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Bioengineering

मल्टी वर्णक्रमीय इमेजिंग फ्लो द्वारा नैनोकणों और जीवाणु के सेलुलर internalization का विश्लेषण

doi: 10.3791/3884 Published: June 8, 2012

Summary

इस अनुच्छेद में, हम एक बहु - वर्णक्रमीय इमेजिंग प्रवाह cytometry का उपयोग करने के लिए रॉ 264.7 कोशिकाओं द्वारा polyanhydride नैनोकणों या बैक्टीरिया के internalization यों विधि का वर्णन.

Abstract

Nanoparticulate सिस्टम वैक्सीन वितरण में मूल्यवान उपकरण के रूप में उभरा है प्रतिजन पेश 1-5 कोशिकाओं उनके कुशलतापूर्वक प्रोटीन सहित माल देने की क्षमता के माध्यम से,. नैनोकणों के प्रतिजन कोशिकाओं द्वारा internalization (एन पी) एक प्रभावी समझाया प्रतिजन के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पैदा करने में एक महत्वपूर्ण कदम है. Nanoparticle निर्माण प्रभाव समारोह में कैसे परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए, हम एक उच्च throughput, मात्रात्मक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल है कि के रूप में अच्छी तरह से भली भाँति नैनोकणों बैक्टीरिया का पता लगाने के साथ संगत था विकसित करने की मांग की. तिथि करने के लिए, दो स्वतंत्र तकनीक, माइक्रोस्कोपी और प्रवाह cytometry, नैनोकणों के phagocytosis अध्ययन तरीकों का इस्तेमाल किया गया है. प्रवाह cytometry के उच्च throughput प्रकृति मजबूत सांख्यिकीय डेटा उत्पन्न करता है. हालांकि, कम संकल्प के कारण, यह करने के लिए सही सेल बाध्य नैनोकणों बनाम भाँति यों विफल रहता है. माइक्रोस्कोपी उच्च स्थानिक संकल्प के साथ छवियों को उत्पन्न करता है, जowever, यह समय लगता है और छोटा सा नमूना आकार 6-8 शामिल है. बहु - वर्णक्रमीय इमेजिंग प्रवाह cytometry (MIFC) एक नई तकनीक है कि दोनों माइक्रोस्कोपी और प्रवाह cytometry है कि एक लामिना कोर के माध्यम से बहु रंग वर्णक्रमीय प्रतिदीप्ति और चमकीले क्षेत्र इमेजिंग के साथ प्रदर्शन के पहलुओं को शामिल किया है. यह फ्लोरोसेंट संकेत तीव्रता और विभिन्न संरचनाओं और उच्च गति में सेलुलर सुविधाओं के बीच स्थानिक रिश्तों की एक सटीक विश्लेषण की क्षमता प्रदान करता है.

इस के साथ साथ, हम एक MIFC उपयोग करने के लिए सेल आबादियों कि polyanhydride नैनोकणों या साल्मोनेला enterica serovar ताकि के भाँति विशेषताएँ विधि का वर्णन करता है. हम भी nanoparticle के निलंबन, सेल लेबलिंग, एक ImageStream एक्स सिस्टम पर अधिग्रहण और डेटा का विश्लेषण और विचारों का आवेदन का उपयोग करने की तैयारी का वर्णन. हम भी internalization के पी अंतर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है एक तकनीक के आवेदन का प्रदर्शननैनोकणों और बैक्टीरिया के लिए actin की मध्यस्थता phagocytosis की एक अवरोध करनेवाला के रूप में cytochalasin डी का उपयोग करके athways.

Protocol

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1. रॉ 264.7 सेल संस्कृति

  1. हार्वेस्ट उनके बोतल से रॉ 264.7 कोशिकाओं जब वे उन्हें एक सेल खुरचनी के साथ धीरे scraping द्वारा confluency तक पहुँचने. 10% गर्मी - निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय (FBS) सीरम, 2 मिमी Glutamax,, और 5 x 10 5 कोशिकाओं की एक घनत्व / अच्छी तरह से 0.5 एमएल पूर्ण है Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (cDMEM में एक सेल 24 - अच्छी तरह से संस्कृति डिश में उन्हें प्लेट गणना और 10 मिमी) HEPES और 37 ° C पर एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में रातोंरात सेते हैं.

