf-Röhrchen mit PBS.
- Sobald eine ausreichende Anzahl von Larven befestigt sind, kann man direkt weiter Antikörperfärbung. Wenn eine sofortige Färbung nicht erwünscht ist, sollte der feste Larven 3 Mal für jeweils 5 Minuten mit 95% Ethanol gewaschen und aufbewahrt werden in 95% Ethanol bei -20 ° C
2. Dissection und Fixierung der Puppen
Teil I
- Kümmern Sie sich um den Fläschchen als für Larven Fixierung, bis dritten Larvenstadium zu pupariate beginnen. Untersuchen Sie die Vials pro Stunde und Mark, die Larven haben pupariated. Lassen Sie die markierten Puppen auf 30-40 Stunden bei 24 ° C oder 24-27 Stunden zu entwickeln bei 29 ° C.
- Mit feinen Pinzetten holen 20-30 Puppen von the entsprechenden Alter und steckte sie in einen dunklen Porzellan Multi-Well-Sezieren Gericht. Achten Sie darauf, das Gewebe von Interesse zu beschädigen.
- Entpacken Sie die Puppen aus der Puppenhülle. Beginnen Sie mit dem Abziehen des Operculum und weiter, bis die Puppe ist kostenlos. Legen Sie die Puppe in einen Brunnen mit PBT gefüllt. Weiter Extrahieren all die Puppen. Steps 2,4-2,6 sollte in kleinen Chargen von fünf Puppen zu einer Zeit durchgeführt werden.
- Legen Sie fünf Puppen auf einer ebenen Fläche zwischen dem Brunnen des Sezieren Gericht. Mit einem Messer geschnitten Mikrodissektion die Spitze des Kopfes und der hinteren Spitze des Bauches (alternativ ist es möglich, zwei Paare von Zangen verwenden, um Löcher an beiden Enden der Puppe reißen).
- Halten Sie die Puppe an Ort und Stelle mit einer feinen Pinzette und verwenden Sie ein 1 ml-Spritze zum Auswaschen der inneren Organe der Puppe, durch Einspritzen von PBT durch die vordere Öffnung.
- Waschen Sie den sezierten Puppe kurz durch Eintauchen in eine gut mit PBS gefüllt und verschieben Sie sie in die kalte Fixativ in ein Eppendorf-Röhrchen auf Eis gehalten.
- Über Nacht (ON) bei 4 ° C
Teil II
- Entsorgen Sie das Fixativ und waschen die Puppen dreimal je 5 Minuten, mit PBT. Halten Sie die gewaschenen Puppen auf dem Eis.
- Füllen Sie zwei Vertiefungen der Sezieren Gericht mit PBT. Verwendung einer Polyethylen Pasteurpipette Übertragung mehreren Puppen einem der Vertiefungen.
- Bewegen um eine Puppe zu einer Zeit, in der zweiten Wanne. Mit zwei Paar scharfe Zange mit perfekt ausgerichtet Tipps, ziehen Sie die transparente Puppenstadium Kutikula des Flügels: Sicherung der Puppe auf den Grund des Brunnens mit einer Pinzette, sanft und reißen die Nagelhaut mit dem zweiten Pinzette. Sobald die Nagelhaut gerissen ist, diese abziehen des Flügels. Achten Sie darauf, um den Flügel aus der Puppe trennen. Nach Abziehen des Nagelhaut vom Flügel Klinge, Peeling weiterhin die Schuppenschicht des Flügels Scharnier (wo die Flügel Chos befinden).
- Nach Abziehen des Flügels Cuticula, kann man versuchen Abziehen des Schenkels Cuticula in einer ähnlichen Weise.Viele Beine sind wahrscheinlich in den Prozess verloren, aber trotz der geringen Ausbeute, dieser Schritt ist sehr zu empfehlen, da es stark verbessert die Färbung von Chos Bein. Die Chos des Haltere und Bauch kann ohne weiteres Abziehen der Cuticula sichtbar gemacht werden.
