Aviditet-baserad Extracellulär Interaktion Screening (AVEXIS) för den skalbara Detektion av låg-affinitets extracellulär receptor-ligand-interaktioner

Summary

AVEXIS är en hög genomströmning av proteininteraktioner analys utvecklad för att systematiskt screena för nya extracellulära receptor-ligandpar är involverade i cellulära igenkänningsprocesser. Den är speciellt utformad för att upptäcka övergående proteininteraktioner som är svåra att identifiera med hjälp av andra massundersökningar.

Abstract

Extracellulär protein: protein interaktioner mellan utsöndrade eller membran-bundna proteiner är avgörande för både initiera kommunikationen mellan och se sammanhållning i flercelliga organismer. Proteiner förutspås bilda extracellulära interaktioner kodas med ungefär en fjärdedel av mänskliga gener ^1, men trots deras betydelse och överflöd, har de flesta av dessa proteiner ingen dokumenterad bindande partner. I första hand beror detta på deras biokemiska intractability: membran-inbäddade proteiner är svåra att lösa upp i sin nativa konformation och innehåller strukturellt viktiga post-translationella modifieringar. Dessutom är samspelet släktskap mellan receptor proteiner ofta kännetecknas av extremt låg interaktion styrkor (halveringstider <1 sekund) utgör hinder för deras upptäckt med många ofta använda hög genomströmning metod ^2.

Här beskriver vi en analys, AVEXIS (aviditet-baserade EXtracelluLAR Interaktion Screen) som övervinner dessa tekniska utmaningar som möjliggör detektion av mycket svaga proteininteraktioner (t _1/2 ≤ 0,1 sek) med en låg falskt positivt ränta ^3. Analysen genomförs vanligtvis i en hög genomströmning format för att möjliggöra systematisk screening av flera tusen interaktioner i ett lämpligt mikrotiterplatta format (Fig. 1). Det bygger på framställning av lösliga rekombinanta proteiner bibliotek som innehåller fragment ektodomän av cellytereceptorer eller utsöndrade proteiner inom vilken screena för interaktioner, och därför är denna metod är lämplig för typ I, typ II, GPI-kopplade cellytreceptorer och utsöndrade proteiner, men inte för multipass membranproteiner såsom jonkanaler eller transportörer.

Det rekombinanta proteinet bibliotek framställs med användning av en bekväm och hög nivå däggdjursexpressionssystem ^4, så att viktiga posttranslationella modifieringar såsom glycosylations-och disulfidbindningarna läggs till. Uttryckta rekombinanta proteinerna utsöndras i mediet och som produceras i två former: en biotinylerad bete, som kan infångas på en streptavidin-belagd fast fas lämplig för screening och en pentamerised enzym-märkt (β-laktamas) byte. Betes-och proteiner rov presenteras till varandra på ett binärt sätt för att detektera direkta interaktioner mellan dem, liknande en konventionell ELISA (fig 1). Den pentamerisation av proteinerna i bytet uppnås genom en peptid sekvens från brosket oligomert matrix protein (COMP) och ökar den lokala koncentrationen av ektodomäner skulle innebära betydande aviditet vinster att göra det möjligt även mycket transienta interaktioner som ska detekteras. Genom att normalisera verksamhet både betet och bytesdjur till förutbestämda nivåer före screening, har vi visat att interaktioner med monomera halveringstider på 0,1 sek kan detekteras med låga falska positiva värden ^3.