2. रोगजनक साल्मोनेला enterica Serovar ताकि 14,028 परिवर्तन और संस्कृति

  1. पुनः संयोजक एस के लिए हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) व्यक्त प्लास्मिड का परिचय. Electroporation द्वारा typhimurium. सबसे पहले, लेग शोरबा में साल्मोनेला enterica serovar ताकि (14,028 ATCC) की संस्कृति को तैयार है और 37 ° C पर वातन के साथ रात भर सेते हैं.
  2. अगले दिन, गोली microcentrifuge में अधिकतम गति में 1 जीवाणुओं की एमएल. कोशिकाओं के लिए धोधीरे प्रत्येक 9 धोने के बीच एक विंदुक के साथ गोली resuspending ठंड MOPS / ग्लिसरॉल समाधान के 1 ((एन morpholino) के 20% ग्लिसरॉल में propanesulfonic एसिड बफर (MOPS) 1 3 मिमी) एमएल के साथ उर बार. अंतिम धोने के बाद, MOPS / ग्लिसरॉल में pAKgfp1 या pAKgfplux1 प्लास्मिड डीएनए के 0.5 μg ~~ 10 जोड़ा गया 50 μL में है गोली resuspend.
  3. एक पूर्व - ठंडा 1 मिमी अंतराल के electroporation क्युवेट स्थानांतरण सेल निलंबन और सेटिंग्स का उपयोग कर electroporate: 1800 वी, 200 डब्ल्यू, 25 एमएफ. नाड़ी प्रसव के तुरंत बाद, की लेग शोरबा 1 एमएल जोड़ने और एक नया 15 एमएल ट्यूब के सेल निलंबन हस्तांतरण. कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर वातन साथ ठीक करने के लिए अनुमति देते हैं. एक घंटे के बाद, और शेष सतह पर तैरनेवाला के ~ 100 μL में centrifugation resuspend द्वारा कोशिकाओं ध्यान केंद्रित.
  4. अंत में, थाली लेग 100 μg / एमएल एम्पीसिलीन और 37 पर रातोंरात सेते हैं युक्त प्लेटों पर कोशिकाओं डिग्री सेल्सियस एकल कालोनियों से एंटीबायोटिक और GFP मैं के चयन अभिव्यक्ति के साथ restreaking द्वारा शुद्ध कर रहे हैंएक मानक fluorescein (FITC) आइसोथियोसाइनेट फ़िल्टर सेट के साथ रोशनी द्वारा की पुष्टि की.
  5. लेग साल्मोनेला के एक loopful कि को स्थिरतापूर्वक व्यक्त GFP के लिए बदल दिया गया है साथ में 25 μg / एमएल एम्पीसिलीन (या उचित एंटीबायोटिक) युक्त शोरबा के 10 एमएल टीका लगाना.
  6. बैक्टीरिया 37 पर रातोंरात आगे बढ़ें डिग्री सेल्सियस
  7. एक ताजा संस्कृति 10 एमएल 37 में एम्पीसिलीन और 5 घंटे के लिए सेते हैं के साथ पूरक लेग डिग्री सेल्सियस युक्त ट्यूब में साल्मोनेला 1:10 पतला
  8. 600 एनएम संस्कृति के absorbance के उपाय है और एक पहले से वृद्धि वक्र की स्थापना का उपयोग एमएल प्रति साल्मोनेला की एकाग्रता की गणना.
  9. पतला cDMEM (0.5 एमएल अच्छी तरह /) में साल्मोनेला संक्रमण के एक (MOI), 100 रॉ 264.7 सेल प्रति के बहुलता प्राप्त करने के लिए.

3. Nanoparticle सस्पेंशन की तैयारी

  1. 1% FITC भरी हुई नैनोकणों के रूप में पहले 11 में वर्णित बनाना. संक्षेप में, कणों polyanhydride द्वारा निर्मित कर रहे हैंविरोधी विलायक nanoencapsulation के, जिसमें बहुलक क्लोराइड में भंग कर रहा है (4 ° सी 25 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता में) और pentane (-30 ° अनुपात 1:200 क्लोराइड सी: पैंटेन के) में उपजी. निर्वात निस्पंदन द्वारा नैनोकणों पुनर्प्राप्त. किसी भी अवशिष्ट विलायक वाष्पन के बाद, सूखे polyanhydride वजन का उपयोग निष्फल कागज वजन नैनोकणों.
  2. ठंड फॉस्फेट के 0.5 एमएल नैनोकणों के 5 मिलीग्राम जोड़ें खारा बफर (पीबीएस कैल्शियम, मैग्नीशियम और मुक्त, पीएच 7.4) और एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में यह बर्फ पर रख जब तक नैनोकणों रॉ 264.7 कोशिकाओं को जोड़ रहे हैं.
  3. Nanoparticle (जबकि बर्फ पर रख) निलंबन एक अल्ट्रासोनिक तरल 4 से 6 joules में लगभग 25 के लिए एक microtip के साथ फिट प्रोसेसर का उपयोग Sonicate.