- Platzieren Sie den "geschält" Puppe in ein Eppendorf-Röhrchen mit Methanol gefüllt und bei Raumtemperatur aufbewahren. Weiter Abziehen der Kutikula von all den Puppen, und fügen Sie sie dem gleichen Rohr. Mindestens 10 schön geschält Puppen sollten für jede Färbung gesammelt werden.
- Entfernen Sie das Methanol und dreimal für jeweils 5 Minuten, mit 95% Ethanol. Feste Puppen können für längere Zeit in 95% Ethanol bei -20 ° C aufbewahrt werden
3. Immunfärbung von Larven und Puppen
- Waschen des fixierten Gewebes mit PBT dreimal jeweils 30 Minuten bei Raumtemperatur. Larven können unter leichtem Schütteln auf einer rotierenden Platte gewaschen werden. Die Puppen sind ohne Schütteln gewaschen.
- Ersetzen Sie das PBT mit Blocking-Puffer (PBT + 5% nOrmal Ziegenserum) und inkubieren ON bei 4 ° C
- Entfernen Sie die Blockierung Puffer und Inkubation mit primären Antikörpern (verdünnt in Blocking-Puffer) ON bei 4 ° C
- Mal Waschen mit PBT, wie in Schritt 3.1.
- Entfernen Sie die PBT und inkubieren mit Sekundärantikörper (verdünnt in Blocking-Puffer) ON bei 4 ° C
- Waschen zweimal mit PBT und einmal mit PBS, wie in Schritt 3.1.
- Ersetzen Sie das PBS mit Eindeckmedium (Dako Fluorescent Mounting Medium (Dako Cytomation, Glostrup, Dänemark) und inkubieren Sie bei 4 ° C auf.
4. Montage der Larven
- Die Larven werden auf einem Objektträger in einem Tropfen Eindeckmittel mit ihrer Kutikula nach unten und Körperwand Muskeln nach oben montiert. Setzen Sie einen kleinen Tropfen Eindeckmedium auf einem sauberen Deckglas und verwenden es, um die Herstellung zu decken. Wenden Sie keine Druck auf die Larven montiert.
5. Montage der Puppen
- Bereiten Sie zwei Objektträgermit einem Tropfen Eindeckmedium, eine für Zerlegung und den zweiten für die Montage.
- Setzen Sie mehrere Puppen auf einem der Dias.
- Mit Hilfe einer Schere entfernen Frühjahr den Kopf und den hinteren Teil des Bauches.
- Trennen Sie die dorsale Hälfte des Thorax aus der ventralen Hälfte, indem zwischen den Flügeln und den Beinen.
- Legen Sie die sezierten Körperteile der Puppe auf der zweiten Objektträger in einem Tropfen Montagelösung. Sicherstellen, dass die Flügel und Beine gestreckt werden und versuchen, Überlagerung von Gewebe so weit wie möglich zu minimieren.
- Geben Sie einen Tropfen Eindeckmedium auf einem Deckglas und legen Sie es über der Probe. Üben Sie keinen Druck auf die Probe montiert.
6. Repräsentative Ergebnisse
Ein Beispiel für Immuno-gefärbten Chos der dritten Larvenstadium ist in Abbildung 1 dargestellt. Dieses Beispiel zeigt eine schön gedehnt Abdominalsegment, in dem sieben der acht Chos sind deutlich sichtbar. Neuronen sind LaboreLED mit MAb22C10 (1:20, aus der Developmental Studies Hybridoma der Bank an der University of Iowa erhalten);. die Kappe, Band, Mütze und Band-Befestigung Befestigung Zellen werden mit anti-αTub85E (1:10, Klein et al beschriftet, 2010). Sekundärantikörper für Fluoreszenzfärbung waren Cy3, Cy5-konjugierten oder anti-mouse/rabbit (1:200, Jackson Immunoresearch Laboratories). Die Proben wurden unter Verwendung der konfokalen Mikroskopie (LSM 510, Zeiss).