Protocol

1. Kompilera ett bibliotek av bete och Prey Plasmid-expressionsvektorer

1. Sammanställa en lista över cellytreceptor och utsöndrade proteiner av intresse som skall screenas för interaktioner och hämta deras sekvenser från en lämplig proteinsekvensdatabas. De flesta proteiner som innehåller en N-terminal peptid sekretorisk signal är lämpliga (dessa inkluderar typ I, GPI-länkade och utsöndrade proteiner). Typiskt skulle en proteinfamilj (t.ex. immunglobulin-superfamiljen eller alla receptorer begränsade till en specifik celltyp såsom erytrocyter) väljas.
2. Bestämma omfattningen av de extracellulära regionerna genom att identifiera platsen för signalpeptiden och transmembranregionen med protein mjukvara funktionen förutsägelse. Vi använder typiskt SignalP v3.0 ⁵ och TMHMM v2.0 ^6.
3. Design primeruppsättningar som förstärker hela ektodomänen fragmentet för varje receptor. Vi har en serie av betes-och vektorer byten som är lämpliga för detta ändamål, vilket är enTillgängligt från Addgene ( http://www.addgene.org/~~V ). Konstruera den sensprimer runt början metionin att inkludera en Notl-plats restriktionsenzym och en optimal Kozak-sekvens, vilket följs av 25 baspar av exakt matchning genspecifik sekvens (fig. 2A).
4. Konstruera antisense-primer för att trunkera typ I-receptor-proteiner just före den förutsagda transmembranregionen för att uttrycka hela ektodomänen som ett lösligt rekombinant protein. Inkludera en Ascl restriktionssäte i primer som sedan skulle översättas i ram till en C-terminal råtta Cd4d3 4 protein tag ⁷ (Fig. 2A).
5. Förstärka ektodomän fragmenten från alla gener som använder dessa primers och klona dem i bete eller bytet vektor. Vi finner det ibland hjälp att först klona dem i skyttelvektorer innan underkloning i en lämplig däggdjursexpressionsvektor använder vi ett derivat av pTT3 vektorn ^3,4. Både bete och vektorer bytesdjur contain C-terminala protein-taggar enligt följande (Fig. 2B).
   1. Beten: En tagg som innehåller domänerna 3 och 4 i de rått-CD4 (Cd4d3 4) protein följt av en peptidsekvens som är ett substrat för E. coli BirA-enzymet och kan därför monobiotinylated på en specifik lysinrest (fig. 2B) . Den Cd4d3 4 taggen igenkännes av OX68 monoklonala antikroppen och används för att kvantifiera uttrycket av de betesproteiner genom ELISA. Betet proteinerna är därför monomera och monobiotinylated. Ytterligare betesprotein vektorer där biotinylatable peptiden är ersatt med en 6-His-markör för rening är tillgängliga.
   2. Bytesorganismer: De bytesorganismer innehåller också en råtta Cd4d3 4 tagg följt av en peptidsekvens från råtta brosk oligomera matrixprotein (COMP) och en C-terminal β-laktamas-enzym. COMP Peptiden ser bytet former pentamerer gång uttryckte (Fig. 2B).

2. Rov-och betetskonsumtion-proteinexpression

Vi använderen lämplig uttryck på hög nivå som använder suspensionskultur av HEK293E cellinje ⁴ för att producera våra proteinbibliotek, men vilken som helst däggdjurs-expressionssystem skulle vara lämplig. En kommersiellt tillgänglig alternativ är Freestyle systemet. Cellerna odlas rutinmässigt på en platta (125 rpm) vid 37 ° C, _5% CO2 vid 70% relativ fuktighet. Både positiva och negativa kontrollprover proteiner måste också komma till uttryck. Råttan Cd4d3 4 tag endast fragment finns som både bete och bytesdjur, och är lämpliga negativa kontroller. På samma sätt, bete och bytesdjur vektorer som kodar en positiv kontroll finns (Addgene), vi brukar använda råtta CD200-Cd200R interaktionen ^8.