4. Phagocytosis परख

  1. 5 μg / एमएल cytochalasin डी 1 घंटे पहले एनपी या साल्मोनेला की शुरूआत के साथ मध्यम और repl aspirating रॉ 264.7 कोशिकाओं की एक सबसेट Pretreat केताजा अवरोध करनेवाला के साथ पूरक cDMEM साथ acing. 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर संस्कृतियों लौटें.
  2. अवरोध करनेवाला के साथ 1 घंटे ऊष्मायन के बाद, इनक्यूबेटर से प्लेटें हटाने के nanoparticle के निलंबन भंवर, और उचित कुओं को 10 μL जोड़ने के.
  3. साल्मोनेला भंवर और उचित कुओं बैक्टीरिया को जोड़कर 100 के MOI के साथ रॉ 264.7 कोशिकाओं को संक्रमित.
  4. थाली कुछ समय नल मिश्रण करने के लिए और 37 पर सेते हैं ° सी या 4 ° C से 45 मिनट के लिए (नियंत्रण).
  5. इनक्यूबेटर या रेफ्रिजरेटर और बर्फ पर जगह से प्लेट निकालें. कोशिकाओं बर्फ ठंड पीबीएस के साथ दो बार धो (2 सीए के बिना और मिलीग्राम 2) aspirating और पुराने अपार कणों, साल्मोनेला, और मर चुका है या अलग रॉ 264.7 कोशिकाओं को हटाने के माध्यम discarding के द्वारा.
  6. दूसरे धोने के बाद रॉ 264.7 कोशिकाओं फसल, बहुत ठंडा पीबीएस 250 μL जोड़ने और धीरे कुओं परिमार्जन.
  7. स्पष्ट दृष्टिकोण तस्वीर टोपी सूक्ष्म में काटा कोशिकाओं pipetअपकेंद्रित्र ट्यूबों और उन्हें बर्फ पर रख.
  8. X 250 जी में 4 बजे 10 मिनट के लिए ठंडे धो बफर के 1 एमएल (2% गर्मी निष्क्रिय FBS, पीबीएस में 0.1% सोडियम azide) और अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस जोड़ने के द्वारा कोशिकाओं धो
  9. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और कागज तौलिया पर औंधा microcentrifuge के ट्यूब दोहन द्वारा अवशिष्ट बफर को हटा दें. धीरे से एक टेस्ट ट्यूब रैक पार microcentrifuge ट्यूब raking के द्वारा सेल गोली Resuspend.
  10. पीबीएस में (पीएफए) 4% paraformaldehyde के 100 μL जोड़ने और कोशिकाओं को कमरे के तापमान (आर टी) पर 15 मिनट के लिए खड़े करने की अनुमति द्वारा रॉ 264.7 कोशिकाओं को ठीक करें.
  11. X 250 जी में 4 बजे 10 मिनट के लिए पेर्म / धो बफर के 1 एमएल (बी.डी. बायोसाइंसेज) और अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस जोड़ने रॉ 264.7 कोशिकाओं धोयें.
  12. 4.9 कदम दोहराएँ.
  13. आर टी पर 15 मिनट के लिए, पेर्म / एलेक्सा Fluor phalloidin 660 (1:150 कमजोर पड़ने 660 वायुसेना) युक्त धो बफर के 100 μl जोड़कर actin के लिए कच्चे 264.7 कोशिकाओं दाग. 4.11 और 4.12 चरणों को दोहराएँ.
  14. रॉ के 50 μL में 264.7 कोशिकाओं Resuspendपीबीएस अधिग्रहण 1% पीएफए ​​और उन्हें अंधेरे में 4 बजे दुकान डिग्री सेल्सियस तक युक्त.

युक्तियाँ और नोट्स:

  • एकल रंग प्रतिदीप्ति नमूने के इस कदम पर तैयार मुआवजा नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा जबकि ImageStream एक्स साधन स्थापित किया जाना चाहिए. , रॉ 264.7 कोशिकाओं (actin के लिए लेबल नहीं) के को साल्मोनेला साथ incubated, actin केवल लेबल रॉ 264.7 कोशिकाओं रॉ 264.7 कोशिकाओं (actin के लिए लेबल नहीं) नैनोकणों के साथ incubated: मुआवजा इस प्रयोग में शामिल थे नियंत्रण.
  • अवरोध करनेवाला के अध्ययन के लिए, यह महत्वपूर्ण है करने के लिए वाहन नियंत्रण में जो अवरोध करनेवाला एक नियंत्रण के रूप में भंग कर दिया गया था शामिल हैं. इस प्रयोग में, cytochalasin - डी 100% DMSO में भंग कर दिया गया था. हम, इसलिए, cDMEM युक्त DMSO में और फिर incubated कोशिकाओं नैनोकणों या साल्मोनेला के internalization का मूल्यांकन. हम मध्यम समूह और DMSO के नियंत्रण (नहीं दिखाया डेटा) के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर का पता नहीं लगा था.
  • एकmple तैयारी Amnis वेबसाइट (पर उपलब्ध गाइड https://www.amnis.com/images/1__Sample_Prep_Guide_3L_-_0418081.pdf ) ImageStream एक्स के साथ fluorophores की संगतता की जाँच के लिए एक अच्छा स्रोत है. इस दस्तावेज़ तक पहुँच करने के लिए, उपयोगकर्ताओं को पहले में एमिस साथ (मुक्त के प्रभारी) रजिस्टर करना होगा.