Ein Cluster von Flügel Chos am ventralen radiale Vene eines 35 h alte Puppe ist in Abbildung 2 dargestellt.
Abbildung 1 (A) Schematische Darstellung der sechs Zelltypen, die eine einzelne Ch Orgel darstellen:. Vakuumierkappe (CA), Kappe (C), scolopale (S), Neuron (N), Band (L) und Lig. Befestigung (LA ). Die LCh5 Organ, in dem fünf Chos gruppiert sind, wird über die Gruppe der lateralen Quermuskeln (LT gestreckt1-4). Die laterale Längsmuskulatur (LL1), ventrale Längsmuskeln (VL1-4) und seitlichen schrägen Muskel (LO1) sind ebenfalls dargestellt. Tendon-Zellen werden als braune Kugeln (Entnommen aus Klein et al., 2010) dargestellt. (B) Ein Abdominalsegment eines dritten Larvenstadium mit einer 10X Vergrößerung betrachtet. Sieben der acht Chos, die in jedem Abdominalsegment liegen auf der Hand: fünf seitlichen Organe, die zusammen den pentascolopidial Orgel (LCh5), einen einzigen seitlichen Orgel (LCh1) und einer der beiden ventralen Chos (VChB). Die Neuronen (N) der Chos mit den neuronalen Marker MAb 22C10 (rot) markiert. Das Ligament (L), Kappe (C) und Befestigung Zellen (LA, CA) mit markierten Anti-αTub-85E (blau). Die Kappe und Lig. Zellen sind zusätzlich mit einer CHO-spezifischen GFP-Reporter beherbergen ein regulatorisches Element aus dem dei Locus (Nachman et al., Unveröffentlichte Daten) beschriftet.
Abbildung 2. et al., Unveröffentlichte Daten) zusammen markiert.
Discussion
Das Protokoll in diesem Video beschrieben bietet eine Möglichkeit, propriozeptiven Chos während Larven und Puppen Stufen sichtbar zu machen. Studien über die Struktur und Entwicklung der propriozeptiven Chos wurden bisher hauptsächlich zur Gewinnung von embryonalen Stadien und larvalen Imaginalscheiben beschränkt. So viele Aspekte der späteren Stadien der Entwicklung, der sowohl juvenilen und adulten Chos, weitgehend unbekannt. Das beschriebene Protokoll, mit gemeinsamen genetischen Werkzeuge in Drosophila kombiniert wird, kann genutzt werden, um zu identifizieren und studieren neue Gene und Signalwege, die eine Rolle in späteren Stadien der Entwicklung Chos werden. Dieses Protokoll wurde für die Visualisierung von CHO optimiert, aber es kann für die Färbung von anderen Geweben, wie Puppen Flügel 6 angepasst werden.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Autoren möchten die Developmental Studies Hybridoma der Bank an der University of Iowa danken für die Zusendung Antikörper. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium (Nr. 29/08) von der Israel Science Foundation unterstützt. AS wird auch durch ein Forschungsstipendium der DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) gefördert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 (or #55) forceps, biologie tip | F.S.T. | 11252-20 or 11252-10 (or similar forceps) | |
| Austerlitz stainless steel insect pins, minutiens 0.1mm | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6083-10 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | 240.4019862 | |
| Vannas micro scissors (straight, 7.5 cm, blade 3mm) | AS Mdeizintechnik GmbH | 11-590-00 | Vannas Spring Scissors with identical specifications can be purchased from Roboz Surgical Instrument Co. |
| Orbital shaker - Rotamax-120 | Heidolph | N/A | |
| Dako Fluorescent Mounting Medium | Dako | ||
| X10 PBS formulation | The quality of PBS is critical for the success of this protocol | 2 gr/lit KCl, 2 gr/lit KH2PO4, 80 gr/lit NaCl, 21.7 gr/lit Na2HPO4.7H2O |
|
| PBT | X1 PBS + 0.1% Tween 20 |
References
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