1. Ympa HEK293E celler dagen före transfektion i en densitet av 2,5 x 10 ⁵ ml celler ^-1. Vi kulturen rutinmässigt celler i volymer om 50 ml i Freestyle293 media efter tillverkarens rekommendationer. Att säkerställa en effektiv biotinylering komplettera than cellodlingsmedium användes för att framställa betesproteiner med D-biotin till en slutlig koncentration av 100 pM. Medium som används för att uttrycka de bytesproteinerna behöver inte kompletteras med ytterligare D-biotin.
2. Följande dag transfektera celler med användning av en lämplig transfektioner reagens (t.ex. 293fectin). Använda 25 | ig av betet eller byten plasmidkonstruktioner för att transfektera en 50 ml kultur. För att framställa de biotinylerade beten, co-transfektera den plasmid som kodar för bete konstruera med en plasmid som kodar för en utsöndrad form av E. coli-protein-biotin-ligas ( BirA) som är tillgänglig från Addgene. Samtransfektion beten plasmider vid ett förhållande 10:1 (2,5 pg) av plasmiden som kodar för utsöndrade proteinet BirA.
3. Skörd kulturer fem dagar efter transfektion genom att först pelletera cellerna genom centrifugering vid 3000 x g under 20 minuter följt av filtrering av supernatanten genom ett 0,22 pm filter.

[Tips: Bait och bytesdjur proteins skall lagras outspädd vid 4 ° C och som en allmän riktlinje bör användas inom ett år. Tillsätt bakteriostatika, såsom 50 | ig / ml polymyxin B-sulfat eller 10 _mM NaN3 för att förhindra bakteriell förorening av supernatanterna.]

3. Normalisering av betet och prov Prey

En av de viktigaste funktionerna i AVEXIS analysen är att eftersom de rekombinanta proteiner utsöndras de kan spädas eller koncentreras (normaliserad) för att inom fastställda tröskelvärden verksamheten innan den används i analysen. Vi har funnit att de nivåer vid vilka de rekombinanta proteinerna som uttrycks omfattar en mängd - upp till 4 storleksordningar - och så att normalisera steg signifikant reducerar antalet falska positiva under skärmarna.

3,1 Agn normalisering

Obs: Okonjugerat D-biotin måste tas bort från medierna (vanligen genom dialys) eftersom det kommer att konkurrera med den biotinylerade BAIt-protein för bindning till streptavidin bindningsställen.

1. Överföra beten supernatanter in dialysrör, etikett, klippa säkert och dialysera extensivt mot en lämplig buffert, såsom PBS för att avlägsna fritt biotin.

[Tips: Vi har funnit att tillräckliga dialys normalt uppnås för 6 x 50 supernatanterna ml bete mot en volym på 4,5 L PBS med 4 förändras över en 24 timmars period. Otillräcklig dialys kan observeras av en hämning av proteinbindning vid låga spädningar under betet normalisering steg (Fig. 3A).

2. Utföra en ELISA för att bestämma de relativa nivåerna vid vilka betesproteiner uttrycks. Bered en spädningsserie av de biotinylerade betesproteiner och fånga dem i en streptavidinbelagd mikrotiterplatta. Använd råttan Cd4d3 4 tag att upptäcka och kvantifiera de tillfångatagna betesproteiner med en monoklonal antikropp (OX68). Koncentrerad eller utspädd bete proteiner till det lägsta belopp som krävs för att mätta alla Bioti-bindningsställen i brunnen av en streptavidin-belagd platta.
3. Blockera brunnarna i en streptavidin-belagd platta med fosfatbuffrad saline/0.1% Tween-20 (PBST) / 2% bovint serumalbumin (BSA) under 15 minuter.
4. I en separat platta, gör en spädningsserie (fyra 1:3 utspädningar är vanligen tillräckligt) av betet proteiner i PBST / 2% BSA och överföring till brunnarna av en streptavidin-belagd platta. Inkubera under 1 timme vid rumstemperatur.
5. Tvätta 3x i PBST. Tillsätt 100 pl av 2 | ig / ml mus-anti-rått-Cd4d3 4-IgG (OX68) inkubera under 1 timme vid rumstemperatur.
6. Tvätta 3x i PBST. Tillsätt 100 pl av anti-mus-alkaliskt fosfatas vid 1:5000 spädning i PBST / 2% BSA och inkuberas under 1 timme vid rumstemperatur.
7. Tvätta 3x med PBST och en slutlig tvättning i PBS för att avlägsna eventuellt kvarvarande rengöringsmedel. Tillsätt 100 pl av 1 mg / ml substrat 104 i dietanolaminbuffert (10% dietanolamin (volym / volym), 0,5 mM _MgCl2, 10 _mM NaN3, pH 9,8, förvarades skyddad från ljus vid 4° C).
8. Efter en timme åtgärd absorbans vid 405 nm. Representativa beten normalisering Resultaten visas i figur 3A.
9. Bait proteiner som uttrycks på nivåer som är tillräckliga för att mätta alla biotin-bindningsställen för en streptavidin-belagd platta, när det används outspädd, bör koncentreras med hjälp Vivaspin koncentratorer (Vivascience, 10 kDa MWCO). Som en vägledning, uppskattar vi att ~ 5 ^ g av en typisk betesprotein (~ 80 kDa) är tillräcklig för att mätta en 96 brunnars platta.
   1. Beten proteiner uttryckta vid höga nivåer kan spädas i PBST / 2% BSA till en koncentration som är tillräcklig för att mätta den streptavidin-belagda plattan. Aktiviteten hos de beten ska kontrolleras igen efter utspädning eller koncentrering att säkerställa att de mätta alla biotinbindande ställen i streptavidin-belagd platta.