5. ImageStream एक्स पर नमूना अधिग्रहण

  1. ImageStream एक्स और लांच को बिजली प्रेरित करते हैं.
  2. Fluidics इनिशियलाइज़. इस स्क्रिप्ट SpeedBeads के अंत में चल रहा होना चाहिए.
  3. फ़ाइल मेनू में, डिफ़ॉल्ट टेम्पलेट लोड करने के लिए चुन.
  4. छवि गैलरी दृश्य मेनू में, सभी का चयन करें और प्रेस भागो सेटअप मोती इमेजिंग शुरू.
  5. कोर केन्द्र laterally छवियाँ (यदि आवश्यक) ट्रैकिंग समायोजित करें.
  6. Brightfield चैनल (बीएफ) का चयन करें और सेट तीव्रता क्लिक करें.
  7. रुको जब तक प्रवाह स्पीड CV लगातार है ले0.2% की तुलना में एस एस.
  8. दैनिक साधन जांचना. सहायता टैब में सभी शुरू करने के लिए calibrations और परीक्षण चलाने के लिए क्लिक करें और सत्यापित करें कि सभी पारित किया है.
  9. पहला नमूना लोड प्रेस लोगों को लॉक और लोड (FLL). प्रयोग है कि प्रत्येक fluorochrome साथ fluoresces में प्रतिभाशाली नमूना लोड. यह महत्वपूर्ण है कि आप पहले इस नमूने को चलाने के लिए साधन सेटिंग्स की स्थापना की और फिर पूरे प्रयोग के लिए उन्हें बदल नहीं है.
  10. प्रत्येक प्रयोग में इस्तेमाल किया लेजर पर बारी और लेजर पावर सेट तो प्रत्येक fluorochrome अधिकतम पिक्सेल मूल्यों के बीच 100 और 4000 मायने रखता है, के रूप में बिखराव भूखंडों में मापा है.
  11. सेल वर्गीकरण मापदंड सेट, अवांछित वस्तुओं का संग्रह को समाप्त. केवल कक्षों से डेटा एकत्रित करने के लिए, बीएफ चैनल में 50 माइक्रोन के लिए क्षेत्र लोअर सीमा का चयन करें. 50 माइक्रोन से कम क्षेत्र के साथ ऑब्जेक्ट्स का मलबा माना जाएगा और हासिल नहीं किया जाएगा. चैनलों का चयन करने के लिए एकत्र किया है.
  12. फ़ाइल का नाम दर्ज करें, गंतव्य फ़ोल्डर सेट अनुक्रम# 1 और अधिग्रहण घटनाक्रम की संख्या.
  13. क्लिक करें चलाने के लिए इकट्ठा करने और पहले प्रयोग डेटा फ़ाइल को बचाने के मोल.
  14. FLL क्लिक करें और अगले प्रयोगात्मक नमूना चलाते हैं. दोहराएँ जब तक सभी प्रयोगात्मक नमूने एकत्र किया गया है.
  15. इस COMP सेटिंग्स (brightfield और तितर बितर लेजर बंद मुड़ता है और सभी चैनलों के संग्रह में सक्षम बनाता है) क्लिक करें और मुआवजा मैट्रिक्स विकसित करने के लिए प्रयोग में 500 प्रत्येक fluorophore के लिए प्रत्येक एकल दाग नमूना से सकारात्मक कोशिकाओं को इकट्ठा.

संक्षेप में प्रस्तुत करने के लिए, नमूने निम्न क्रम में चलाया जा सकता है:

  • प्रतिभाशाली पहला नमूना.
  • शेष परीक्षण के नमूने.
  • मुआवजा एकल रंग प्रतिदीप्ति युक्त नियंत्रण है.

युक्तियाँ और नोट्स:

  • एक प्रेरित टेम्पलेट और बचाया जा सकता साधन सेटिंग्स निर्धारित करने के लिए पुनः लोड. एक बार टेम्पलेट्स बच रहे हैं, autosampler नायाब आपरेशन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है एक टेम्पलेट और सह के साथ प्रयोगात्मक नमूने को चलानेmpensation प्रत्येक एकल रंग नियंत्रण के लिए एक टेम्पलेट के साथ नियंत्रण है.
  • ImageStream एक्स इन प्रयोगों के लिए विन्यास: 488 और 658 एनएम उत्तेजना लेज़रों, 785 एनएम तितर बितर लेजर, 40X (0.75 एनए) उद्देश्य, 6 चैनल के साथ एक मानक ISX फिल्टर ढेर प्रणाली. autosampler विकल्प नायाब नमूनों का अधिग्रहण करने की अनुमति के लिए इस्तेमाल किया गया था.
  • निम्नलिखित सेटिंग्स के प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया गया. नैनोकणों 488 एनएम लेजर 10mW के लिए सेट के साथ imaged थे, 658 एनएम लेजर 50 मेगावाट करने के लिए सेट, 785 एनएम लेजर 1 चैनल में 2 मेगावाट और बीएफ सेट साल्मोनेला संक्रमित कोशिकाओं 488 एनएम लेजर 20 मेगावाट करने के लिए सेट के साथ imaged किया गया. 658 एनएम लेजर 50 मेगावाट करने के लिए सेट, 785 एनएम लेजर 1 चैनल में 2 मेगावाट, और बीएफ करने के लिए सेट. मुआवजा नियंत्रण के बीएफ और 785 के अभाव में एकत्र किए गए. कम से कम 5000 की घटनाओं (यानी, सेल) प्रत्येक नमूने परीक्षण के लिए imaged थे.

6. छवि विश्लेषण

  1. विचारों को लांच और internalization विज़ार्ड और पर लोड पर डबल - क्लिक करेंनमूने के परीक्षण ई राइफल्स फाइलें.
  2. चरण 2 में नई मैट्रिक्स 'पर क्लिक करके मुआवजा मैट्रिक्स बनाएँ. मुआवजा जादूगर शुरू की है. प्रयोग में एकल रंग नियंत्रण के लिए फ़ाइलें जोड़ें. निर्देशों का पालन विज़ार्ड के माध्यम से क्लिक करें जब तक मुआवजा मैट्रिक्स फ़ाइल को बचाया और internalization विज़ार्ड के चरण 2 में बॉक्स में लोड.
  3. अगला पर क्लिक करें और निर्देशों का पालन करें जब तक एक फ़ाइल daf. उत्पन्न होता है.
  4. छवि अधिग्रहण के दौरान इस्तेमाल चैनल का चयन करके छवि प्रदर्शन गुण सेट करें. 2 Ch (FITC) और Ch 5 (660 वायुसेना) पर क्लिक करें. (बीएफ और एसएससी डिफ़ॉल्ट चयनित कर रहे हैं).
  5. सेल (CH01) सीमा और चैनल है जो में नैनोकणों या बैक्टीरिया एकत्र किए गए थे (CH02) बनाने के लिए छवि चैनल का चयन करें.
  6. Brightfield क्षेत्र की एक Brightfield कोशिकाओं के सभी पहलू अनुपात बनाम तितर बितर भूखंड उत्पन्न होता है. व्यक्ति और singlets के आसपास और डॉट्स gating पर क्लिक करके एक सेल की आबादी को परिभाषित करें. एकल कक्षों का एक पहलू अनुपात है1 दौर और चारों ओर दोहरी 0.5 (चित्र 1 ए) है.
  7. Brightfield ढाल रूट की एक हिस्टोग्राम मतलब brightfield छवि के वर्ग (RMS) उत्पन्न होता है और छवि गैलरी में जनसंख्या दृश्य चयनित बिन (चित्रा 1 बी) के लिए सेट कर दिया जाता है. डिब्बे पर क्लिक करें निर्धारित करने के लिए जहां सबसे अच्छा ध्यान में कोशिकाओं शुरू और फाटक ध्यान केंद्रित कोशिकाओं के लिए एक लाइन क्षेत्र आकर्षित. उच्च ढाल आरएमएस, बेहतर ध्यान केंद्रित. अगले कदम को छोड़ जब तक वहाँ अन्य दाग आप पर फाटक चाहते हैं.
  8. Y-अक्ष पर CH2 के x-अक्ष की तुलना में अधिकतम पिक्सेल पर एक 2 चैनल की तीव्रता के नए तितर बितर भूखंड (चित्रा 1C) उत्पन्न होता है. डॉट्स पर क्लिक करें और छवियों को देखने के लिए मदद से आप नैनोकणों या बैक्टीरिया के लिए सकारात्मक रहे हैं कोशिकाओं है कि आसपास के क्षेत्र आकर्षित.
  9. Internalization सुविधा का एक हिस्टोग्राम एक क्षेत्र है कि 0 में शुरू होता है, जो छवियाँ (चित्रा -1) देख कर समायोजित किया जाना चाहिए के साथ उत्पन्न होता है. Internalization सुविधा का एक अनुपात हैसेल के अंदर पूरे सेल की तीव्रता में तीव्रता. यह ऐसा है कि तीव्रता के आधे के बारे में 0 के एक मूल्य पर अंदर है बढ़ाया है. जादूगर के लिए एक मुखौटा है कि सेल छवि इनपुट चरण 5 से इस्तेमाल किया गया है कि कोशिका की सतह और 4 पिक्सल द्वारा इस घिस बनाकर अंदर नामित क्षेत्र बनाया गया है. नोट करें कि यह मुखौटा मैन्युअल रूप से अलग सेल जब आवश्यक प्रकार के लिए समायोजित किया जा सकता है. इस प्रयोग में, हम स्वयं पहले brightfield छवि पर एक वस्तु मुखौटा बनाने के द्वारा सुविधा समायोजित और 4 पिक्सल द्वारा इस घिस. Internalization सुविधा तो इस 4 पिक्सेल घिस वस्तु मुखौटा के आधार पर गणना की गई. यह सुविधा हमें भली भाँति कणों और बैक्टीरिया, सतह बाध्य कणों और बैक्टीरिया से जो मुखौटा सीमा के भीतर उनके प्रतिदीप्ति संकेत के बहुमत है, जो उनके मुखौटा सीमा (चित्रा 2) बाहर प्रतिदीप्ति संकेत के बहुमत है भेद करने के लिए अनुमति देता है.
  10. नई fea internalization के साथ एक नया हिस्टोग्राम बनाएँघिस वस्तु मुखौटा पर आधारित संरचना. भली भाँति कोशिकाओं पर फाटक चयनित बिन मोड में कल्पना को देखने के द्वारा एक क्षेत्र ड्रा. हमारे प्रयोगों में, हम 0.3 पर इस गेट सेट. 0.3 से कम एक अंक के साथ कोशिकाओं की सतह बाध्य कण कोशिकाओं सकारात्मक माना जाता था.
  11. अंत में, पृष्ठभूमि लेबल के साथ कोशिकाओं को खत्म करने के लिए और विशिष्ट भली भाँति नैनोकणों या बैक्टीरिया की पहचान, विचारों स्पॉट गणना सुविधा का इस्तेमाल किया गया था. स्पॉट गिनती एक विशेषता यह है कि जुड़े उपकरणों या एक छवि में छोटा सा मास्क की संख्या गिना जाता है. मुखौटा कार्य, स्पॉट पीक, और तीव्रता के लिए स्पॉट को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया गया. स्थान मुखौटा एक छवि है कि एक निर्दिष्ट उपयोगकर्ता त्रिज्या और स्थानीय पृष्ठभूमि के ऊपर सीमा में उज्ज्वल जानकारी पाता है, मुखौटा अलावा अलग - अलग स्थानों में 200 की गिनती के एक तीव्रता से ऊपर पीक तो और समारोह स्पॉट का उपयोग उच्च तीव्रता तोड़ने से परिष्कृत किया जाता है शामिल थे . अधिक जानकारी के लिए (चित्रा 1E) Amnis स्थान मास्किंग गाइड देखें. एक आँकड़े पुनः बंदरगाह टेम्पलेट रिपोर्ट मेनू में विभिन्न सुविधाओं सहित द्वारा उत्पन्न किया गया था.
  12. इस फ़ाइल को टेम्पलेट फ़ाइल के रूप में सभी प्रयोगात्मक फ़ाइलों के बैच विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए सहेजा गया था.
  13. विचारों सॉफ्टवेयर, उपकरण → बैच डेटा फ़ाइलें और इनपुट सब राइफल्स फ़ाइलें क्लिक करें. मुआवजा मैट्रिक्स (CTM है.) फ़ाइल और इसी वर्गों में टेम्पलेट फ़ाइल (ast.) जोड़ें. बैच प्रोसेसिंग के लिए जमा करें. प्रसंस्करण कदम के बाद, सभी राइफल्स फ़ाइलों का विश्लेषण कर रहे हैं और daf फ़ाइलें व्यक्तिगत कच्चे फ़ाइलों के प्रत्येक के लिए उत्पन्न कर रहे हैं. सभी नमूनों के लिए आँकड़े के साथ एक अंतिम रिपोर्ट फाइल उत्पन्न होता है.