3,2 Rov normalisering

1. Kvantifiera de relativa nivåerna vid vilka bytesproteinerna uttrycks med hjälp av β-laktamasenzymaktivitet.
2. Först en spädningsserie av supernatanten innehållande de bytesproteinerna i PBST / 2% BSA-buffert. Tillsätt sedan 20 | il av de utspädda lösningarna på 60 | il av en 242 fiM (0,125 mg / ml) nitrocefin-lösning (Calbiochem).
3. Omedelbart överföra plattan till en mikrotiterplattläsare som tar en absorbans mätning vid 485 nm per minut under 20 minuter vid rumstemperatur. Representativa bytesorganismer normalisering Resultaten visas i figur 3B.
4. Koncentrera prover med användning av centrifugal-koncentratorer eller utspädd dem i PBST / 2% BSA för att nå en tröskel aktivitet ~ 2 nmol min ^-1 omsättning nitrocefin. I praktiken uppnås detta om samtliga nitrocefin hydrolyseras inom ~ 7 minuter.

4. AVEXIS screeningförfarande

1. Tvätta en streptavidin-belagd platta i PBST.
2. Tillsätt 100 pl av PBST / 2% BSA till varje brunn och inkubera under 30 minuter för att blockera eventuella falska proteinbindningsställen i varje brunn.

   [Tips: för att avlägsna eventuell kvarvarande tvättbuffert efter tvättsteg, plattan tappas - kraftigt - på pappershanddukar]

   3. Avlägsna den blockerande lösningen med en smart flick av plattan över en vask och tillsätt 100 pl normaliserade biotinylerad monomert bete till lämpliga brunnar och inkubera under 1 timme vid rumstemperatur.
   4. Ta bort betet prover från plattan genom upturning plattan och smart snärta över en diskho, och tvätta 3 gånger i PBST.
   5. Tillsätt 100 pl av den normaliserade pentamerized byte konstruera till varje brunn och inkubera vid rumstemperatur under 1 timme, tvättas såsom i steg 4,4 och utför en slutlig tvätt med PBS enbart.
   6. Tillsätt 60 pl 242 M nitrocefin lösning (lös 5 mg nitrocefin i 500 pl DMSO, blanda noggrant och sedan vidare späd nitrocefin i 40 ml PBS och passerar genom ett 0,22 M filter innan du lägger på plattorna) och inkubera vid rumstemperatur . Positiva interaktioner kan observerasmed ögat eftersom den gula nitrocefin hydrolyseras till en röd färg. Kvantifiera genom avläsning av absorbansen vid 485 nm med användning av en plattläsare. En typisk platta och kvantifiering visas i fig.. 4.