युक्तियाँ और नोट्स:

  • छवि विश्लेषण विचारों सॉफ्टवेयर संस्करण 4.0 और कुछ संशोधनों के साथ internalization विज़ार्ड का उपयोग किया गया था. स्वयं शिक्षाप्रद विज़ार्ड है और ouptput daf. फ़ाइल विज़ार्ड के निर्देशों का पालन करके उत्पन्न किया जा सकता है.

7. प्रतिनिधि परिणाम

चित्रा 2 में प्रतिनिधि छवियों का प्रदर्शन है कि MIFC सफलतापूर्वक भली भाँति (बाएं पैनल) के बीच भेद किया जा सकता है बनाम सतह बाध्य (सही पैनल) (2A चित्र) एनपी या साल्मोनेला (चित्रा 2B) एनपी और साल्मोनेला की internalization द्वारा कम हो गई थी दोनों बाधा actin और तापमान 4 डिग्री सेल्सियस (चित्र 3A) के लिए कम है. 37 डिग्री सेल्सियस पर बाध्य सतह के लिए सकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिशत NP cytochalasin - डी या 4 डिग्री सेल्सियस उपचार के बाद लगभग 8% से 35% से अधिक वृद्धि हुई है ( 3B अंजीर) इसके विपरीत, सतह बाध्य साल्मोनेला के साथ कोशिकाओं के प्रतिशत 35% से 15% से cytochalasin डी उपचार के बाद कम हो गया था. 4 में साल्मोनेला के साथ रॉ 264.7 कोशिकाओं के ऊष्मायन डिग्री सेल्सियस की राशि में एक स्पष्ट वृद्धि के बिना internalization कम सतह जीवाणु बाध्य डिग्री सेल्सियस नियंत्रण 37 की तुलना में एक साथ, इन आंकड़ों है कि प्रदर्शन <उन्हें> साल्मोनेला और एनपी कि actin की आवश्यकता है और तापमान पर निर्भर है एक समान सेलुलर प्रक्रिया से भली भाँति रहे हैं. इसके अलावा, आंकड़ों से संकेत मिलता है है मैक्रोफेज साल्मोनेला की कि निरंतर लगाव actin के polymerization की आवश्यकता है.

चित्रा 1
आकृति 1. Gating के सतह बाध्य नैनोकणों और साल्मोनेला बनाम भाँति निर्धारित का उपयोग रणनीति की योजनाबद्ध (ए) एकल कक्षों के लिए विश्लेषण की सीमा, यह मलबे और बहु सेलुलर घटनाओं को समाप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है. एकल कक्षों और दोहरी के multicellular विचारों सुविधाओं क्षेत्र और brightfield छवि (M01) के पहलू अनुपात का उपयोग समुच्चय से अलग हो गए थे. दोहरी आम तौर पर aspe क्षेत्र, वर्ग microns और पहलू अनुपात में छवि का आकार लघु अक्ष प्रमुख धुरी और इसलिए घेरा (एक पूर्ण चक्र का एक पहलू अनुपात 1 के एक उपाय के द्वारा विभाजित हैचारों ओर की सीटी अनुपात 0.5 और multicellular समुच्चय आम तौर पर कर रहे हैं कम से कम 0.5). एक क्षेत्र एकल कक्ष की घटनाओं (6.6 चरण) पर फाटक के लिए तैयार किया गया था. (बी) को ध्यान में कोशिकाओं पर फाटक, विचारों की सुविधा brightfield छवि की ढाल RMS हिस्टोग्राम में साजिश रची है. ढाल आरएमएस सुविधा छवि में पिक्सेल मूल्यों के परिवर्तन का पता लगाने के द्वारा एक छवि के तीखेपन की गुणवत्ता के उपाय है. एक उच्च ढाल RMS मूल्य (6.7 चरण) एक और अधिक ध्यान केंद्रित छवि इंगित करता है. (सी) ग्रीन प्रतिदीप्ति सकारात्मक कोशिकाओं उच्च अधिकतम पिक्सेल मूल्यों और हरे रंग प्रतिदीप्ति चैनल (6.8 चरण) में तीव्रता के साथ कोशिकाओं पर gating के द्वारा चयन किया गया था. (डी) भली भाँति एनपी या साल्मोनेला के साथ कोशिकाओं internalization के बराबर या 0.3 से अधिक स्कोर के साथ सेल की आबादी को चुनने के द्वारा चयन किया गया था. एक 0.3 कम से स्कोर प्राप्त कोशिकाओं के सतह बाध्य (6.9 चरण) पर विचार किया गया. (ई) "भली" गेट में कोशिकाओं और स्पॉट की संख्या (एनपी या एसटीएम) वहाँ क्योंकि पर आधारित विशेषता थेई पृष्ठभूमि धुंधला साथ कुछ कोशिकाओं है कि भली भाँति के रूप में गिना गया थे, लेकिन शून्य (6.11 चरण) के एक स्थान मूल्य था. प्रत्येक गेट प्रतिनिधि छवियों के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2. भली भाँति और सतह बाध्य नैनोकणों (एनपी) या साल्मोनेला सेल छवियों. (ए) रॉ 264.7 कोशिकाओं है कि भली भाँति (बाएं पैनल) एनपी और कोशिकाओं एनपी जो उनकी सतह के लिए बाध्य थे, लेकिन भली भाँति (सही पैनल) के प्रतिनिधि चित्र. (बी) रॉ 264.7 कोशिकाओं है कि भली भाँति साल्मोनेला (बाईं पैनल) और कोशिकाओं उनकी सतह से साल्मोनेला जो करने के लिए बाध्य थे, लेकिन भली भाँति (सही पैनल) के प्रतिनिधि चित्र.

चित्रा 3
चित्रा 3. Cytochalaकोशिकाओं की पाप - डी उपचार एनपी और साल्मोनेला के internalization हिचकते हैं. (ए) cytochalasin - डी के साथ रॉ 264.7 कोशिकाओं के Pretreatment या 4 में ऊष्मायन डिग्री सेल्सियस एनपी या साल्मोनेला internalization की घटनाओं को कम के रूप में रॉ 264.7 मध्यम में 37 ° C पर incubated रहे कोशिकाओं की तुलना में. रॉ 264.7 DMSO के (यानी, वाहन नियंत्रण) युक्त मध्यम में incubated कोशिकाओं अकेले मध्यम (नहीं दिखाया डेटा) की तुलना में एनपी और साल्मोनेला के लिए इसी तरह की internalization के स्तर से पता चला है. (बी) Pretreatment cytochalasin डी के साथ रॉ 264.7 कोशिकाओं की सतह एनपी बाध्य जबकि सतह बाध्य साल्मोनेला के साथ कोशिकाओं के प्रतिशत में कमी के साथ कोशिकाओं के प्रतिशत की वृद्धि हुई.

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Discussion

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अध्ययनों से पता चला है कि biodegradable नैनोकणों पाली (लैक्टिक - सह - glycolic (PLGA) एसिड या polyanhydrides के आधार पर लक्ष्य कोशिकाओं को समझाया प्रतिजनों या दवाओं को वितरित किया जा सकता है इन नैनोकणों phagocytic कोशिकाओं द्वारा तेज उनकी प्रभावशीलता के लिए महत्वपूर्ण है, इस प्रकार मात्रात्मक बनाने. उपन्यास nanoparticle वितरण प्रणाली डिजाइन करने में महत्वपूर्ण internalization की इस पद्धति का उपयोग करके विश्लेषण, विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं द्वारा नैनोकणों के अंतर तेज आसानी से विश्लेषण किया जा सकता है तिथि करने के लिए, पारंपरिक माइक्रोस्कोपी और प्रवाह cytometry कण तेज बढ़ाता के लिए इस्तेमाल किया गया है, तथापि, अपने संबंधित उच्च throughput और internalization के अध्ययन के लिए वैकल्पिक तरीकों के लिए संकल्प कॉल के साथ सीमाओं. इस अनुच्छेद में, हम MIFC विशेषताएँ और तुलना कैसे phagocytosis की जैविक प्रक्रिया लक्ष्य एक जीवाणु रोगज़नक़ और सिंथेटिक नैनोकणों के दो प्रकार के बीच अलग विश्लेषण करते हैं.