   [Tips: Positiva interaktioner vanligen inom 2 timmar vid rumstemperatur, även plattorna bör placeras vid 4 ° C under 16 timmar för att se till att alla möjliga interaktioner upptäcks. Vi har också funnit att utfälld nitrocefin och brister på plasten i mikrotiterplattan som repor / fingeravtryck ibland kan leda till artefactual falska positiva vid 485 nm trots att ingen uppenbar nitrocefin hydrolys. Det är därför lämpligt att ta fotografier av plattorna för att visuellt registrera nitrocefin omsättningen i brunnarna.]

   5. Representativa resultat

   Ett exempel på en representativ AVEXIS skärmplåt visas i figur 4. Man bör observera hydrolys (gul till röd) i nitrocefin substrat iPositiva kontrollbrunnar (både antikropp-medierad byte infångning kontroll och även positiv kontroll interaktion) inom ca tio minuter. Vissa interaktioner inom skärmen observeras också inom denna tidsperiod, men andra kan ta längre tid (några timmar) ska visas. Normalt är en hit-rate på cirka 0,4-0,6% (en positiv växelverkan för varje 150-250 interaktioner som kontrolleras) typisk, beroende på vilka proteiner biblioteken som kontrolleras.

   
   Figur 1. Identifiering av receptor-ligand interaktioner medierar cellulära erkännande processer med hjälp av AVEXIS. Den schematiska visar två samverkande celler (A och B) utbyta information genom interaktioner som görs mellan membran-inbäddade receptor proteiner. AVEXIS är en skalbar proteininteraktion analysera specifikt utformade för att identifiera nya receptor-ligandpar, vilka kännetecknas av mycket svag interaktion styrkor. Rekombinant såluble proteinbibliotek representerar hela ektodomän av cellytreceptorn repertoar av båda cellerna är sammanställda antingen som pentamera β-laktamas-märkta bytesorganismer (celltyp A) eller monomera biotin-märkta beten (för celltyp B). Den pentamerisation av bytesorganismer ökar den lokala koncentrationen av de ektodomäner att åstadkomma en total aviditet förstärkningen, så att även mycket transienta interaktioner kan detekteras. Betet biblioteket anordnade på streptavidinbelagda plattor och systematiskt sonderas för interaktioner med bytet proteiner. Efter en kort tvätt är några tagna bytesdjur påvisas med hjälp av β-laktamasaktivitet i samband med bytet.

   
   Figur 2. Bete och bytesdjur konstruktion design. (A) Råttan CD200 receptorproteinet tillhandahålls som ett exempel på hur hela ektodomäner av cellyteproteiner proteiner bestäms och primers är utformade för att göra både beteoch byten expressionskonstruktioner. CDNA: t och translaterade proteinsekvensen visas från den N-terminala signalpeptiden till den membranomspännande transmembran region av rått-CD200. En sensprimer är utformad för att innefatta en 5 'Notl-restriktionsenzymställe och optimal Kozak-sekvens följt av 25 baser av exakt matchning sekvens till CD200-cDNA-sekvensen. Antisense-primer innehåller en Ascl plats och 25 baser av exakt matchning sekvens belägen omedelbart uppströms om den valda ektodomänen trunkering återstod. För att hålla ektodomänen i ram med rått Cd4d3 4 tagg bör Ascl platsen översätta såsom Gly-Ala-Pro. (B) visar schematiska återgivningar av betes-och rov konstruktioner expressionssystem. Varje innehåller receptor ektodomäner flankerade av NotI och Ascl platser och en Cd4d3 4 tag. Betet innehåller en C-terminal peptid-sekvens som kan specifikt monobiotinylated genom samtransfektion med en plasmid som uttrycker en utsöndrad BirA-enzymet. De bytesorganismer följs av sekvensen pentamerisationfrån brosk oligomera matrixprotein (COMP) och β-laktamas-enzym.

   
   Figur 3. Normalisering av betet och proteiner byte. (A) Representativa exempel på bete normalisering. En spädningsserie av fyra olika dialyserade beten supernatanterna detekterades genom ELISA med användning av en anti-CD4-tagg monoklonal antikropp. De fyra beten uttrycks på olika nivåer 1> 2> 3> 4. Beten ska normaliseras till en tröskelnivå som mättar biotinbindande ställen i varje brunn. Höguttryckt beten kan spädas till att bevara proteinet (t.ex. bete 1 kunde spädas ~ 1:100), och dåligt uttryckta beten koncentrerades. Minskade värden vid låga spädningar ibland observeras i vissa beten (t.ex. bete 2) som är hänförlig till närvaron av okonjugerat D-biotin på grund av ofullständig dialys. (B) De nivåer där livnär proteiner expressad kvantifieras med användning av hydrolyshastigheten för en β-laktamassubstrat, nitrocefin. I det visade exemplet är de tre byten uttryckte på olika nivåer: bytesdjur 1> 2> 3. Bytesdjur bör normaliseras till en aktivitet av ~ 2 nmol min ^-1, vilket motsvarar att slutföra hydrolys av 14,5 nmol nitrocefin i ~ 7 minuter (t.ex. bytesdjur 1). De andra bytesdjur i detta exempel bör koncentreras före användning vid screening.

   
   Figur 4. Representativa AVEXIS screening resultat. (A) Ett fotografi av en företrädare AVEXIS screening plattan. Ett offer protein undersöks mot 41 olika beten och en positiv interaktion upptäcks i väl E2. Kontroller som används i screening plattorna är: en biotinylerad anti-CD4-antikropp för att fånga hela bytet proteinet till brunnen (G6), en kontroll interaktion: råtta CD200 (bete)-Cd200R (byte) med Cd200R bytesdjur används vid tröskeln spädning (H3), 1:10 (H4) och 1:100 (H5). Negativa kontroller var: en Cd4d3 4 bete sonderades med bytesprotein som screenas (H1) och den Cd200R byte (H2). (B) Kvantifiering av absorbansvärdena för samma skärm utfördes i triplikat. Datapunkterna är medelvärden ± SD.

Discussion

När levande celler observeras in vivo, deras plasmamembran uppvisar mycket dynamiska beteenden: utskjutbar processer membran som de kontakta och kommunicera med sina grannar ^2. De fysikaliska interaktioner mellan de membranbundna inbäddade receptorproteiner som medierar många av dessa kontakter har utvecklats till att vara extremt svag för att medge denna mycket rörligt beteende. Man har uppskattat att monomera samspelet styrkor som svag som 50 M kan vara tillräckligt för att driva spontana interaktioner vid fysiologiska receptor densiteter ⁹ vilket gör att upptäcka nya interaktioner extremt utmanande ^2,10. Den AVEXIS här beskrivna metoden ger en känslig metod för detektion av övergående extracellulärt protein: protein-interaktioner som kan genomföras på ett skalbart sätt med en låg falskt positivt takt. Medan andra skalbara metoder har utvecklats för att upptäcka extracellulära interaktioner ^11-15,En fördel med AVEXIS är att de experimentella parametrar såsom betet och aktiviteter rov har beräknats att upptäcka även den svagaste av interaktioner (t _1/2 ≤ 0,1 s) med bibehållen låg falskt positivt ränta ^3. Dessutom har de strömlinjeformade och robusta provberedningsförfaranden möjligt denna analys skall genomföras på ett mycket större skala än andra analyser och vi har nyligen beskrivit en systematisk samverkan skärm sammanlagt över ~~~HEAD=NNS 16.500 möjliga interaktioner ^16.