MIFC phagocytosनैनोकणों के लिए साल्मोनेला की तुलना में तेज अंतर्निहित तंत्र में मतभेद चित्रित करना है परख इस्तेमाल किया गया था. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि inhibitors के साइटोटोक्सिक उनके ऊष्मायन समय और एकाग्रता के आधार पर कर सकते हैं, इसलिए एक पूर्व cytotoxicity रूपरेखा (यानी, जोखिम समय और एकाग्रता) उनके उपयोग 13,14 से पहले आवश्यक है. उनकी रासायनिक निर्माण पर निर्भर करता है, नैनोकणों एक गिलास संक्रमण तापमान (टीजी = 13 डिग्री सेल्सियस) आरटी नीचे हो सकता है, फलस्वरूप, वे आर टी 15 में समुच्चय के रूप में. एकत्रीकरण पर काबू पाने के लिए, हम कणों sonicated और उन्हें सेल संस्कृतियों के अलावा पूर्व बर्फ पर रखा. Nanoparticle तेज की गतिज अध्ययन प्रतिजन कोशिकाओं समझाया पेलोड उद्धार इन कणों की क्षमता पर महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करते हैं. देखभाल के लिए एक निश्चित समय बिंदु के अंत में बर्फ पर कोशिकाओं को रखने के लिए आगे सेलुलर प्रक्रियाओं को बाधित करने के लिए लिया जाना चाहिए. यह अंत करने के लिए, हम क्षुद्रकोष में परिवर्तनशीलता उल्लेख किया हैआर तेज जब कोशिकाओं को बर्फ पर नहीं रखा गया. ऊपर वर्णित विधि की एक सीमा है कि पक्षपाती कोशिकाओं है कि तकनीक स्क्रैप phagocytic कोशिकाओं फसल की आवश्यकता पर प्रयोग किया जाता है. इस प्रक्रिया कोशिका मृत्यु में परिणाम है, इस प्रकार डेटा विश्लेषण में कुछ त्रुटि शुरू हो सकता है. प्रक्रिया हम यहाँ का वर्णन भी कोशिकाओं है कि निलंबन में वृद्धि का उपयोग किया जा सकता है.

प्रतिक्रियाशील रंजक या immunolabeling अभिकर्मकों के साथ मैक्रोफेज की ऊष्मायन अवशिष्ट बफर वर्तमान निम्नलिखित निर्धारण की राशि को कम करने से अनुकूलित किया गया था. अवशिष्ट बफर की उपस्थिति एक कमजोर पड़ने प्रभाव बनाता है और नमूना नमूना परिवर्तन के लिए कई नमूने के बीच का उत्पादन कर सकते हैं, जिससे असंगत मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता मूल्यों में जिसके परिणामस्वरूप. नमूना एकाग्रता (यानी, / कोशिकाओं एमएल) भी अधिग्रहण के कदम के दौरान कमजोर लंबे समय तक चलाने के समय में नमूने के परिणाम के रूप में, पर विचार के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है. अलग के बीच तुलना मल्टी पैरामीट्रिकप्रयोगात्मक नमूने, यह लेजर तीव्रता को स्थिर रखने के लिए महत्वपूर्ण है.

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Disclosures

Sherree एल मित्र Amnis निगम, जो ImageStream एक्स प्रणाली विनिर्माण द्वारा नियोजित है.

Acknowledgments

लेखकों के लिए वित्तीय ONR - मूरी (NN00014-06-1-1176) पुरस्कार और अमेरिकी सेना चिकित्सा अनुसंधान और materiel कमान (अनुदान नंबर W81XWH-09-1-०३८६ और W81XWH-10-1-0806) शुक्रिया अदा करना चाहूँगा समर्थन.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RAW 264.7 cell line American Type Culture Collection (ATCC) TIB-71
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Cellgro 10-013-CV
Fetal bovine serum Atlanta Biologicals S 11150 Premium Grade
Glutamax GIBCO, by Life Technologies 35050-061
HEPES GIBCO, by Life Technologies 15630-080
24-well plate Techno Plastic Products 92024
Cell culture Flasks Techno Plastic Products 90151
Cell scraper Techno Plastic Products 99002 24 cm
Salmonella entericaserovar Typhimurium ATCC 14028
BTX ECM630 Electro Cell Manipulator BTX Technologies
MOPS Fisher Scientific BP308
Phosphate buffered saline (PBS) Cellgro 21-040-CV
Ultrasonic liquid processor Misonix S-4000
Cytochalasin-D Sigma-Aldrich, C8273
Formaldehyde Polysciences, Inc. 04018
Wash buffer 2% heat inactivated FBS, 0.1% sodium azide in PBS.
Perm/wash buffer BD Biosciences 554714
Clear-view snap cap microtubes Sigma-Aldrich T4816
Alexa Fluor phalloidin 660 Invitrogen A22285
ImageStreamX Amnis Corporation 100200 Options: 658nm laser, autosampler
Sodium azide Fisher Scientific S 227I-500

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References

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मल्टी वर्णक्रमीय इमेजिंग फ्लो द्वारा नैनोकणों और जीवाणु के सेलुलर internalization का विश्लेषण
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Phanse, Y., Ramer-Tait, A. E., Friend, S. L., Carrillo-Conde, B., Lueth, P., Oster, C. J., Phillips, G. J., Narasimhan, B., Wannemuehler, M. J., Bellaire, B. H. Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (64), e3884, doi:10.3791/3884 (2012).More

Phanse, Y., Ramer-Tait, A. E., Friend, S. L., Carrillo-Conde, B., Lueth, P., Oster, C. J., Phillips, G. J., Narasimhan, B., Wannemuehler, M. J., Bellaire, B. H. Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (64), e3884, doi:10.3791/3884 (2012).

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