Analysen kan utföras på vilket protein som helst för vilken det är möjligt att uttrycka ett lösligt rekombinant protein fragmentet. Detta innefattar således proteiner som innehåller en N-terminal signalpeptid, såsom typ I, GPI-länkade och utsöndrade proteiner. Vi har nyligen utvecklat en serie av vektorer som nu gör att vi kan uttrycka typ II proteiner som lockbete ^17. Analysen är i allmänhet inte lämplig för proteiner multipass membran såsom jon transportörs eller pumpar eftersom de är osannolikt att vara korrekt vikas utanför ramen för ett plasmamembran. Vi har tillämpat denna på en mängd olika system och har framgångsrikt uttryckts extracellulära proteiner från zebrafisk ^3,16,18, människa, mus och P. falciparum för interaktion skärmar.

När det gäller de resurser som krävs för att inrätta ett AVEXIS skärm, har vi funnit att en betydande flaskhals är valet, konstruktion och full sekvensering av uttrycksplasmider. Denna aspekt av metoden kan ta upp till ett år för att göra ~ 100 bete och konstruktioner bytesdjur, men med minskande kostnader för gensyntes vi nu föredrar kommersiellt outsourcing denna aspekt av projektet. Det däggdjursexpressionssystem tillsammans med ett stort skakning vävnadsodlingsinkubator (vi använder en INFORS HT Multitron Cell) gör en enda forskare att uttrycka och normalisera upp till ca 100 bete och proteiner rov en månad. När väl de proteiner produceras och normaliseras, screening för interaktioner är snabb med upp till tolv 96-brunnars plattor som lämpligen beredas per dag. Den enda skräddarsydd utrustning som vi har utvecklat för att underlätta produktionen av ett så stort antal proteiner är en tryckluftsdriven kolv som används för att skicka upp till fem supernatanter genom ett 0,22-filter parallellt.

Den största klassen av interaktioner som kan missas jämfört med interaktioner förväntas från litteraturen (falska negativa) är homofila interaktioner, även om vissa av dessa interaktioner kan upptäckas ^3. I de fall där den förväntade interaktioner inte detekteras, tror vi att detta beror på bildningen av homofila interaktioner från de bytesproteinerna (en byte "maskerande"-effekt), som sedan förhindrar ytterligare interaktioner med immobiliserade betesproteiner. Den frekvens vid vilken interaktioner detekteras beror på innehållet av proteinet bibliotek som screenas. Som en vägledning för läsaren, en skärm av> 30000 interaktioner inom zebrafisk immunoglobulinsuperfamiljen resulterade i 188 positiva - en frekvens på 0,6% ^3,16,18. En mycket snabb kontroll som kan utföras för att verifiera alla positiva träffar är att bestämma om interaktionen kan detekteras i båda bete-rov orienteringar; som kan samma interaktion detekteras oberoende av om de bindande proteinerna är närvarande som antingen ett bete eller ett byte. När vi har observerat detta fram och tillbaka beteende har bindningen därefter visat sig vara specifik genom att visa direkt mättnadsbar bindning av renade proteiner med hjälp av ytplasmonresonans. Det bör understrykas att eftersom vi ökar bindningsförmågan genom att artificiellt pentamerising bytet proteinerna vi inte anser att analysen lämpar sig för kvantitativ jämförelse interaktion styrkor. För att få biofysiska bindande parametrar interaktioner vi använder monomera proteiner och ytplasmonresonans. Slutligen, när en interaktion har identifierats, hiGH genomströmning analysens natur gör det relativt enkelt att anpassa analys för att screena för reagens, såsom antikroppar eller små molekyler som blockerar interaktionen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Freestyle media	Invitrogen	12338018
Nitrocefin	Calbiochem	484400
SA-coated microtitre plates	Nalge Nunc international	734-1284
OX68 antibody	AbD Serotec	MCA1022R
Dialysis tubing	Pierce, Thermo Scientific	PN68100
Polymyxin B	Sigma-Aldrich	P4932
D-biotin	Sigma-Aldrich	B4639-5G
Substrate-104	Sigma-Aldrich	1040-506
Vivaspin-20 centrifugal concentrators	Sartorius AG	VS2002
0.22 μm filters	Nalge Nunc international	190-2520